Vankomycin - en kraftfull glykopeptidantibiotika www.chemicalbook.com Jenny Lundkvist Uppsala universitet HT 2014 Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling (3DN006)
Sammanfattning Människans största organ är våra inneboende bakterier. De hjälper oss att ta upp näringsämnen och skyddar oss från att bli sjuka. Vilka bakterietyper människan har beror på många faktorer och det många områden inom bakteriforskningen som ännu inte är lösta. Exempelvis vet man inte hur dessa bakterietyper kommunicerar mellan varandra. Normalt lever bakterierna ett harmlöst liv i symbios med vår normalflora. Men ibland utsätts vi för bakterieinfektionen som måste behandlas med antibiotika. Den frekventa användningen av antibiotika har lett till antibiotikaresistens, vilket räknas som ett globalt problem idag. Speciellt oroande är meticillin- och isoxaxolyl penicillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) och resistenta enterokocker. Dessa två bakteriestammar botas idag i förstahand av vankomycin, som är ett kraftfullt glykopeptidantibiotika. Vankomycin är ett antibotika som sjukvården har stor respekt för som används bara när det absolut måste och som följer särskilda smittåtgärden. Allt för att undvika resistensutveckling. Under de senaste årtiondena har dock en allt mer utbredning av vankomycinresistenta enterokocker (VRE) observerats. Vankomycinresistenta S.aureus (VRSA) har också observerats men är lyckligtvis fortfarande väldigt sällsynt. 2
INLEDNING 4 HISTORIAN OM VANKOMYCIN 4 VANKOMYCIN PRODUKTION 5 VANKOMYCINS MOLEKYLSTRUKTUR 6 VANKOMYCINS FARMAKODYNAMIK 8 VANKOMYCINS FARMAKOKINETIK 9 VANKOMYCINRESISTENS 10 VANKOMYCINS ANVÄNDNING OCH FRAMTIDSUTSIKTER 12 DISKUSSION 12 REFERENSLISTA 13 3
Inledning Bakterier är encelliga organismer med prokaryotisk cellstruktur. De lever i alla ekosystem här på jorden, även i oss människor. Människokroppen är ett hem för flera tusental olika bakterietyper. Vår kropp är uppbyggd av tio gånger fler bakterieceller än mänskliga celler. Lyckligtvis lever bakterierna vanligtvis i symbios med vår normalflora. Det var inte allt för länge sedan man såg bakterier som något dåligt, nu vet man bättre. Bakterierna är livsnödvändiga för vår överlevnad. Dom hjälper oss att ta upp näring från födan vi äter och gör så att immunförsvaret fungerar som det ska. Staphylococcus aureus (gula stafylokocker) är en av den vanligaste bakterietypen som finns i människans omgivning. Uppskattningsvis är 20 % av mänskliga befolkningen bärare av S.aureus som lever i slemhinnor, främst i näsan, och på huden (Patrick, 2013). En stor andel av icke-bärande blir även någon gång under sin livstid infekterad av bakterien. Vilket främst visar sig som variga sårinfektioner, men kan även ge livshotande infektioner på hjärtklaffarna (Läkemedelsboken, 2011). S.aureus infektioner behandlas med antibiotika inom klassen β- laktamerantibiotikum, däribland penicillin. När man hittade pencillinresistenta S.aureus togs det på största allvar. År 1950 startades ett projekt för att utveckla antibiotika för att övervinna kampen mot de motståndskraftiga bakterierna (Levine, 2014). Antibiotikan de fann var vankomycin. Historian om Vankomycin Eli Lilly är ett av världens största läkemedelsföretag (Lilly, 2014). På 1950-talet efter upptäckten av penicillinresistenta S.aureus startade Eli Lilly ett projekt med utgångspunkt i Indianapolis, USA. Målet med projektet var att utveckla antibiotika mot de penicillinresistenta S.aures. Projektets två huvudkaraktärer var Revered William Conley som under den tiden var missionär i Borneo och Eli Lillys organkemist dr. Edmund Carl Kornfeld. Den intressanta historian om vankomycins upptäckt startade med ett oskyldigt brev. Kornfeld skrev till Conley där man berättade om det nystartade projektet. Conley svarade på brevet med att skicka ett jordprov från Borneos djupa djungel för att hjälpa sin vän. Kornfield lyckades år 1952 isolera en okänd organism från detta prov. Det visade sig vara aktiniobakterien Streptomyces orientalis som kunde producera en substans, med benämningen 05865. In vitro studier visade att substansen var en ny typ antibiotika som hade baktericid verkan på de 4
resistenta S.aureus, men även andra grampositiva bakterier. Upptäckten var en fullträff och räknas än idag som en av de viktigaste milstolparna i Eli Lillys historia (Lilly, 2014). Ett av testerna som gjordes var att undersöka hur 05865 klarade av inducerad resistens jämfört med penicillin. Testerna visade en 100 000-faldig resistensutveckling hos penicillin men endast 4-8-faldig ökning för 05865. De goda bioaktiva resultaten avlöste varandra och in vivo testerna visade bra bioaktivitet hos 05865 och att den är säker att testas på människor. In vivo testerna godkändes och år 1955 startade de kliniska prövningarna (Levine, 2014). 05865 döptes först om till Mississippi mud, på grund av dess bruna färg den hade innan rening. Men fick sedan handlingsnamnet vankomycin, efter det engelska ordet vancoquish, som betyder besegra. Medan de kliniska prövningarna satte fart utvecklades två S.orientalis stammar för optimering av den nyfunna antibiotikan. Vankomycin blev år 1958 godkänd av USA:s food and drug administration (FDA) för behandling av penicillinresistenta S.aurerus och andra grampositiva bakterietyper. Vankomycin blev dock en kortvarig historia som förstahandsval, efter att toxiska biverkningar hade observerats framförallt i innerörat vid oral administration och skador på njurarna. Likartade antibiotikum utvecklades med lika effektiv bioaktivitet men med betydligt lindrigare biverkningar (DP, 2008). Isoxazolylpenicillin, tidigare meticillin, var en antibiotika som användes flitigt under mellan 60- och 70-talet. Användningen av vankomycin reserverades. Men efter tio års tystnad ökade intresset för vankomycin. Man började nämligen upptäcka en global spridning av meticillin- och isoxaxolyl penicillinresistenta S.aurerus (MRSA). Vankomycin togs upp på marknaden igen trots dess allvarliga risker. På 80-talet blev det klart att resistens mot vankomycin var möjlig och är nu mer aktuell än den var när den godkändes som antibiotika för över 50 år sedan (Levine, 2014) Vankomycin produktion Antibiotikum produceras av bakterier. Glykotidantibiotikum produceras naturligt av aktiobakterier. S.orientalis var den aktiniobakterien Kornfield fann år 1952 som visades producera vankomycin. Familjemedlemmen Amycolatopsis orientalis upptäcktes även den i 5
ett jordprov från Borneo. A.orientalis har en effektivare produktion av vankomycin. Vilken gör att den är en av dom aktiniobakterierna som används flitigt för industriellproduktion. Olika bakteriestammar har sedan dess medicinska användning identifierats och utvecklats för att undersöka vilka stammar som är hög producerande. US11/712,494 var en av dessa stammar som identifierades och användes. Stammen kunde däremot som mest bara producera 3,7 g vankomycin/ l bakteriepreparation. För att lösa problemet används genteknik för att designa bakterier och svampar på laboratorium, genom att mutera eller addera kopior av involverade gener som ansvarar för antibiotikaproduktionen. Detta för att öka effektivitet och göra det billigare att producera för medicinskt användning (Genteknik). A.orientalis KCCM-10836P är ett exempel på genteknikens användning. Stammen är muterad med UV-strålning som gör att den snabbare kan producera vankomycin. Dock optimeras och muteras olika aktiobakterier hela tiden för att hitta den bästa, men KCCM-10836P har hög potential. Optimeringen görs genom att testa olika näringstillgångar och förhållanden som gör att bakterien ökar produktionen ytterligare. Vanliga parametrar som används är kol- och kvävetillgångar, tillgången till syre, ph och temperatur. För att testa optimeringen av temperatur respektive ph testas de med ett bestämt intervall. Resultaten från dessa två tester används sedan genomgående i de övriga parametrarna. För att bestämma optimeringen av koloch kvävetillgångar förbereds bakteriekultur med olika kol- och kvävekällor. Dom valda optimala källorna undersöks sedan vid olika koncentrationer. För KCCM-10836P verkar tillgång till syre och rätt ph vara två nyckelparametrar. 9,7 g vankomycin/ l bakteriepreparation var högsta uppmätta produktionen och detta skedde vid ph 7 i 34 grader. Av de testade kol- och kvävekällorna gav dextrin 6,2 g vankomycin/ l bakteriepreparation respektive 30 g vankomycin/ l bakteriepreparation när sojabönor användes som kvävekälla. Kvävekällorna varierade mycket på produktionen till skillnad på kolkällan (Hyung-Moo Jung, 2007). Vankomycins molekylstruktur Vankomycin tillhör gruppen glykopeptidantibiotikum. Glykopeptider är linjära heptapeptider med ovanliga aminosyror som är oxidativt kopplade till varandra. Vankomycin är dock unik inom familjen då den är en linjär pentapeptid. Glykotidantibiotikum produceras naturligt av aktiniobakterier som har oftast har bakteriostatisk verkan mot grampositiva bakterietyper. 6
Strukturbestämningen av vankomycin var en utdragen process som tog många år med flera involverade forskargrupper (J-C-J Barna, 1984). Molekylstrukturen blev först känd år 1982, hela 24 år efter att antibiotikan godkändes av FDA för behandling mot resistenta S.aureus. Resan började år 1965 där uppskattningsvis halva molekylen identifierades med hjälp av klassiska nedbrytningsmetoder. Genombrotten kom år 1977 med hjälp av H1-NMR spektroskopi. Fördröjningen orsakades då den första röntgenkristalleringen baserades på en kristallprodukt (CD-1) som upptäcktes i ett av experimenten genom att upphetta vankomycin under något sura förhållanden. CD-1 visade sig ha sin kloridatom på baksidan på en av de aromatiska ringarna som då gav en isoasparagin. Det visade sig vara felaktigt då vankomycin faktiskt har kloridatomen på sin framsida på samma aromatiska ring. Detta ger en asparagin istället för en isoasparagin. Molekylstrukturen rättades och slutfördes år 1987 med röntgenkristallografi, som år 1996 säkerställdes med samma testmetod (Mark S Butler, 2014). Figur 1. Vankomysins molekylstruktur som visar den oxidativa kopplingen som bildar de tre cykliska ringarna i molekylen. Samt reaktionerna som är med i vankomycins biosyntes (Patrick, 2013). För molekylstruktur efter biosyntesen se figur på framsida. Vankomycin består av fem aromatiska ringar som har en oxidativ koppling till varandra vilket bildar tre cykliska delar i strukturen. Strukturen innehåller två kloratomer, två hydroxyler och två sockermolekyler (Nagrajan, 1991). Vilka induceras till molekylen genom klorisering, hydroxylering respektive glykosineringenligt figur 1. De cykliska ringarna är viktiga i molekylen. Den oxidativa kopplingen gör att de aromatiska ringarna inte kan rotera då enkelbindningarna emellan hindrar rotation. Den fixerade konfirmationen ger vankomycin sin unika verkningsmekanism som utgör sin antibakteriella effekt på byggstenarna som finns i cellväggen hos de grampositiva bakterierna. I molekylstrukturen finns nämligen en ficka varav n-terminalen på byggstenarna passar in och hålls ihop av fem vätebindningar. Fickan 7
skapar en blockande skyddstak som förhindrar cellväggen att byggas upp, mekanismen beskrivas mer i avsnittet om farmakodynamik. Dimerisering av vankomycin kan även förkomma. Dimerisering sker genom en huvud-svans interaktion mellan två vankomysinmolekyler. Interaktionen hålls ihop av fyra vätebindningar och gör att hämningen cellväggens biosyntes ökar. De två sockergrupperna och de två klorgrupperna i molekylen har visat sig spela en viktig roll vid dimering som vid frånvaro av någon av dessa grupper blir interaktionen svagare (Patrick, 2013). Vankomycin är en stor molekyl med en molekylmassa på 14 447,4 u (Patrick, 2013). Storlek gör den oförmögen att korsa det yttre membranet hos gramnegativa bakterier vilket består av lipopolycackarid. Detta gör att vankomycin saknar bakteriell effekt mot dessa bakterier. Grampositiva bakterier har dock sin cellvägg utanför cellmembranet och saknar lipopolysackarid med består istället av teikonsyra. Vankomycins farmakodynamik Vankomycin är en kraftfull glykopeptidantibiotika som används vid svårbehandlade infektioner. Där de orsakande grampositiva bakterierna har utvecklat resistens mot dess vanliga antibiotikabehandling. S.aureus infektioner behandlas vanligen med penicillin som är ett β- laktamerantibiotika. Den förstör bindningen mellan peptidoglykaner i cellväggen genom att binda till s.k. penicillinbindande proteiner (PBP). Penicillinresistent beror ofta på att dessa bakterier har fått en gen som kodar för ett nytt enzym i dess mikrobiom via en plasmidöverföring. Detta enzym heter β-lakamas och kan bryta ner de flesta β- laktamerantibiotikum, innan de hunnit göra sin effekt (Patrick, 2013) Efter upptäckten användes isoxazylpencillin som är robusta mot enzymerna då de har en annan verkningsmekanism. Men efter upptäckten av isoxazolylpencillin resistenta S.aureus (MSRA) och andra grampositiva bakterier blev vankomycin återtagen på marknaden. (Robert C. Moellering, 2006) MSRA tror mest tros bero på en genetisk mutation på PBP, vilket gör behandlingarna verkningslösa. 8
Figur 2. De fem vätebindningarna mellan vankomycin och bakteriens n-terminala L-lysyl-D-alanyl-Dalanin motiv. Figuren illusterar även skyddstaket som bildas vid interaktionen, vilket som hämmar cellväggens biosyntes (Patrick, 2013). Glykopeptider har huvudsakligen en bakteriostatisk effekt på grampositiva bakterier och har en annan verkningsmekanism jämfört med behandlingarna ovan då de har sin verkan i tidigare skede. Vankomycin har dock en baktericid effekt genom att den hämma cellväggens biosyntes hos dessa bakterier (Grace Yim, 2014). Vankomycin har en ficka i molekylstrukturen. Denna ficka känner igen peptidsekvensen L-lysyl-D-alanyl-D-analin som finns på den n-terminala delen hos cellväggens viktigaste byggblock N-acetylmuramidsyra (NAM) och N- acetylgluksamin (NAG). Fickan och monomernas n-terminaler interagerar med fem vätebindningar och interaktionen gör att vankomycin fungerar som ett skyddstak enligt figur 2. Detta förhindrar NAM/NAG att komma i kontakt med cellväggens transpeptidas (Patrick, 2013). Där enzymens uppgift är att transglysera byggblocken genom att sammanfoga ändarna med varandra. Blockningen gör att cellväggen tillslut går sönder. (Nagrajan, 1991). Vankomycins farmakokinetik Vankomycin har ett pka-värde på 8,8 och är därmed en svag basisk antibiotika. Vankomycin har högpolära egenskaper, logp-värde -3.1, med totalt 19 vätebindningsdonatorer och kan acceptera 24 vätebindningar. (Patrick, 2013) Detta göra att molekylen absorberas väldigt dåligt via oral administration och intas endast oralt vid lokal behandling av Clostrium difficile 9
i tarmen där den är övervägande joniserad. För systemiskeffekt måste vankomycin administreras intravinöst. Där absorberas den snabbt. Men måste ske tillräckligt långsamt och tillräckligt utspätt, högst 10 mg/min och utspädningsgrad bör minst vara 100 ml/1g. Distributionsvolymen är 1 l/kg och diffunderas från blodcirkulationen till nästan alla kroppens vävnader, även över placentan. Efter 1 g intravenös administration under en timma är serumkoncentrationen 60-65 ml/l och sjunker därefter till 25-35 mg/l efter en timma, 8 mg/l efter 11 timmar och är nästan helt eliminerad inom ett dygn vid normal njurfunktion. Plasmaproteinbindingen är mellan 30-55 % och ibland även högre. Halveringstiden är 4-6 timmar vid normal njurfunktion hos en vuxen patient, men kan ta dagar vid onormal njurfunktion. Under den tiden måste patienten gå på kontinuerlig kontroll för att hålla koll på eventuella toxiska biverkningar. Vankomycin metaboliternas i låg omfattning då den är så pass högpolär. 70-80 % elimineras oförändrat ur kroppen inom ett dygn (FASS, 2010). Hittills har inga metaboliter hos människan observerat. Utsöndringen sker huvudsakligen genom glomerulär filtration via njurarna och 5 % via gallan. Risken att få biverkningar av vankomycin är relativ låg idag jämfört med hur det var förut. Den numera andra-generationens glykopentatidantiumotikum har förbättrade farmakologiska egenskaper till följd av optimerad produktion och rening (Patrick, 2013). Nu är man även medveten om betydelsen av en långsam administrering i kombination med att dosen ska vara tillräckligt utspädd. Mindre vanliga biverkningar, förutom överkänslighet, är hudutslag eller red neck syndrome som orsakas av för snabb injektion och njurskador vid hög dosering. Skador på innerörat kan ske vid oral administration och ger uttryck i hörselnedsättning. (Läkemedelsboken, 2011) Vankomycinresistens S.aureus och enterokocker är två bakterier som är vanliga orsaker till olika sjukdomsinfektioner. Enterococcus faecalis och Enterococcus faecium är de två vanligaste enterokocker som är sjukdomsframkallande hos männsikan (Läkemedelsboken, 2011). Dessa grampositiva bakterier lever oftast i harmlös symbios i normalfloran hos bärare. Men kan smittas både indirekt via luft, direkt vid infekterade hudåkommor eller att bärare av dessa bakterier utvecklat patogena egenskaper. För en frisk bärare är dessa infektioner kortvariga som går över efter en viss tids behandling. Men ett sänkt immunförsvar kan infektionerna bli 10
livsfarliga. Vankomycin är ett smalspektrumantibiotika, vilket menas att den bara verkar på vissa bakterier. Detta med avsikt att endast behandla bakterierna som är patogena för att minska påverkan på de andra friska bakterierna i normalfloran. Vid pencillinresistens försöker man ändå använda β-laktamerantibiotikum, även om behandlingen går långsammare och kan i visa fall kombineras med β-laktainhibitatorer för att inhibera β-laktamaser. Och först när bakterieinfektionen verkligen inte går att bota, används isoxazolylpenicillin som behandling. Vankomycin sätts in när ingenting annat hjälper för att bota svåra infektioner orsakade av resistenta grampositiva bakterier. Detta för att på alla sätt undvika resistensutveckling då vankomycin är ytterst viktig för intensivbehandling av bakterieinfektioner orsakades i samhället och i sjukhusmiljö (BA, 2008). S.aurus som har utvecklat resistens mot izoxazolylpencillin (MRSA) är klassad som allmänfarlig och är smittspårpliktig enligt smittskyddslagen (SFS 2004:168, SOSFS 2012:2). Då dessa bakterier kräver behandling med vankomycin. Enteriokocker är problematiska då de har lätt att utveckla antibiotikaresistens och år 1989 blev det ett faktum att det finns bakterier inom denna grupp som kan utveckla resistens även mot vankomycin (VRE). Det finns även fall där S.aureus utvecklat vankomycinresistens (VRSA), men dessa har lyckligtvis bara uppvisat svag motståndskraft och är ytterst sällsynt. VRE och VRSA är liksom MRSA allmänfarlig och smittspårning. Om man misstänker MRSA eller VRE bör en screening göras på individer som antingen själva tidigare varit bärare, anhöriga som tidigare varit bärare eller om man har varit inlagd i öppenvård utanför Sverige (Uppsala, 2013). MRSA tros bero på genetiskt muterade PBP, men detta är inget problem för vankomycin och andra glykopeptidantibiotium då de har en annan verkningsmekanism. Vankomycin är verkningsam i den n-terminala delen på NAM och NAG vilket hindrar dom att komma i kontakt med cellväggens transpeptidas, som har till uppgift att sammanfoga byggblocken med varandra. Det finns olika typer av glykopeptidresistens. Resistens sägs bero på mutationer i olika vangenkomplex som gör att peptidkedjan ändras, sista n-terminalen D-alanin har blivit ersatt av en D-lakta. Detta gör att vankomycin inte längre kan bilda skyddstak -komplexet (Figur 2) och har därmed ingen antibakteriell verkan. Mekanismen är dock inte helt kartlagd men det har visat sig att mutation på vana-gener ger den största resistensen. (Georgopapadakou, 2014). Det kan ske korsresistens mellan vankomycin och andra antibiotika. Men inte mellan vankomycin och andra glykopeptider. 11
Vankomycins användning och framtidsutsikter Förut var bakterier något främmande, men nu har man förstått dess betydelse för vår egen överlevnad. Bakterier är en del av människan och man kan se det som vårt största organ. Dom hjälper oss att vara välmående och skydda oss mot patogener. Bakterier är självständiga mikroorganismer som även dom, som allt annat levande, har en drivkraft att överleva. Även om de oftast är till vår nytta måste man ha respekt för dom. Respekt för vad dom kan orsaka. Sjukvården har stor respekt och förtroende på Vankomycin. Användningen är väldigt kontrollerad och återhållsam med medveten smittskyddsåtgärden. Den används bara när den måste användas. Vankomycin användes mycket under 1980-talet för att behandla MRSA och andra resistenta grampositiva bakterier. Detta kan ses som en av anledningarna till utvecklingen av VRE, vilket också har utvecklat VRSA. De farligaste stammarna är de som är heteroresistenta mot vankomycin och de tros troligen bero på mutationen i vana-genen (BA, 2008). Det finns ett flertal antibiotika som fungerar mot MRSA och VRE. Dessa är linezolid, quinupristin, dalfopristin, daptomycin och tigecyklin. Om resistensutvecklingen inte går att hålla tillbaka kan dessa antibiotikum få en allt större roll. (Levine, 2014). Men vad händer om bakterierna utvecklar resistens mot dessa? Kan vi förlita oss att den antibakteriella läkemedelsutvecklingen ska rädda mänskligheten i kampen mot världens största organism? Diskussion Vankomycin är ett viktig antibakteriellt läkemedel. I framtiden kan det bli allt svårare att bota bakterieinfektioner pågrund av resistensutvecklingen. Därför är det extra viktigt att värna om de fungerande läkemedel som finns på marknaden. Den moderna människan lever globalt och en hel värld kan drabbas om en superbakterie utvecklas i framtiden. En bakterie som människan har inducerat med att behandla dom med optimerade naturprodukter. Vankomycin är kraftfull och är minst lika aktuell nu som den var för över 50 år sedan. 12
Referenslista Sektionen för vårdhygien i Uppsala län (2013). Screening av resistenta bakterier. BA, C. (2008). Vancomycin revisited: a reappraisal of clinical use. Crit Carre Clin, 393-420. DP, L. (2008). Vancomycin: understanding its past and preserving its future. South Med, 284-91. FASS. (2010-12-20) Hämtat 2014-09-20 från http://www.fass.se/lif/product?usertype=0&nplid=19960927000072 Genteknik. Hämtat 2014-09-20 från http://www.genteknik.se/sv/effektivare-antibiotikaproduktion Georgopapadakou, N. H. (2014). Prospects for new antibacterials: can we do better?. Expert Opin. Investig. Drugs, 145-148. Grace Yim, M. N. (2014). Glycopeptide antibiotic biosynthesis. the Journal of Antibiotics. Hyung-Moo Jung, S.-Y. K. (2007). Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for vancomycin production by Amycolatopsis orientalis. Appl Microbiol Biotechnol, 789-795. J-C-J Barna, D. W. (1984). The structure and mode of action of glycopeptide antibiotics of the vancomycin group. 339-537. Läkemedelsboken. (2011-02-23). Hämtat 2014-09-20 från http://www.lakemedelsboken.se/product/20071206000037 Levine, D. P. (2014). Vancomycin: A History. Lilly, E. företagshemsida. Hämtat 2014-09-20 från http://www.lilly.com/pages/home.aspx Nagrajan, R. (1991). Antibacterial Activities and Modes of Action of Vancomycin and Related Glycopeptides. Antibiobial agents and chemotherapy, 605-609. Mark S Butler, K. A. (2014). Glycopeptide antibiotics: Back to the future. The Journal of Antibiotics. Patrick, G. L. (2013). An introduction to medicinal chemistry 5 edition. Oxford. Robert C. Moellering, J. (2006). Vancomycin: A 50-Year Reassessment. Clinical Infectious Diseases. 13