OCCURRENCE OF MOULD AND MYCOTOXINS IN SWEDISH MAIZE SILAGE A PILOT STUDY

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp C-nivå, VT 2010 OCCURRENCE OF MOULD AND MYCOTOXINS IN SWEDISH MAIZE SILAGE A PILOT STUDY Mari Karlsson Handledare: Alexey Solyakov Enheten för kemi, miljö och fodersäkerhet Statens veterinärmedicinska anstalt 1

ABSTRACT During the last ten years the cultivation of maize in Sweden has increased and is expected to grow further. Most of the maize in Sweden becomes silage which is used to feed animals at farms. Maize has in other countries been shown to be a substrate for growth of mould and especially Aspergillus spp., Fusarium spp. and Pencillium spp. has been reported. Members of all three of these species can, during favorable conditions, produce mycotoxins which can cause a number of different health problems in both animals and man. The aim of this study was to investigate the occurrence of mould and mycotoxins to increase our knowledge of the hygienic quality of Swedish maize silage. Microbiological analyses were made to study the growth of fungi. To analyze for fumonisin B 1, B 2 and zearalenone, HPLC with fluorescence detection was made. The mycotoxins mycophenolic acid, roquefortine C, gliotoxin, penicillic acid, penitrem A, fumitremorgen C and verrucologen were analyzed with LC-MS/MS. The results showed that 47 % of the samples were contaminated with Penicillium spp. and 6 % had growth of Aspergillus fumigatus. A small amount of zearalenone was found in one sample and 0.01ppm of roquefortine C was detected in one sample. The data obtained indicate that Swedish maize silage has a moderate growth of fungi with a very low production of mycotoxins. More studies have to be performed to make more decisive conclusions. KEYWORDS: forage, corn, A.fumigatus, Fusarium, Pencillium 2

INTRODUKTION De senaste åren har majsodlingen i Sverige ökat rejält. År 2000 odlades majs på ca 2500ha, 2008 hade den majsodlade arealen stigit till upp mot 12000ha och majsodlingen sägs fortfarande öka. 1 95 % av Sveriges majs blir ensilage 2 vilket innebär att grödan konserveras för att lagras och kunna användas senare utan att förlora näring och kvalitet. Ensileringsprocessen går ut på att mjölksyrebakterier, under anaeroba förhållanden, fermenterar olika vattenlösliga sockerarter till bland annat ättiksyra och mjölksyra. Syrorna som bildas gör att ph i fodret sjunker, och det i kombination med syrebrist medför att tillväxten av mikroorganismer hämmas och fodret behåller en bra kvalitet [1]. Majs är energirikt, välsmakande och lättsmält och det innehåller mycket lösliga sockerarter som gör att det är lätt att ensilera. Dessa faktorer plus det faktum att det endast krävs en enda skörd gör att majs har många fördelar jämfört med gräs som oftast måste skördas två eller tre gånger per år. I Kanada har man gjort en studie för att visa på möjligheterna att odla majs i kallare klimat. Klimatet har länge begränsat odlingen av majs till länder med varmare klimat men i och med att det idag finns möjligheter att odla majssorter som inte behöver lika lång säsong för att växa ökar majsodlingen även i länder med kyligare klimat [2]. Allt som odlas till djurfoder eller livsmedel måste hålla en bra kvalitet för att försäkra att det inte finns någon risk att de som äter fodret eller livsmedlet blir sjuka. Djurfoder får inte innehålla skadliga mikroorganismer, höga halter av tungmetaller eller av andra giftiga ämnen som kan riskera djurens, och i det långa loppet kanske även människors, hälsa. Dessutom kan utfodring med dåligt foder leda till stora ekonomiska förluster för bönder genom minskad tillväxt hos djuren, reducerad mjölkproduktion eller sjuka djur. En risk i foderproduktionen är kontaminering med mikroorganismer som till exempel mögelsvampar. Dessa kan angripa grödan redan under tillväxten ute på fälten men även vid skörd eller under lagringen. Olika faktorer som väderförhållanden, insektsangrepp och skador vid skörd kan bidra till en ökad tillväxt av mögelsvampar ute på fältet [3]. Dåligt packade ensilagebalar eller silos, dålig täckning av silo eller blött foder ökar risken av kontamination under lagringen genom att syre kan komma in och försämra ensileringsprocessen [4]. 1 http://www-njv.slu.se/seminar2010/20100215_swensson.pdf, 100407 2 http://194.47.52.113/janlars/partnerskapalnarp/ekonf/20080206/1315_mattiaszetterstrand.pdf, 100407 3

Fodrets näringsvärde minskar och sporer och eventuella mykotoxiner från mögelsvampar kan bidra till hälsostörningar hos både djur och människor [5]. Mykotoxiner är biologiskt aktiva metaboliter som bildas av olika mögelsvampar och flera av mykotoxinerna kan ha toxisk påverkan på djur och människor. Olika mögelsvampar producerar olika sorters mykotoxiner och toxiciteten hos mykotoxinerna varierar [1]. Majsensilage har visat sig kunna innehålla en mykoflora innehållande drygt 20 olika arter av mögelsvampar [5,6]. Flertalet av arterna hör till Aspergillus, Fusarium och Penicillium och flera arter inom dessa familjer har visat sig vara producenter av mykotoxiner [5]. Fusarium är en svamp som ofta angriper majs ute på fälten. Den kan bilda ett antal olika mykotoxiner som kan vara skadliga. Mykotoxinerna kan bildas ute på fältet och även om svamparna möjligen försvinner under ensileringen så kan mykotoxinerna fortfarande finnas kvar i fodret när det ges till djuren [7]. Vanliga mykotoxiner i majsbaserade foder är fumonisiner som bildas av bland annat F. verticilliodes och F.proliferatum. Fumonisiner har visat sig orsaka leukoencefalomalaci hos hästar och lungödem hos grisar [8]. De kan även ge upphov till njurskador hos bland annat svin, råttor, får och kaniner och även leverskador hos råttor och kaniner. The International Agency for Research on Cancer (IARC) har dessutom klassat fumonisiner som cancerogena för människor [9]. Ett annat mykotoxin med toxiska effekter som kan bildas av Fusarium spp. är zearalenon. Zearalenon har hittats i små mängder i majsensilage tidigare [6] och bildas av bland annat F.graminearum. Det har visat sig ha östrogena effekter i djur [9,10] med symptom som minskad mjölkproduktion och infertilitet [10]. Aspergillus fumigatus har påvisats i ensilage [4] och den kan bilda både sjukdomsframkallande sporer och mykotoxiner som gliotoxin, fumitremorgener [10] och verruculogen som även kan bildas av olika Penicillium spp [11]. Sporerna sprids lätt i luften och är patogena för både människor och djur och kan orsaka infektion i luftvägarna, aspergillos [12]. Mykotoxinerna kan bland annat framkalla spontana aborter, lever och njurskador, nervskador och försämra immunförsvaret så att djuren lättare drabbas av infektioner [4]. Penicillium spp. hittas framför allt i lagrad majs men förekommer även i färsk, nyskördad majs. En av de vanligaste svamparna i majs är P.roqueforti som har visat sig 4

kunna växa i låg syrehalt och i låga temperaturer [13] och kan bilda ett flertal toxiska metaboliter [5-6,13] bland annat roquefortin C och penitrem A som förmodas vara neurotoxiska [14]. Roquefortin C misstänks även orsaka spontana aborter och bortstötning av moderkakan [15]. Roquefortin C har visat sig finnas i högre koncentrationer i majsensilage jämfört med ensilage av gräs [13]. P.roqueforti kan dessutom bilda mykofenolsyra och penicillinsyra (som även kan bildas av olika Aspergillus spp.). Mykofenolsyra hämmar immunförsvaret genom att bland annat förhindra bildningen av antikroppar och cytotoxiska T-celler, vilket kan leda till allvarlig utveckling av infektioner hos djur [16]. Penicillinsyra har visat sig kunna vara cancerogent i möss [17]. Förstagångskalvande kor i svenska besättningar som fick majsensilage att äta dagarna runt kalvning har en ökad risk att drabbas av juverinflammationer under den tidiga laktationen [18]. I den studien gjordes det inte någon analys för att titta på den hygieniska kvaliteten på majsensilaget men en förklaring till den ökade risken kan ha varit att det växte mykotoxinbildande svampar i majsen. P.roqueforti hittades i gräsensilaget och det är mycket troligt att det även fanns i majsensilaget. Om mögelsvampar växer till i fodret och bildar mykotoxiner beror på en rad olika faktorer som bland annat fukt, temperatur, lagringsförfarande, tillförsel av syre, vattenhalt och ph. När plantorna bli utsatta för förhållanden som stressar dem blir risken för kontaminering större. Variationer i vädret under majsens tillväxt ute på fälten påverkar till exempel halterna av Penicillium-toxiner som blir högre när det är mycket nederbörd och högre fuktighetsgrad under majsens tidiga utveckling [15]. Insektsangrepp eller mekanisk skada av grödan vid skörd gör att den blir mer åtkomlig för angrepp av mögelsvampar med toxinproduktion [3]. Högt vatteninnehåll i majsen ger högre toxinproduktion [13] och så även högre ph under lagringen. Tillväxt av jäst under lagringen kan till exempel medföra större tillgänglighet för mögelsvampar att växa genom att jästsvamparna kan förbruka mjölksyran som bildas vid fermenteringen. Detta leder till att ph inte sänks tillräckligt och det gynnar mögelväxt [4]. Lite är känt om hur det svenska klimatet och de svenska förutsättningarna påverkar utvecklingen av mögelsvampar och dess toxinproduktion i majs. Genom att majsodlingen i 5

Sverige inte har tagit fart på allvar förrän de senaste åren är kunskapen om vilka svampar som växer i svensk majs mycket begränsad. Våren 2009 skickades en informationsbroschyr ut till Sveriges bönder med majsodling om att ett pilotprojekt för att titta på mögelsvampar och framför allt mykotoxiner i svenskt majsensilage skulle starta vid enheten för kemi, miljö och fodersäkerhet (KMF) på Statens veterinärmedicinska anstalt (SVA). Syftet med studien skulle vara att undersöka förekomsten av mögelsvamp med avseende på främst Aspergillus, Fusarium och Penicillium och ett antal av deras mykotoxiner för att ge en ökad kunskap om dessa i Europa vanliga svampar och mykotoxiner kan förekomma under svenska förhållanden. De första proverna kom in under hösten 2009 och hade redan genomgått mikrobiologiska och en del av de kemiska analyserna när denna del av studien började. Under våren 2010 blev syftet att analysera de prover som skickades in till SVA samt att utföra de kemiska analyser som inte hade gjorts ännu på prover från 2009. Mikrobiologiska analyser ger en bild av vilken flora av mikrober som finns och kan därmed ge en idé om vilka mykotoxiner som kan tänkas finnas i provet. De kemiska analyserna visar om det finns mykotoxiner och vilket eller vilka det är. MATERIAL OCH METODER Provmaterial Bönderna som fick informationsbroschyren fick själva välja om de ville delta i projektet och fick då själva ta prover på majsensilage och skicka in till SVA. Prover kom från olika delar av Sverige men främst från de södra delarna med dominans av Skåne och Öland. Mikrobiologisk analys Majsensilage lades på två olika svampspecifika agarplattor, DG18 (diklor 18% glycerol) och Czapek, och inkuberades i 5 till 6 dygn. DG18-plattan inkuberades i 25ºC och Czapek i 37ºC. Därefter identifierades eventuella svampar makroskopiskt under lupp. 6

Mykotoxinanalyser 150g majs vägdes in och torkades i 30ºC över natt. Därefter maldes det med hjälp av en slagkvarn (falltalskvarn) till en storlek av 1mm. Zearalenon Zearalenon analyserades genom att 10g malt prov vägdes in och till det tillsattes 100ml acetonitril/vatten (8+2 v/v). Extraktionen utfördes 1 timme på skak. Extrakten filtrerades genom filtrerpapper (Whatman 597 ½). 2,5ml av extrakten späddes därefter med 50ml PBSbuffert 2 vilket innebar PBS-buffert 1 spädd med vatten 1+9 v/v. (Buffert 1 var PBS 10x koncentrat Artnr. 992442, Sektionen för substratproduktion, SVA, spädd 1+9 v/v) och spädningen applicerades på kolonn (EASI_EXTRACT Zearalenone, R-Biopharm) på en undertryckskammare. Innan det kom luft in i kolonnen tvättades den med 20ml vatten. När allt vatten runnit igenom trycktes luft igenom. Zearalenon eluerades med 1,5ml acetonitril. Vätskan trycktes ut med luft och kolonnen tvättades med 1,5ml vatten som fick rinna igenom och det sista trycktes igenom med luft. Därefter fylldes HPLC-vialer till hälften med det eluerade och tvättade extraktet och förseddes med lock. Proverna analyserades med HPLC kopplad till en fluorescencedetektor (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Injektionsvolymen var 100µl och den mobila fasen utgjordes av acetonitril och vatten (1+1 v/v). Flödeshastigheten var 1ml/min och provet vandrade genom C18 kolonner (5µ, 150*4,60mm, Phenomenex). Temperaturen i systemet var 20ºC och detektion skedde vid 272nm excitation och 450nm emission. Matrisutbyte räknades ut genom att en standardlösning av zearalenon (Sorbent AB, Sverige) sattes till 10g invägt majsensilage till en koncentration av 104µg/kg. Provet fick stå med tillsats i minst 30 minuter i dragskåp innan extraktion, tvätt och eluering skedde, som för ett vanligt prov. Multimykotoxinanalys Analys utfördes för roquefortin C, mykofenolsyra, penitrem A, penicillinsyra, gliotoxin, verruculogen och fumitremorgen C. 10g malt prov vägdes in och till det tillsattes 100ml acetonitril/vatten med tillsats av myrsyra (86+14 v/v med 0,1 % HCOOH). Blandningen 7

inkuberades 1 timme på skak och extrakten filtrerades genom filtrerpapper (Whatman 602 ½). Ca 2,5ml av extraktet renades på kolonn (0,5g, C18, Isolute, Sorbent AB, Sverige) varefter 2ml renat extrakt pipetterades till 10ml provrör och provet dunstade in till torrhet i värmeblock, 45ºC, under kvävgas. Det intorkade materialet löstes sedan upp i 0,5ml mobil faslösning (metanol/vatten, 6+4 v/v). Provet analyserades med LC-MS/MS med C18 kolonner (Luna 5µ, 150*2,00 mm, Phenomenex). LC-systemet (Thermo Finnigan Surveyor LC system) var kopplat till en masspektrometer (TSQ Quantum Discovery, Thermo Finnigan, San José, Kalifornien, USA). Injektionsvolymen var 10µl och flödet 0,2ml/min. 2 mobila faser användes varav den första var vatten med 0,1 % myrsyra (HCOOH) och den andra var metanol med tillsats av 0,1 % myrsyra (HCOOH). Separationen av föreningarna skedde genom en gradienteluering i olika koncentrationer av metanol. Den startade med mobil fas innehållande 60 % metanol som under 10 minuter ökade till 90 %. Därefter följde 5 minuter med 90 % för att sedan gå tillbaka till 60 %. Den totala analystiden var 25 minuter. Parametrarnas värden på detektorn var; sprayspänningen 4,8kV, första gastrycket 30mTorr (kväve), andra gastrycket 20mTorr (kväve), kapillär temperatur 400 C, gastrycket för kollision 1,5mTorr (Argon) och kollisionsenergin16-28v. Till ett negativt majsensilageprov tillsattes en blandning av neurotoxinerna innehållande 0,1ppm roquefortin C, 0,189ppm mykofenolsyra, 0,48ppm penicillinsyra, 0,2ppm fumitremorgen C, 2ppm penitrem A, 1ppm gliotoxin och 1ppm verruculogen för att räkna ut utbytet i analysen. Fumonisin B 1 och B 2 20g prov vägdes in och blandades med 200ml extraktionslösning (acetonitril/vatten 1+1 v/v). Detta fick extrahera 1 timme på skak. Därefter filtrerades provextraktet genom filtrerpapper (Whatman 597 ½). 10ml av extraktet blandades med 40ml PBS-buffert 2. Spädningen filtrerades genom filtrerpapper (Whatman 602). Immunoaffinitetskolonner (Fumonitest WB, VICAM) placerades på en undertryckskammare. 10ml av filtratet applicerades på kolonnen och fick rinna igenom innan kolonnen tvättades med 10ml PBSbuffert 2. Bufferten tillsattes när det återstod lite av provextraktet i kolonnen för att undvika luft i kolonnen. Efter att bufferten runnit igenom trycktes luft genom kolonnen för att få ut den sista bufferten. Fumonisinerna eluerades med 1,5ml metanol och luft trycktes genom 8

kolonnen för att få ut det sista. Elueringsmaterialet dunstades in till torrhet i värmeblock, 45ºC, under kvävgas. Derivatiseringsreagens blandades genom att 40mg o ftaldialdehyd (Fluka, Tyskland) löstes i 1ml metanol. Detta späddes med 5ml 0,1M dinatriumtetraborat och blandades med 50µl 2-merkaptoetanol. Det indunstade provet löstes i 500µl acetonitril/vatten (1+1 v/v) och en liten mängd fördes över till HPLC-vial. I injektorn derivatiserades provet genom att 50µl prov blandades med 50µl derivatiseringsreagens. Derivatiseringen innebar att aminogrupper på de kemiska föreningarna i provet reagerade med aldehyd vilket omvandlade aminogrupper till iminer som ledde till att de kemiska föreningarna senare kunde detekteras. Det derivatiserade provet analyserades med HPLC kopplad till en fluorescensdetektor (Dionex Corporation, Kalifornien, USA). Injektionsvolymen var 20µl och den mobila fasen utgjordes av metanol och 0,1M natriumdivätefosfat (770 +230 v/v) med ph 3,35 (justerat med fosforsyra). Flödeshastigheten var 1 ml/min och temperaturen var 20ºC. C18 kolonner (5µ, 150*4,60 mm, Phenomenex) användes och provet detekterades med fluorescens vid 335nm excitation och 440nm emission. Utbytet räknades ut genom att det till ett prov tillsattes 20µl blandstandard av fumonisin B 1 och fumonisin B 2 (Sorbent AB, Sverige) i koncentrationer av 51 och 50ppb. Detta prov fick extrahera 1,5 timme på skak men behandlades därefter likt ett vanligt prov. RESULTAT Mikrobiologiska analyser Av de 17 proverna som genomgick en mikrobiologisk analys var det 47 % som var kontaminerade med mögel. Samtliga 47 % var kontaminerade med Penicillium spp. och ett prov (6 %) hade även förekomst av Aspergillus fumigatus. Mykotoxinanalyser 15 prover analyserades för zearalenon. Endast i ett prov (7 %) hittades en liten mängd på 59ppb. Resterande prover var negativa. Utbytet i analysen var 98 %. 9

41 prover testades för mykofenolsyra, roquefortin C, penicillinsyra, penitrem A, verruculogen, gliotoxin och fumitremorgen C. Förutom ett prov (2 %) som innehöll spår av roquefortin C (0,01ppm) var alla prover negativa för samtliga av dessa mykotoxiner. Utbytet i analysen visas i tabell 1. Tabell 1. Utbytet för toxiner analyserade med LC-MS/MS. Mykotoxin Utbyte (%) Mykofenolsyra 90 Roquefortin C 30 Penicillinsyra 79 Penitrem A 47 Verruculogen 44 Gliotoxin 85 Fumitremorgen C 15 Fumonisin B 1 och fumonisin B 2 analyserades på 10 prover och samtliga var negativa. Utbytet i den analysen var 62 % för fumonisin B 1 och 31 % för fumonisin. B 2. DISKUSSION Syftet med studien var att undersöka förekomsten av mögelsvampar och mykotoxiner i svenskodlat majsensilage. Resultatet för de prover som skickades in under våren 2010 visade att 47 % hade förekomst av mögel och då främst Penicillium spp. Prover i samma studie som skickades in hösten 2009 hade frekvent förekomst av A.fumigatus och Fusarium spp., något som inte upprepades i vårens prover. Höstens prover var framför allt prover på 10

nyskördad majs medan vårens prover var ensilerade. Det faktum att Fusarium spp. hittades i färsk majs stämmer överens med studier från bland annat Frankrike och Kroatien [9,19]. Dock är det anmärkningsvärt med den höga frekvensen av A.fumigatus i färsk majs. A.fumigatus klassas egentligen som en lagringssvamp som, liksom andra lagringssvampar, kan börja växa när fuktighetshalten överstiger 15 % [7]. Men eftersom A.fumigatus förekom så mycket i färsk majs kan det tyda på ett problem i miljön där majsen odlas, att något ute på de svenska majsfälten gynnar tillväxt av Aspergillus. Genom att A.fumigatus bildar patogena sporer som lätt inandas av både människor och djur kan arbete med och användande av färsk majs i Sverige vara en risk för både djur och bönders hälsa. Den låga frekvensen av A.fumigatus i vårens prover tyder dock på att dessa svampar har försvunnit under ensileringen vilket visar på att ensileringsprocessen fungerat bra i avseende att ta bort svampar som fanns i den färska majsen. Dock förekom det mögelsvampar i 47 % av proverna som kom under våren vilket visar att tillväxten av mögelsvampar inte totalt har hämmats under ensileringen. Samtliga av de svampinnehållande proverna innehöll Pencillium spp. och flera studier visar att Penicillium spp. ofta växer till under lagringen och allra helst om det finns tillgång till syre, då kan den bli den dominerande svamparten i majsensilage [13,20-21]. Mögelsvampar kan förekomma utan att bilda mykotoxiner liksom mykotoxiner kan förekomma även i prover där inte mögelsvampar kan detekteras. Enstaka prover i denna studie innehöll små koncentrationer av mykotoxiner. Ett av 15 prover innehöll zearalenon vilket är ganska låg frekvens av kontaminerade prover jämfört med andra studier där zearalenon förekommer i högre frekvens [9,22]. Dessa studier är gjorda i länder med varmare klimat och Sveriges kallare klimat kan vara en orsak som påverkar att det inte är så mycket zearalenon och andra Fusarium-toxiner i svenskt majsensilage. Man har till exempel visat att fumonisiner förekommer oftare i plantor som växer i varmare temperaturer och fuktigare klimat [23] och Sveriges klimat är varken särskilt varmt eller fuktigt. Det prov som innehöll zearalenon hade ingen detekterad förekomst av mögelsvampar vilket visar att mykotoxinerna kan förekomma i fodret även om inte svampar hittas. Svamparna kan bildas ute på fältet eller under en kort tid i lagringen och sedan dö när fodret torkas eller ensileras medan dess mykotoxiner kan finnas kvar i fodret. I de två 11

prover som innehöll mykotoxiner var koncentrationerna mycket låga. Till exempel kan det detekterade värdet av zearalenon på 59ppb jämföras med EU:s rekommendationer för högsta halter av zearalenon i foder som är 500ppb [24]. Utbytet för flera av toxinerna som analyserades med multimykotoxinmetoden, bland annat verrucologen och fumitremorgen C, låg väldigt lågt och för att den använda analysen ska få användas i rutinen skulle metoden behöva optimeras och valideras så att utbytet blev över 60 %. Men för syftet att studera om mykotoxinet finns eller inte finns kan man godta ett lågt utbyte och om ett speciellt mykotoxin skulle visa sig vara frekvent förekommande går man sedan vidare och validerar en metod så att den anpassas till kvantitativa analyser med större säkerhet. Viktigt att tänka på vid analys med LC-MS/MS är också att titta på resultaten av båda jonerna och bekräfta att det resultat som visas av första jonen stämmer med resultatet av den sekundära jonen. Mycket bakgrund och brus på grund av till exempel orena prov kan medföra att joninställningarna måste regleras för att kunna urskilja topparna ordentligt men det är nödvändigt för att kunna bekräfta och få pålitliga resultat. I denna studie analyserades tillväxt av mögelsvampar med hjälp av direktutlägg av fodret på DG18 och Czapek agarplattor och i många studier används agarplattor med dels andra odlingsmedium och med utstryk istället för utlägg [5-6,25]. I de analyserna späds 100g prov jämfört med denna studie där endast något gram prov tas. När mer prov tas är chanserna större att få med prov innehållande mögel och dess sporer och även andra odlingsmedium kan inverka i hur bra mögelsvamparna växer till. Ett annat sätt att analysera svamptillväxt är med hjälp av molekylärbiologiska metoder som till exempel PCR. Med PCR kan toxinbildande arter snabbt detekteras genom analys av gener som är direkt involverade i biosyntesen av olika mykotoxiner. Primers designas utifrån generna som är delaktiga för biosyntesen av ett eller flera mykotoxin och används sedan i PCR för att påvisa svampar i fodret som har dessa gener [26]. PCR är en mer specifik och känslig metod för analys av mögel och kan detektera svampar på djupare nivå än bara utlägg på agarplattor men det kräver mer utrustning och arbete. En eventuell osäkerhetsfaktor till resultatet är det faktum att provtagningen sker utan någon kontroll från KMF. Bönderna tar själva sina prover och tar med stor sannolikhet av 12

majsensilage som ser fint ut och skickar inte in prover som är synligt mögliga.. Detta gör att resultaten i studien är osäkra men det ger en inblick i vad som kan växa i svenskodlad majs. Slutsatsen av de analyser som gjorts hittills i studien är att färsk majs innehåller frekvent Fusarium spp. och A.fumigatus men förekomsten av mykotoxiner är mycket låg. I ensilerad majs detekteras mögel i nästan hälften av proverna men då är Penicillium spp. vanligast. Förekomsten av mykotoxiner är liten även i ensilerad majs. Fler prover kommer att analyseras i den här studien så att slutsatser om hur man ska gå vidare med forskning inom området kan dras. Resultaten från studien måste bekräftas med ytterligare studier och då med en bättre kontroll på provtagning och hela analyskedjan för att en statistisk utvärdering och grundande slutsatser ska kunna dras. Tydligt är att det förekommer mögeltillväxt av svampar som kan utgöra en hälsorisk för djur och människor och ökar den svenska majsodlingen ytterligare kommer med stor sannolikhet flera studier utföras för att titta på eventuellt flera svamparter men framför allt flera mykotoxiner. 13

REFERENSER [1] Reyes-Velázquez, P.W., Isaías Espinoza, F.R., Rojo, F., et al., 2008, Occurrence of fungi and mycotoxins in corn silage, Revista iberoamericana de micología : órgano de la Asociación Española de Especialistas en Micología, 25, 182-185 [2] Kwabiah, A.B., MacPherson, M., McKenzie, D.B., 2003, Corn heat unit variability and potential of corn (Zea mays L.) production in a cool climate ecosystem, Canadian Journal of Plant Science, 83, 689-698 [3] Pier, A.C., Richard, J.L., Cysewski, S.J., 1980, Implications of mycotoxins in animal disease, Journal of the American Veterinary Medical Association, 176, 719-724 [4] Melo dos Santos, V., Dorner, J.W., Carreira, F., 2002, Isolation and toxigenicity of Aspergillus fumigatus from moldy silage, Mycopathologica, 156, 133-138 [5] Richard, E., Heutte, N., Sage, L., et al, 2007, Toxigenic fungi and mycotoxins in mature corn silage, Food and Chemical Toxicology: An international journal published for the British industrial biological research association, 12, 2420-25 [6] Garon, D., Richard, E., Sage, L., et al., 2006, Mycoflora and multimycotoxin detection in corn silage: experimental study, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 3479-3484 [7] Scudamore, K.A., Livesey, C.T., 1998, Occurrence and significance of mycotoxins in forage crops and silage: a review, Journal of the Science of Food and Agriculture, 77, 1-17 [8] Kim, E-K., Maragos, C.M., Kendra, D.F., 2004. Liquid chromatographic determination of fumonisins B 1, B 2, and B 3 in corn silage, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 196-200 14

[9] Domijan, A-M., Peraica, M., Cvjetkovic, B., et al., 2005, Mould contamination and cooccurrence of mycotoxins in maize grain in Croatia, Acta Pharmaceutica, 55, 349-356 [10] González Pereyra, M.L., Alonso, V.A., Sager, R., et al., 2007, Fungi and selected mycotoxins from pre- and postfermented corn silage, Journal of Applied Microbiology, 104, 1034-1041 [11] Khoufache, K., Puel, O., Loiseau, N., et al., 2007, Verruculogen associated with Aspergillus fumigatus hyphae and conidia modifies the electrophysiological properties of human nasal epithelial cells, BMC Microbiology, 7:5 [12] Wenehed, V., Solyakov, A., Thylin, I., et al., 2003, Cytotoxic response of Aspergillus fumigatus-produced mycotoxins on growth medium maize and commercial animal feed substrates, Food and Chemical Toxicology, 41, 395-403 [13] Auerbach, H., Oldenburg, E., Weissbach, F., 1998, Incidence of Penicillium roqueforti and roquefortine C in silages, Journal of the Science of Food and Agriculture, 76, 565-572 [14] Wagener, R.E., Davis, N.D., Diener, U.L., 1980, Penitrem A and roquefortine production by Penicillium commune, Applied and Environmental Microbiology, 39, 882-887 [15] Mansfield, M.A., Jones, A.D., Kuldau, G.A., 2007, Contamination of fresh and ensiled maize by multiple Penicillium mycotoxins, Phytopathology, 98, 330-336 [16] Schneweis, I., Meyer, K., Hörmansdorfer, S., et al., 2000, Mycophenolic acid in silage, Applied and Environmental Microbiology, 66, 3639-3641 [17] El-Shanawany, A.A., Mostafa, M.E., Barakat, A., 2005, Fungal populations and mycotoxins in silage in Assiut and Sohag governorates in Egypt, with a special reference to characteristic Aspergilli toxins, Mycopathologica, 159, 281-289 15

[18] Nyman, A-K., Emanuelson, U., Gustafsson, A.H., et al., 2009, Management practices associated with udder health of first-parity dairy cows in early lactation, Preventive Veterinary Medicine, 88, 138-149 [19] Bakan, B., Melcion, D., Richard-Molard, D., et al., 2002, Fungal growth and Fusarium mycotoxin content in isogenic traditional maize and genetically modified maize grown in France and Spain, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 728-731 [20] Tapia, M.O., Stern, M.D., Soraci, A.L., et al., 2004, Patulin-producing molds in corn silage and high moisture corn and effects of patulin on fermentation by ruminal microbes in continuous culture, Animal Feed Science and Technology, 119, 247-258 [21] Müller, H-M., Amend, R., 1997, Formation and disappearance of mycophenolic acid, patulin, penicillic acid and PR toxin in maize silage inoculated with Penicillium roqueforti, Archives of Animal Nutrition, 50, 213-225 [22] Sohn, H-B., Seo, J-A., Lee, Y-W, 1999, Co-occurrence of Fusarium mycotoxins in mouldy and healthy corn from Korea, Food Additives and Contaminants, 16, 153-158 [23] Mansfield, M.A., Archibald, D.D., Jones, A.D., et al., 2006, Relationship of sphinganine analog mycotoxin contamination in maize silage to seasonal weather conditions and to agronomic and ensiling practices, Phytopathology, 97, 504-511 [24] Commission Recommendation of 17 August 2006 on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding (2006/576/EC). [25] Fog Nielsen, K., Sumarah, M.W., Frisvad, J.C., et al., 2006, Production of metabolites from the Penicillium roqueforti complex, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 3756-3763 16

[26] Richard, E., Heutte, N., Bouchart, V., et al., 2009, Evaluation of fungal contamination and mycotoxin production in maize silage, Animal Feed Science and Technology, 148, 309-320 17