Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Analys av antistreptolysin-o i patientserum Årskull: Laborationsrapport i Klinisk Laboratoriemetodik II Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare:
Introduktion Streptokocker är grampositiva bakterier som kan ge infektioner som ex tonsillit och hudinfektioner som bland annat svinkoppar. Bakterierna framför allt grupp A, men även vissa stammar inom grupp C och G kan bilda exotoxiner som Steptolysin -O och -S. Vid diagnostik utförs framför allt odling av dessa bakterier men vid svåra sena infektioner eller vid odlingssvårigheter trots stark misstanke om streptokocker görs oftast ett annat test som kallas för Antistreptolysin O (ASO). ASO är ett neutralisationstest där man söker antistreptolysin O, serumantikroppar mot streptolysin O. Streptolysin O är syrelabilt och därmed inaktiverad i oxiderad form medan den i reducerad form har en förmåga att lysera röda blodkroppar. Vid ASO tester krävs det att streptolysinet är aktivt varför man tillsätter natriumpyrosulfit som har en reducerande förmåga på toxinet. Även serumproverna måste reinaktiveras för att förhindra serumkomplementen att hemolysera blodkropparna något som kan ge ett falskt positivt svar. Genom att utföra en streptolysintitrering får man fram streptolysindosen som ger 50% hemolys i närvaro av 1 enhet antistreptolysin. Streptolysindosen behövs vid uträkning av streptolysin- och natriumsulfit-mängden. Vid avläsning av resultatet jämförs patientproverna med en hemolysskala där den högsta positiva serumspädningens inverterade titervärde anges som svar i enhet/ml. Syftet med ASO-testet är att se om sex patientserum har antikroppar mot exotoxinet antistreptolysin O.
Material och metod Seriespädning och inkubering av sera Vid ASO-testet användes reinaktiverade, färdigspädda kontroller (100, 200, 400 och negativ) samt patientsera färdigspädd (1:50) med AST-buffert. Av dessa lösningar överfördes 50µL till var sin brunn i första respektive sjunde kolumnen i en mikrotiterplatta. Till resterande brunnar (2-6, 8-12) tillsattes 25µl AST-buffert och en tvåfaldig seriespädning utfördes (1:50 1:1600). 50µL streptolysinspädning tillsattes till alla brunnar (uträkning, se bilaga) för att därefter skakas och inkuberas i 37 o C termostat i 15 minuter. Som indikator användes 25µL 2% fårblod i brunnarna, mikroplattan skakades och inkuberades i 37 o C termostat i 60 minuter innan den ställdes i kylskåp över natten. Avläsning och beredning av hemolysskala 2% fårblod späddes med aq-dest vatten (1:4) för att därefter användas i en 10-80% hemolysskala med en slutvolym på 100µl/brunn. Proverna och kontrollerna jämfördes med den brunn som motsvarar 50% hemolys i hemolysskalan. Vid negativ reaktion bildas > 50% hemolys av fårblodkropparna, allt under/lika med denna gräns motsvarar positiv reaktion, vilket anges i enhet/ml.
Resultat Tabell 1. Antistreptolysin O inverterade titervärdena av kontrollerna (märkta med K) och sex olika patientsera vid sex olika försök. ASO Prov Försök I II III IV V VI K Neg 200 100 100 >1600 100 >1600 K 100 100 >1600 100 >1600 400 >1600 K 200 >1600 >1600 800 >1600 400 >1600 K 400 400 800 400 >1600 >1600 >1600 48 50 100 200 >1600 100 >1600 49 400 800 >1600 >1600 400 >1600 50 Neg 400 200 400 200 >1600 52 100 800 800 200 400 >1600 136 200 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 151 200 >1600 >1600 >1600 >1600 >1600 Diskussion Vid undersökningen gjordes sex olika analysförsök vid samma tillfälle på samma patientprover och trots detta blev det olika svar för varje försök (Tabell 1). Detta kan bero på bland annat ovana vid pippetering då man fått fel förhållanden genom felspädningar. Vid användning av samma pipett genom flera brunnar ökar kontamineringsrisken. Det kan ha sprutats in luft i lösningen vid pipettering så streptolysinet inaktiverats. Eftersom alla tog streptolysin ur samma vanna är risken för oxidering av streptolysinet större för dem som använde lösningen sist, det kan man se främst i försök IV och VI där nästan ingenting hemolyserats. Det användes olika kontroller vid försöken, där vissa av dem kan ha varit dåliga eftersom de inte hemolyserats inom felmarginalerna. Vissa har dessutom inte hemolyserats alls och ligger långt över sina förväntade titrervärden i seriespädningen ex K200.
Referenser 1. http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:6l_emdrorigj:www.lj.se/index.js f%3fchildid%3d9309%26nodeid%3d25073%26nodetype%3d12+antistreptolysin+o&cd=1& hl=sv&ct=clnk&gl=se&lr=lang_sv 2. http://sv.wikipedia.org/wiki/streptokocker 3. http://www.medicinenet.com/strep_throat/page5.htm 4. www.smi.se Bilaga 1 Uträkning av stretpolysinspädning Streptolysin dos * antal ml = streptolysin mängd (ml) Streptolysinmängd * 0,04 (konstant) = Na-pyrosulfitmängd (ml) Streptolysindos=0.063 Antal ml = 20 Streptolysinmängd: 0,063*20=1,26mL Na-pyrosulfitmängd: 1,26*0,04=0,05mL=50µL