!" #! $ %%& ' ( % %)( * +,-./ - $0 * +,-./ ) # %& 0 1 % %)(

!" #! $%%&'( %%)( *+,-./-$0 *+,-./) #%&0 1 %%)(

2!" 34 52 1 (6!"7 *+,-./ *+,8 *+,-./- 689,882 8 94!,8,88 : ;9+#.+,<# 2; 923<: +!9=2>,$$ =$ 9,8 2 $ < -5 $ +!9#! + +!9!" 1!"#!-$0 1 6 6 8!7? ; 2!" 345212. ".@7 AB&B.-"? * +, 87 $,!"$ 67 8 $"C6 (8521$C$!78 ;C 521 "6!"!!; $ 6 52 16687 $# 77,88: ; $ 8>6!;52 177;6 " @)86 &&!" &&%!" % %!" &!" %%!" &!" %!" & &A!" A& &!" A% &!" %& A%%!" %!" % 0 77 =1!"= D %%&* +,-./ "7$"?

Innehållsförteckning 1. Innehåll... 6 2. Förvaring... 6 3. Material och utrustning som behövs men inte medföljer... 7 4. Allmänna försiktighetsåtgärder... 8 5. Information om patogener... 8 6. Principen för realtids-pcr... 9 7. Produktbeskrivning... 9 8. Protokoll... 10 8.1 Föranalys: Provtagning samt förvaring och transport av prover. 10 8.1.1 Provtagning... 10 8.1.2 Förvaring av prover... 12 8.1.3 Provtransport... 13 8.2 DNA-isolering... 14 8.2.1 Rekommendationer för isoleringen av urin- och utstryksprover med QIAamp Viral RNA Mini Kit... 16 8.2.2 Rekommendationer för isoleringen av utstryk- och spermaprover med QIAamp DNA Mini Kit... 17 8.2.3 Rekommendationer för isoleringen av lyophiliserade eller frystorkade prover med QIAamp DNA Mini Kit... 18 8.3 Internkontroll... 20 8.4 Kvantifiering... 21 8.5 Förberedelse av PCR... 22 8.6 Programmering av ABI PRISM SDS... 27 8.6.1 Programmering av ABI PRISM 7000 SDS... 27 8.6.1.1 Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning...27 8.6.1.2 Framtagning/val av detektorer...28 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 3

8.6.1.3 Tilldelning av nödvändig information till plattpositioner...29 8.6.1.4 Framtagning av temperaturprofilen...30 8.6.1.5 Spara PCR-körningen...31 8.6.1.6 Starta PCR-körningen...31 8.6.2 Programmering av ABI PRISM 7700 SDS... 32 8.6.2.1 Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning...32 8.6.2.2 Val av fluoroforer och tilldelning av provtyp...32 8.6.2.3 Tilldelning av nödvändig information till plattpositioner...34 8.6.2.4 Framtagning av temperaturprofilen...34 8.6.2.5 Viktiga extrainställningar...36 8.6.2.6 Spara PCR-körningen...37 8.6.2.7 Starta PCR-körningen...38 8.6.3 Programmering av ABI PRISM 7900HT SDS... 39 8.6.3.1 Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning...39 8.6.3.2 Framtagning/val av detektorer...40 8.6.3.3 Tilldelning av nödvändig information till plattpositioner...41 8.6.3.4 Framtagning av temperaturprofilen...42 8.6.3.5 Spara PCR-körningen...44 8.6.3.6 Starta PCR-körningen...44 9. Tolkning av resultat... 45 10. Felsökning... 50 11. Specifikationer... 52 11.1 Analytisk sensitivitet... 52 11.2 Specificitet... 53 11.3 Precision... 55 11.4 Robusthet... 57 11.5 Reproducerbarhet... 57 11.6 Diagnostisk utvärdering... 58 12. Särskild information om produktanvändning... 59 4 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

13. Säkerhetsinformation... 59 14. Kvalitetskontroll... 59 15. Referenser... 59 16. Symbolförklaring... 60 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 5

artus C. trachomatis TM PCR Kit För användning tillsammans med ABI PRISM Sequence Detection Systems. 7000, 7700 och 7900HT Obs!: artus C. trachomatis TM PCR Kit kan inte användas tillsammans med vare sig GeneAmp 5700 SDS eller plattformat 384 för ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Innehåll Benämning och innehåll Art. nr.4552163 24 reaktioner Art. nr. 4552165 96 reaktioner Blå C. trachomatis TM Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Röd Röd Röd Röd C. trachomatis TM QS 1 1 x 10 4 cop/µl C. trachomatis TM QS 2 1 x 10 3 cop/µl C. trachomatis TM QS 3 1 x 10 2 cop/µ C. trachomatis TM QS 4 1 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Grön C. trachomatis TM IC 1 x 1.000 µl 2 x 1.000 µl Vit Water (PCR grade) 1 x 1.000 µl 1 x 1.000 µl QS IC = Kvantifieringsstandard = Internkontroll 2. Förvaring Komponenterna hos artus C. trachomatis TM PCR Kit ska förvaras i -20 C och är hållbara till det datum som anges på etiketten. Undvik upprepad tining och frysning (> 2 x), eftersom det minskar sensitiviteten. Om reagenserna inte används regelbundet, bör de därför frysas i portioner. Om det är nödvändigt kan komponenterna förvaras i +4 C i högst fem timmar. 6 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

3. Material och utrustning som behövs men inte medföljer Puderfria laboratoriehandskar DNA-isoleringskit (se 8.2 DNA-Isolering) Pipetter (inställbara) Sterila pipettspetsar med filter Vortex Bordscentrifug med rotor för 2 ml reaktionsrör Centrifug med rotor för mikrotiterplattor (tillval) 96-brunnars reaktionsplatta/reaktionsrör för optiska mätningar med motsvarande optiskt förslutningsmaterial * (se 8.5 Förberedelse av PCR) 96-brunnars tvådelad fästram för användning av optiska reaktionsrör (96-Well Tray/Retainer Set, kat. nr.: 403 081, Applied Biosystems), se 8.5 Förberedelse av PCR Kompressionsdyna för användning tillsammans med optisk självhäftande folie (Optical Cover Compression Pads, kat. nr.: 4 312 639, Applied Biosystems), se 8.5 Förberedelse av PCR Applikator för förslutning av reaktionsplattor vid användning av optisk självhäftande folie (Adhesive Seal Applicator Kit, kat. nr.: 4 333 183, Applied Biosystems) ABI PRISM 7000, 7700 eller 7900HT SDS Obs!: Innan instrumenten tas i drift krävs en kalibrering av fluoroforerna (Pure Spectra Component File) och bakgrunden (Background Component File). * Användningen av reaktionsrör för optiska mätningar med välvda lock är endast möjligt för ABI PRISM 7700 SDS och kräver en justering av exponeringstiden (se 8.6.2 Programmering av ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Viktiga extrainställningar). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 7

4. Allmänna försiktighetsåtgärder Tänk alltid på följande: Använd sterila pipettspetsar med filter. Positivt material (prover, kontroller, amplikon) ska förvaras, isoleras och tillsättas till reaktionen i utrymme som är skilt från övriga reagenser. Tina alla komponenter fullständigt i rumstemperatur innan testet påbörjas. Blanda komponenterna väl och centrifugera en kort stund. Arbeta snabbt på is eller i kylblock. 5. Information om patogener Bakterier av släktet Chlamydia har stor epidemiologisk betydelse över hela världen. Chlamydia trachomatis (serotyp D L) tillhör globalt de vanligaste patogenerna för sexuellt överförbara sjukdomar (STD - sexually transmitted diseases). De 16 Serovarerna av C. trachomatis orsakar olika sjukdomar: Serovarerna A, B, Ba och C orsakar trakom, en i tropiska länder utbredd kronisk recidiverande sjukdom som angriper bindhinnor och hornhinnan. Serovarerna D - K orsakar sexuellt överförbara urogenitala infektioner och ögoninfektioner samt vid perinatal överföring nyföddhetsinfektioner. Serovarerna LGV I III orsakar lymphogranuloma venereum, en sexuellt överförbar sjukdom som förekommer främst i tropiska områden. Trakom uppträder nästan uteslutande i tropiska länder med bristfälliga hygieniska förhållanden. Den utgör den globalt vanligaste ögonsjukdomen och är näst efter katarakt den vanligaste orsaken till blindhet. Man antar att omkring 150 miljoner människor är infekterade. Omkring 6 miljoner av dessa är blinda. I industriländerna är klamydia den vanligaste bakteriella patogenen för urogenitala infektioner. I Tyskland uppskattas antalet nya genitalieinfektioner till omkring 300 000 per år. Incidensen för lymphogranuloma venereum (lymphogranuloma inguinale, Durand-Nicolas- Favres sjukdom) minskar globalt. Denna sexuellt överförbara sjukdom är dock fortfarande endemisk i Asien, Afrika, Sydamerika och delar av Karibien. 8 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

6. Principen för realtids-pcr Vid diagnostik med hjälp av polymeras-kedjereaktion (PCR) amplifieras specifika regioner av patogengenomet. Vid realtids-pcr sker detektion med hjälp av fluoroforer. Dessa är i regel bundna till oligonukleotidprober, som binder specifikt till PCR-amplikon. Genom detektion av fluorescensintensiteten under realtids-pcr-förloppet kan produkterna påvisas och kvantifieras utan att provrören behöver öppnas igen efter PCR (Mackay, 2004). 7. Produktbeskrivning artus C. trachomatis TM PCR Kit är ett bruksfärdigt system för påvisning av C. trachomatis-dna med polymeras-kedjereaktion (PCR) i ABI PRISM 7000, 7700 och 7900HT Sequence Detection System. C. trachomatis TM Master innehåller reagenser och enzymer för specifik amplifiering av ett 100 bp långt fragment i C. trachomatis-genomet. Detektion av amplikon sker genom mätning av FAM-fluorescens i ABI PRISM SDS. Dessutom innehåller artus C. trachomatis TM PCR Kit ett andra heterologt amplifieringssystem för detektion av en eventuell PCR-inhibering. Detta påvisas som Internkontroll (IC) genom mätning av VIC-fluorescens. Därvid minskas inte detektionsgränsen för analytisk C. trachomatis-pcr (se 11.1 Analytisk sensitivitet). Externa positiva kontroller (C. trachomatis TM QS 1-4) medföljer, med vars hjälp en bestämning av patogenbelastningen kan utföras. Du kan läsa mer om detta i stycket 8.4 Kvantifiering. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 9

8. Protokoll 8.1 Föranalys: Provtagning samt förvaring och transport av prover Obs!: Alla prover ska behandlas som potentiellt smittfarliga. Följande provmaterial är endast tillåtna, hos vilka det är nödvändigt att beakta följande nämnda regler och föreskrifter avseende provtagning, förvaring och transport: 1. Urin (kvinnor och män). 2. Ögon-, endocervikal- och uretralutstryk. 3. Sperma. Prover bör transporteras till undersökningslaboratoriet så snart som möjligt för att en hög provkvalitet ska säkerställas. Prover ska transporteras under de angivna temperaturförhållandena. 8.1.1 Provtagning 1. Urinprover Det ska ha gått två timmar sedan patienten urinerade senast. Samla 10-30 ml urin av första strålen i en ren polypropenbehållare utan konserveringsmedel. Urinprov som samlats i behållare med konserveringsmedel får inte användas. Förslut provbehållaren och märk den. Följ anvisningarna för förvaring och transport. 2. Utstryksprover Använd följande material vid provtagning av ögon-, endocervikal- och uretralutstryk: Använd endast provtagningspinnar med Dacron -, Rayon- eller kalciumalginat-toppar på skaft av plast. Provtagningspinnar med skaft av trä eller aluminium får inte användas. 10 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

1-3 ml ögon-, endocervikal- och uretral- utstryksprover kan samlas och transporteras i följande medium: AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation) Cervical Sampler (Digene Corporation) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) Venturi Transystem (lämpligt för aeroba och anaeroba bakterier), sterila transportrör för utstryk (SARSTEDT AG & Co.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ClamTrans CTM (Bartels, Inc.) Klamydia- provtagningspinne (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) Låt provtagningspinnen förbli i odlingstransportmediumet. Förslut och märk provbehållaren. Följ föreskrifterna för förvaring och transport *. Använd en rekommenderad metod vid provtagning av cylinder- och plattepitelceller efter borttagning av cervikalslem. 3. Spermaprover Provtagning ska tidigast ske två till fyra dagar efter den senaste ejakulationen. Spermaprovet måste tas samma dag som det skickas till laboratoriet. Vid användande av ett rutinmässigt laboratorieförfarande kan spermaprovet tas på ett av följande sätt: genom masturbation direkt i en steril, ren och torr provbehållare. Se till att hela provet direkt hamnar i behållaren. Skulle en del av provet gå förlorat måste detta markeras i provtagningsprotokollet. * Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. Referenser: 1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine (http://uuhsc.utah.edu/andrology/) 2) Andrology Institute of America (http://www.aia-zavos.com/). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 11

genom masturbation i en kondom. Ta bort kondomen efter ejakulationen. Det är viktigt att du tillsluter den väl upptill med ett gummiband för att behålla provet i kondomen. Lägg därefter kondomen i en transportbehållare. Viktigt: Använd endast provbehållare utan konserveringsmedel resp. kondom utan spermicider eller konstgjorda tillsatsämnen (t. ex. färgämnen). Ställ spermaprovet 30 till 45 minuter mörkt (t. ex. i en låda eller i ett skåp) tills det övergått i flytande form. Ställ provet direkt efter att det övergått i flytande form i ett kryorör i -20 C eller kallare. 8.1.2 Förvaring av prover Testresultatet kan påverkas om proverna rutinmässigt fryses eller förvaras under en längre tid. 1. Urinprover Testas urinproven inom 24 timmar, kan de lagras i rumstemperatur (19-23 C). Vid test innom sju dagar efter provtagning måste proven lagras vid 2-8 C i kylskåp. Urinprov som inte kan bearbetas inom sju dagar kan förvaras i -20 C eller kallare i upp till 30 dagar. 2. Utstryksprover Förvaring av prover sker i 2-8 C. (Om utstryksprover måste sändas till ett undersökningslaboratorium, ska detta ske så snart som möjligt efter provtagning enligt laboratoriets föreskrifter för transport av klamydiaprover.) Utstryksprover som inte testas direkt vid ankomsten till laboratoriet ska förvaras i 2-8 C, och bearbetas inom sju dagar. Utstryksprover som inte kan bearbetas inom sju dagar efter provtagning, ska förvaras vid -20 C eller kallare och testas inom 30 dagar efter provtagningsdatum. 12 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

3. Spermaprover Förvaring av prover sker i -20 C eller kallare. Spermaprover som inte testas direkt vid ankomsten till laboratoriet ska förvaras i -20 C eller kallare, och testas inom 30 dagar efter provtagningsdatum. 8.1.3 Provtransport 1. Urinprover Om urinprover ska sändas, ska de förvaras i 2-8 C i kylskåp. Proverna ska sändas i enlighet med gällande lokala och statliga föreskrifter för transport av smittsamma ämnen *.2. Utstryksprover Utstryksprover måste transporteras kylda. Om utstryksprover måste sändas till ett laboratorium, ska de sändas så snart som möjligt efter provtagning enligt laboratoriets föreskrifter för transport under kyla. Proverna ska sändas i enlighet med gällande föreskrifter för transport av smittsamma ämnen *. 3. Spermaprover Om spermaprover måste sändas till ett laboratorium, ska de sändas samma dag som provtagning enligt laboratoriets föreskrifter för transport av klamydiaprover. Beakta även att spermaproven måste transporteras under kyla. Proverna ska sändas i enlighet med gällande lokala och statliga föreskrifter för transport av smittsamma ämnen *. * International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, 2000.704. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 13

8.2 DNA-isolering Kit för DNA-isolering kan erhållas från olika tillverkare. Följ tillverkarens protokoll och tillsätt angiven provmängd till isoleringen. Följande isoleringskits rekommenderas: Provmaterial Urin, utstryk Sperma, utstryk Isoleringskit QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) QIAamp DNA Mini Kit (50) Katalognummer Tillverkare Bärar RNA 52 904 QIAGEN Ingår 51 304 QIAGEN Ingår ej Tillsatsen av bärar-rna är till för isoleringens effektivitet och därmed av avgörande betydelse för utvinningen av DNA-/RNA. Om det använda isoleringskitet inte innehåller någon bärar-rna, bör du vid isolering av nukleinsyror från cellfria kroppsvätskor eller material med låg DNA/RNAhalt (t. ex. likvor) tillsätta bärar-rna (RNA-Homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat. nr. 27-4110-01). Följande tillvägagångssätt rekommenderas: a) Resuspendera de frystorkade bärar-rna i isoleringskitets eluerings buffert (ej i lyseringsbufferten) (t. ex. QIAamp DNA Mini Kit AE-buffert) och bered en utspädning med en koncentration av 1 µg/µl. Portionera denna bärar-rna-lösning till det passande antalet alikvoter du behöver, och lagra dem i -20 C. Undvik upprepad tining (> 2 x) av en bärar-rna-alikvot. b) För varje isolering skall 1 µg bärar-rna per 100 µl lyseringsbuffert användas. Föreslår extraktionsprotokollet t. ex. 200 µl lyseringsbuffert per prov som skall isoleras, skall 2 µl bärar-rna (1 µg/µl) tillsättas direkt till lyseringsbufferten. Innan varje isolering påbörjas måste en färsk blandning av lyseringsbuffert och bärar-rna (om nödvändigt även Internkontroll, se 8.3 Internkontroll) tillredas enligt följande pipetteringsschema. 14 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Antal prover 1 12 Lyseringsbuffert t. ex. 200 µl t. ex. 2.400 µl Bärar-RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Total volym 202 µl 2.424 µl Volym per extraktion 200 µl vardera 200 µl c) Tillsätt den färskt tillredda blandningen av lyseringsbuffert och bärar- RNA direkt till isoleringen. Förvaring av blandningen är inte möjlig. Tillsatsen av bärar-rna är till för isoleringens effektivitet och därmed av avgörande betydelse för utvinningen av DNA-/RNA. För att uppnå en högre stabilitet av det bärar-rna som medföljer QIAamp Viral RNA Mini Kit, rekommenderar vi följande tillvägagångssätt, vilket frångår angivelserna i isoleringskitets handbok: a. Innan första användningen resuspendera de frystorkade bärar-rna av isoleringskitet i 310 µl AE eller AVE buffert (eluerings buffert, slutkoncentration 1 µg/µl, använd ingen lyseringsbuffert) och portionera denna bärar-rna-lösning till det passande antal alikvoter du behöver, och lagra dem i -20 C. Undvik upprepad tining (> 2 x) av en bärar-rna-alikvot. b. Innan varje isolering påbörjas måste en färsk blandning av lyseringsbuffert och bärar-rna (om nödvändigt även Internkontroll, se 8.3 Internkontroll) tillredas enligt följande pipetteringsschema. Antal prover 1 12 Lyseringsbuffert AVL 560 µl 6.720 µl Bärar-RNA (1 µg/µl) 5,6 µl 67,2 µl Total volym 565,6 µl 6.787,2 µl Volym per extraktion 560 µl vardera 560 µl c. Tillsätt den färskt tillredda lyseringsbufferten direkt till isoleringen. Förvaring av blandningen är inte möjlig. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 15

Bland de automatiserade isoleringarna rekommenderas det följande systemet: Provmaterial Isoleringssystem Isoleringskit Tillverkare Urin, utstryk ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation För att erhålla en lista med de förbrukningsmaterial och valierade isoleringsprotokoll som behövs, kontakta den tekniska servicen. Applied Biosystems, Foster City, U.S.A. Om isoleringar med etanolhaltiga tvättbuffertar används, ska innan eluering ytterligare ett centrifugeringssteg utföras för att avlägsna eventuella etanol-rester (tre minuter, 13.000 rpm). Detta förhindrar eventuella PCR-inhiberingar. artus C. trachomatis TM PCR Kit är inte lämpligt för isoleringsförfarande baserade på fenol. Viktigt: Internkontrollen för artus C. trachomatis TM PCR Kit kan tillsättas direkt i isoleringen (se 8.3 Internkontroll). 8.2.1 Rekommendationer för isoleringen av urin- och utstryksprover med QIAamp Viral RNA Mini Kit Den AVL bufferten som ingår i QIAamp Viral RNA Mini Kit har utvecklats speciellt för inaktivering av de otal inhibitorer som ofta förekommer i urin. Därför rekommenderar vi uttryckligen användning av QIAamp Viral RNA Mini Kit protokollet för extraktion av cellulär, bakteriell eller viral DNA från urin. Jämvikta proven till rumstemperatur (19-23 C). Eftersom endast en ringa mängd av bakterier förekommer i urinprover rekommenderar vi att undersökningsmaterialet koncentreras. För detta ändamål centrifugeras urinproven (10-30 ml) i 15-20 minuter vid 10.000 x g (alternativt i 30 minuter vid 3.000 x g). Skilj överflödande rester och resuspendera pellets med intervall-vortexing (15-30 sekunder) i 300-900 µl 1 x PBS. Resuspenderingsvolymen hänger ihop med provvolymen. 16 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Vid användning av utstryksprover skaka provtagningspinnarna minst en timmar i 500 µl 1 x PBS vid rumstemperatur. Utstryksproven, som bevaras i ett transportmedium måste blandas noggrant genom vortexing. Ta försiktigt av locket på provtagningsrören, och se till att inte hanskarna blir kontaminerade. Kontaminerade hanskar måste innan bearbetning av nästa prov ersättas med ett par nya. Tryck provtagningspinnen mot väggen på röret för att trycka ut vätskan. Ta upp eventuella förekommande slemrester i provet med provtagningspinnarna. Tryck ut slemmets restvätska på provtagningspinnen mot väggen på röret. Avlägsna och släng bort provtagningspinnen med de möjliga slemresterna. För DNA-isoleringen bör 140 µl av de på detta sätt förbehandlade proven användas. Följ QIAamp Viral RNA Mini Spinprotokollets (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) anvisningar efter steg 1. Säkerställ ovillkorligen att det alternativa centrifugeringssteget 9a (13.000 rpm, tre minuter) hos protokollet för att avlägsna etanolrester genomförs. En elueringsvolym på 60 µl rekommenderas. 8.2.2 Rekommendationer för isoleringen av utstryk- och spermaprover med QIAamp DNA Mini Kit Jämvikta proven till rumstemperatur (19-23 C). Utstryksproven, som bevaras i ett transportmedium måste blandas noggrant genom vortexning. Ta av locket försiktigt på provtagningsrören, och se upp så att inte hanskarna blir kontaminerade. Kontaminerade hanskar måste innan bearbetning av nästa prov ersättas med ett par nya. Tryck provtagningspinnen mot väggen på röret för att trycka ut vätskan. Ta upp eventuella förekommande slemrester i provet med provtagningspinnarna. Tryck ut slemmets restvätska på artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 17

provtagningspinnen mot väggen på röret. Avlägsna och släng bort provtagningspinnen med de möjliga slemresterna. Pelletera bakterierna genom centrifugation under 10 minuter vid 5.000 x g (7.500 rpm). Resuspendera bakteriepellets i 180 µl ATL-buffert (QIAamp DNA Mini Kit). Provtagningspinnar förs över direkt till en 1,5 ml mikrocentrifug rör och vortexas i 15 sekunder med 180 µl ATLbuffert. För DNA-extraktion från spermaprov späd 60 µl provmaterial med 80 µl 1 x PBS i en 1,5 ml mikrocentrifug rör. Vortexa grundligt och pipettera därefter 100 µl av utspädningen till 180 µl ATL-buffert. Blanda provet genom intervall-vortexing i 15 30 sekunder. Tillför 20 µl Proteinase K till provet, blanda detta genom vortexing och inkubera det vid 56 C i 1-12 timmar. Vortexa provet emellanåt under inkubationen för att blanda det, eller ställ det i en termomixer. Beakta att Proteinase K måste användas. QIAGEN Protease har reducerad aktivitet i närvaro av ATL-buffert. Tänk på att trycka ut vätskan ur provtagningspinnen mot väggen på röret när provtagningspinnar används. Avlägsna och släng därefter bort provtagningspinnen. Följ Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit och QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, sidan 34) efter steg 3. Säkerställ ovillkorligen att det alternativa steget 7a (13.000 rpm, tre minuter) hos protokollet för att avlägsna etanol-rester genomförs. En elueringsvolym av 50 µl AE-buffert rekommenderas. 8.2.3 Rekommendationer för isoleringen av lyophiliserade eller frystorkade prover med QIAamp DNA Mini Kit Jämvikta proven till rumstemperatur (19-23 C). Resuspendera det lyophiliserade eller frystorkade provet noggrant i 500 µl 1 x PBS genom att försiktigt vända provet för hand. Skaka 18 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

därefter provet i minst 30 minuter i rumstemperatur för att helt lösa upp det. Pipittera 200 µl av det upplösta provet till 360 µl ATL-buffert i ett 1,5 ml mikrocentrifug rör och blanda noggrant genom vortexing. Tillför provet 20 µl Proteinase K. Blanda genom vortexing och inkubera det vid 56 C i 1-12 timmar. Vortexa provet emellanåt under inkubationen för att blanda det, eller ställ det i en termomixer. Beakta att Proteinase K måste användas. QIAGEN Protease har reducerad aktivitet i närvaro av ATL-buffert. Centrifugera 1,5 ml röret kort för att undvika korskontaminering genom spill av provvätska vid öppnandet av innerlocket till kärlet. Tillför provet 400 µl AL-buffert och blanda kraftigt i 15 sekunder genom vortexing och inkubera provet i 10 minuter vid 70 C. Tillför provet 400 µl etanol, (96-100%), och blanda åter provet genom vortexing i 15 sekunder. För försiktigt över blandningen (inklusive precipat), till QIAamp spinkolonn i ett 2 ml Collection Tube utan att stänka på den övre kanten. Stäng locket och centrifugera i en minut vid 6.000 x g (8.000 rpm). Ställ därefter QIAamp spinkolonnen i en ren 2 ml Collection Tube (medföljer kitet) och släng därefter bort Collection Tuben och filtratet. Upprepa detta steg genom att föra över resten av provlösningen till Kolonnen. Följ Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit och QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, sidan 35) efter steg 6. Säkerställ ovillkorligen att det alternativa steget 7a (13.000 rpm, tre minuter) hos protokollet för att avlägsna etanol-rester genomförs. En elueringsvolym av 50 µl AE-buffert rekommenderas. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 19

8.3 Internkontroll En Internkontroll (C. trachomatis TM IC) medföljer. Med Internkontrollen kan du kontrollera både isoleringen av DNA och en eventuell inhibering av PCR (se Fig. 1). Om du vill använda Internkontrollen, tillsätter du den till isoleringen i ett förhållande på 0,1 µl per 1 µl elueringsvolym. Om du till exempel använder QIAamp DNA Mini Kit och eluerar DNA i 200 µl AE-buffert, så använder du 20 µl av Internkontrollen. Om du t. ex. eluerar i 100 µl, så använder du motsvarande 10 µl. Mängden använd Internkontroll beror enbart på elueringsvolymen. Internkontroll och bärar-rna (se 8.2 DNA-isolering) får endast tillsättas till blandning av lyseringsbuffert och provmaterial eller direkt till lyseringsbufferten. Internkontroll får inte tillsättas direkt till provmaterialet. Beakta att vid tillsättning till lyseringsbufferten blandningen av Internkontroll, lyseringsbuffert och bärar-rna då måste vara färskt tillredd och användas direkt (förvaras blandningen i rumstemperatur eller i kylskåp kan detta redan efter några timmar leda till bortfall av Internkontrollen, och till en minskning av isoleringsefficienten). Pipettera inte Internkontroll och bärar-rna direkt till provmaterialet. För att en extraktion ska kunna betraktas som framgångsrik ska Ct värdet för Internkontrollen på ABI PRISM 7000, 7700 och ABI PRISM 7900HT SDS (threshold: 0,05) vara Ct = 22 ± 3 och delta Rn >0,5. Den angivna spridningen av Ct värden baseras på variationer i instrumentet och i provisoleringen. En högre avvikelse tyder på problem i isoleringen. Den måste i så fall kontrolleras och prövas igen. Om du har några ytterligare frågor eller om du stöter på problem, kontakta vår tekniska support. Alternativt kan Internkontroll användas endast för kontroll av en eventuell PCR-inhibering (se Fig. 2). I så fall tillsätter du 0,5 µl Internkontroll per reaktion direkt till 15 µl C. trachomatis TM Master. Använd för varje PCR- 20 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

reaktion 15 µl av den så tillverkade Master Mixen * och tillsätt 10 µl av det isolerade provet. Om du förbereder en körning för flera prover, ökar du den erforderliga mängden C. trachomatis TM Master, och Internkontroll motsvarande antalet prover (se 8.5 Förberedelse av PCR). 8.4 Kvantifiering De medföljande Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4) behandlas på samma sätt som ett redan isolerat prov och används i samma volym (10 µl). Ta fram en standardkurva på ABI PRISM Sequence Detection System genom att använda samtliga fyra medföljande Kvantifieringsstandarder, definiera dem som standarder och skriv in den angivna koncentrationen (se 8.6 Programmering av ABI PRISM SDS). Import av standarkurvor från tidigare körningar är inte möjligt med programvaran ABI PRISM 7000, 7700 och 7900HT SDS. Obs!: Kvantifieringsstandarderna anges som kopior/µl. Vid omräkning av de värden som framtagits med hjälp av standardkurvan i kopior/ml provmaterial används följande formel: Resultat (kopior/ml) = resultat (kopior/l) x elueringsvolymen (l) provvolymen (ml) Tänk på att den ursprungliga provvolymen skall användas i den ovanstående formeln. Detta är att beakta när provvolymen för nukleinsyreisoleringen ändrats (t. ex. minskning genom centrifugering eller ökning genom påfyllnad för att nå den volym som krävs för isolering). Viktigt: Riktlinjer för att underlätta tolkning av kvantitativa resultat för artussystemen på ABI PRISM 7000 SDS finns på www.qiagen.com/products/bylabfocus/mdx/ (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). * Volymökningarna till följd av tillsats av Internkontroll minskas genom tillsats av PCRreaktion. Sensitiviteten hos detektionssystemet påverkas inte. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 21

8.5 Förberedelse av PCR Förbered erforderligt antal reaktionsrör eller en 96-brunnars reaktionsplatta för de planerade reaktionerna. I efterföljande tabell anges de material som rekommenderas: Artikel 96-brunnars optisk reaktionsplatta Benämning 96-Well Optical Reaction Plate 4 306 737 Tillverkare Applied Biosystems Katalognummer Fästram * Kompressionsdyna nej - Optisk självhäftande folie Optiska reaktions-rör Optical Adhesive Covers ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip 4 311 971 4 316 567 Applied Biosystems Applied Biosystems - ja ja - Optiska reaktions-rör MicroAmp Optical Tubes N8010933 Applied Biosystems ja - Optiska lock (platt) ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip 4 323 032 Applied Biosystems - nej Obs!: Användningen av reaktionsrör för optiska mätningar med välvda lock är endast tillåtet för ABI PRISM 7700 SDS-instrumentet och kräver en justering av exponeringstiden (se 8.6.2 Programmering av ABI PRISM 7700 SDS, 8.6.2.5 Viktiga extrainställningar). Observera vid beredning av PCR, att minst en Kvantifieringsstandard samt minst en negativ kontroll (Water, PCR grade) ska medtas vid varje PCRkörning. För framtagning av en standardkurva ska för varje PCR-körning samtliga medföljande Kvantifieringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) användas. Innan testet påbörjas ska alla reagenser tinas fullständigt i rumstemperatur och blandas väl (pipetteras upp och ned flera gånger eller vortexas en kort stund) och därefter kort centrifugeras. Om du med Internkontrollen vill kontrollera både isoleringen av DNA och en eventuell inhibering av PCR, ska du tillsätta Internkontroll redan vid * Vid användning av en tvådelad fästram måste reaktionsrören öppnas när de sätts in och tas ut. För att undvika kontamination härvid ska endast den undre delen av fästramen användas. 22 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

isoleringen (se 8.3 Internkontroll). Använd i så fall följande pipetteringsschema (se även den schematiska översikten i Fig. 1): 1. Beredning av Master Mix 2. Beredning av PCR-reaktion Antal prover 1 12 C. trachomatis TM Master 15 µl 180 µl C. trachomatis TM IC 0 µl 0 µl Total volym 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl vardera 15 µl Prov 10 µl vardera 10 µl Total volym 25 µl vardera 25 µl Om du vill använda Internkontroll enbart för kontroll av en PCR-inhibering, ska du tillsätta den direkt till C. trachomatis TM Master. I så fall använder du följande pipetteringsschema (se även den schematiska översikten i Fig. 2): 1. Beredning av Master Mix 2. Beredning av PCR-reaktion Antal prover 1 12 C. trachomatis TM Master 15 µl 180 µl C. trachomatis TM IC 0,5 µl 6 µl Total volym 15,5 µl * 186 µl * Master Mix 15 µl * vardera 15 µl * Prov 10 µl vardera 10 µl Total volym 25 µl vardera 25 µl Pipettera i varje reaktionrör eller i varje fördjupning på 96-brunnars reaktionsplattan 15 µl av Master Mix. Tillsätt därefter 10 µl eluat från DNA-isoleringen. Se till att båda lösningarna blandas väl genom att pipettera upp och ned flera gånger. Förslut reaktionsrören med tillhörande lock resp. vid användning av en 96-brunnars reaktionsplatta med optisk självhäftande folier (Optical Adhesive Covers). Samla den beredda reaktionsvolymen till botten av rör resp. plattor genom att centrifugera reaktionsrören (i ett förvaringsrack avsett för PCR-rör) resp. 96-brunnars reaktionsplattan i en centrifug med mikrotiterplattrotor i 30 sekunder vid 1.780 x g (4.000 rpm). Om du inte har tillgång till en sådan centrifug ska du vid beredning av PCR-reaktionerna se till att pipettera såväl Master Mix som provvolymerna på botten av reaktionsrören * Volymökningen till följd av tillsats av Internkontroll ignoreras vid beredningen av PCRreaktionen. Sensitiviteten hos detektionssystemet påverkas inte. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 23

eller reaktionsenheterna (well). Lagra reaktionsberedningarna i +4 C tills ABI PRISM SDS-instrumentet är programmerat (se 8.6 Programmering av ABI PRISM SDS) och överför sedan dessa till instrumentet. Obs!: Vid användning av optiska reaktionsrör i kombination med optiska lock ska en fästram sättas in (96-Well Tray/Retainer Set) i instrumentet (ABI PRISM 7000, 7700 och 7900HT SDS). Vid användning av en tvådelad fästram måste reaktionsrören öppnas när de sätts in och tas ut. För att undvika kontamination ska endast den undre delen av fästramen användas. Vid användning av 96-brunnars optiska reaktionsplattor i kombination med optisk självhäftande folie krävs en kompressionsdyna (Optical Cover Compression Pads). 24 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Tillsats av Internkontroll till isolering isolering blandning av lysbuffert/provmaterial + 0,1 µi IC* per 1 µl elueringsvolym 10 µl isolerat prov* 15 µl artus Master* optisk reaktionsplatta/ rör ABI PRISM SDS Fig. 1: Schematiskt arbetsförlopp för kontroll av isolering och PCRinhibering. * Vid varje pipetteringssteg är det mycket viktigt att se till att de lösningar som ska användas är helt upptinade, väl blandade och centrifugerade en kort stund. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 25

Tillsats av Internkontroll till artus Master 0,5 µl IC* 15 µl artus Master* isolering 15,5 µl Master Mix* 10 µl isolerat prov* 15 µl Master Mix* optisk reaktionsplatta/ rör ABI PRISM SDS Fig. 2: Schematiskt arbetsförlopp för kontroll av PCR-inhibering. * Vid varje pipetteringssteg är det mycket viktigt att se till att de lösningar som ska användas är helt upptinade, väl blandade och centrifugerade en kort stund. 26 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

8.6 Programmering av ABI PRISM SDS Programvaran ABI PRISM 7000, 7700 och 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) kräver ytterligare information innan PCR-körningen startas. Tillvägagångssättet vid programmeringen av instrumenten skiljer sig åt, och behandlas därför i olika kapitel. 8.6.1 Programmering av ABI PRISM 7000 SDS För detektion av C. trachomatis-dna programmerar du en profil på ABI PRISM 7000 SDS enligt följande sex arbetssteg (8.6.1.1-8.6.1.6). Alla uppgifter hänför sig till ABI PRISM 7000 SDS Software Version 1.0.1. Ytterligare information om programmering av ABI PRISM 7000 SDS finns i ABI PRISM 7000 SDS User Guide. För att få en bättre översikt är de inställningar som ska göras markerade med en svart ram i figurerna. 8.6.1.1 Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning Välj i ABI PRISM 7000 SDS under File menypunkten New och gör följande grundinställningar för det nya dokumentet (se Fig. 3). En tidigare sparad mall (SDS Template [*.sdt]) finns till förfogande i Template-listan eller genom att välja med Browse-funktionen (se 8.6.1.5 Spara PCR-körningen). Bekräfta uppgifterna (OK). Fig. 3: Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning (New Document). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 27

8.6.1.2 Framtagning/val av detektorer Med hjälp av undermenyn Detector Manager under Tools tilldelar du dokumentet motsvarande detektorfluoroforer. För detektion av C. trachomatis- DNA samt Internkontroll med hjälp av artus C. trachomatis TM PCR Kit ska de Reporter/Quencher som anges i följande tabell definieras: Detektion Reporter Quencher C. trachomatis-dna FAM TAMRA Internkontroll (C. trachomatis TM IC) VIC none För framtagning av de här detektorerna väljer du i Detector Manager nere till vänster alternativet File och därefter alternativet New. Fig. 4: Framtagning av C. trachomatisspecifik detektor (Detector Manager). Fig. 5: Framtagning av IC-specifik detektor (Detector Manager). I det fönster som nu visas definierar du (motsvarande Fig. 4 och Fig. 5) för detektion av C. trachomatis-dna Reporter/Quencher-kombinationen FAM/TAMRA, för detektion av Internkontroll väljer du kombinationen VIC/none. Genom att bekräfta uppgifterna (OK) kommer du tillbaka till Detector Manager. Markera de framtagna detektorerna och för över varje urval till Well Inspector (se Fig. 6) genom att klicka på alternativet Add to Plate Document. Stäng fönstret (Done). 28 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Fig. 6: Val av detektorer (Detector Manager). 8.6.1.3 Tilldelning av nödvändig information till plattpositioner Öppnar du nu under View alternativet Well Inspector, så hittar du detektorerna som du valde under 8.6.1.2 (se Fig. 7). Fig. 7: Tilldelning av nödvändig information till plattpositionerna (Well Inspector). Markera de reserverade plattpositionerna för detektionen av C. trachomatis- DNA. Tilldela de valda detektorerna dessa positioner genom att aktivera Usealternativet för båda detektorerna. En liten bock visas. För benämning av de olika reaktionsberedningarna väljer du motsvarande position på plattan och anger namnet under Sample Name. Tänk på att beredningar med identiska Sample Name och identisk detektortilldelning identifieras som replikat av programvaran och ett genomsnittsvärde på den kvantifierade artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 29

patogenbelastning beräknas. Välj för varje provtyp motsvarande funktion (Task) enligt följande tabell: Provtyp Funktion (Task) Koncentration (Quantity) Reporter Quencher Prov Unknown - FAM TAMRA Negativ kontroll NTC - FAM TAMRA Standard Standard se 1. Innehåll FAM TAMRA För framtagning av en standardkurva ska för varje PCR-körning samtliga medföljande Kvantifieringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) användas och tillhörande koncentrationer (se 1. Innehåll) ska anges för varje enskild standard (Quantity). Tänk på att ROX måste vara inställd som passiv referens (Passive Reference) för en PCR-körning med artus C. trachomatis TM PCR Kit. En jämn fördelning av ROX-fluoroforer på alla PCR-beredningar i ett parti genom blandning av C. trachomatis TM Master säkerställer igenkänning och att tube-to-tube-variationer (skillnader i fluorescens mellan olika PCRberedningar) avräknas, genom Sequence Detection Software (normalisering). 8.6.1.4 Framtagning av temperaturprofilen För att ange temperaturprofilen växlar du i programvaran från Setup-planet till Instrument-planet. Ange motsvarande Fig. 8 den giltiga temperaturprofilen för detektion av C. trachomatis-dna. Om du vill ta bort det sparade 50 C-steget i förinställningarna markerar du detta med hjälp av vänster musknapp och samtidigt hålla ned Shift-knappen och sedan radera med hjälp av Backspaceknappen. Kontrollera att reaktionsvolymen är inställd på 25 µl. Alternativet 9600 Emulation ska vara aktiverat och förinställningarna för Auto Increment vara oförändrade (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 30 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Fig. 8: Framtagning av temperaturprofilen. 8.6.1.5 Spara PCR-körningen Här kan du spara de angivna inställningarna (Setup) som mall, för att kunna använda dem senare i förändrad eller oförändrad form. Genom att spara inställningarna som SDS Template (*.sdt) i mappen Template Directory (Local Disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000 SDS\Templates), förinställd av Applied Biosystems, kan denna fil väljas direkt från Template Drop-downlistan i New Document-fönstret. Mallar som sparats i andra mappar måste öppnas via Browse. Innan du startar PCR-körningen måste du spara den på nytt som SDS Document (*.sds). Därmed säkerställer du att även de data som tillkommer under loppet av PCR-körningen sparas. 8.6.1.6 Starta PCR-körningen Starta PCR-körningen genom att välja alternativet Start under menypunkten Instrument eller fältet Start på Instrument-planet. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 31

8.6.2 Programmering av ABI PRISM 7700 SDS För detektion av C. trachomatis-dna programmerar du en profil på ABI PRISM 7700 SDS enligt följande sju arbetssteg (8.6.2.1-8.6.2.7). Alla uppgifter hänför sig till ABI PRISM 7700 SDS Software Version 1.9.1. Ytterligare information om programmering av ABI PRISM 7700 SDS finns i ABI PRISM 7700 SDS User`s Manual. För att få en bättre översikt är de inställningar som ska göras markerade med en svart ram i figurerna. 8.6.2.1 Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning Välj i ABI PRISM 7700 SDS under File menypunkten New Plate och gör följande grundinställningar för det nya dokumentet (se Fig. 9). Bekräfta uppgifterna (OK). Fig. 9: Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning (New Plate). 8.6.2.2 Val av fluoroforer och tilldelning av provtyp Med hjälp av Sample Type Setup (Setup-planet: Sample Type/Sample Type Setup) tilldelar du dokumentet motsvarande detektorfluoroforer och provtyp. För detektion av C. trachomatis-dna samt Internkontroll med hjälp av artus C. trachomatis TM PCR Kit ska de Reporter/Quencher som anges i följande tabell definieras: 32 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Detektion Reporter Quencher C. trachomatis-dna FAM TAMRA Internkontroll (C. trachomatis TM IC) VIC TAMRA För mätning av C. trachomatis-dna med hjälp av artus C. trachomatis TM PCR Kit väljer du enligt tabellen Reporter-färgämnet FAM. Detta gäller för både standarder (STND), prover (UNKN) och negativa kontroller (UNKN). För mätning av Internkontrollen (IPC+) definierar du VIC som Reporter. Ställ in TAMRA som Quencher. Tilldelningen av fluoroforer och provtyper i fönstret Sample Type Setup visas i Fig. 10. Fig. 10: Val av fluoroforer och tilldelning av provtyp (Sample Type Setup). Tilldelning av provtyp till en motsvarande funktion (Acronym) sker enligt följande tabell: Provtyp Funktion (Acronym) Koncentration (Quantity) Reporter Quencher Prov UNKN - FAM TAMRA Negativ kontroll UNKN - FAM TAMRA Standard STND se 1. Innehåll FAM TAMRA artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 33

8.6.2.3 Tilldelning av nödvändig information till plattpositioner När du tilldelar detektorer och provtyper till enskilda plattpositioner väljer du motsvarande fält. Öppna sedan dialogrutan Dye Layer på Setup-planet och tilldela lämplig Reporter. Aktiverar du nu popup-menyn Sample Type, så hittar du i listan som visas de provtyper som tilldelats Reporter i Sample Type Setup (se Fig. 11). Välj ut passande provtyp (se tabell under 8.6.2.2) och bestäm med hjälp av Dye Layers och menyn Sample Type tilldelningen till de övriga plattpositionerna. I fältet Sample Name kan varje prov tilldelas ett namn. För fält som är definierade som Replicate (angivandet av referensprovets namn i kolumnen Replicate) blir ett genomsnittsvärde på den kvantifierade patogenbelastningen och dess standardavvikelse beräknad av programvaran. Fig. 11/12: Tilldelning av nödvändig information till plattpositionerna. För framtagning av en standardkurva ska för varje PCR-körning samtliga medföljande Kvantifieringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) användas och tillhörande koncentrationer (se 1. Innehåll) ska anges för varje enskild standard (Quantity, se Fig. 12). Detta är dock endast möjligt om positionerna med standard först har definierats som sådana med hjälp av menyn Sample Type. 8.6.2.4 Framtagning av temperaturprofilen Om du vill ange temperaturprofil växlar du till Thermal Cycler Conditionsmenyn på Setup-ytan. Ange motsvarande Fig. 13 den giltiga temperaturprofilen för detektion av C. trachomatis-dna. Kontrollera att reaktionsvolymen är inställd på 25 µl. Förinställningarna av Ramp-tider och 34 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Auto Increment förblir oförändrade (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). Fig. 13: Framtagning av temperaturprofilen. Vidare finns i Thermal Cycler Conditions-menyn alternativet Show Data Collection. Om du väljer det här alternativet kommer du till fönstret som visas i Fig. 14. Varje Ramp- och Plateau-temperatur är försedd med en symbol för datainsamling (Data Collection Icon), som visar insamlingen av data för den aktuella tidpunkten under körningen. Ta bort alla symboler fram till tidpunkten för Annealing-Extension-steget (Stage2/Step2) genom att klicka på dem, för att slippa onödiga fluorescensmätningar. Genom detta hålls körningstiden och datamängden så liten som möjligt. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 35

Fig. 14: Datainsamling (Data Collection). 8.6.2.5 Viktiga extrainställningar För inställning exponeringstiden (exitation av fluoroforer) samt för val av Pure Spectra/Background-filer växlar du från Setup-planet till Analysis-planet. Välj den nu aktiverade underpunkten Advanced Options, som finns i menyn Instrument under Diagnostics. Utför inställningarna enligt Fig. 15. Genom att inaktivera valfunktionen Spectra Components (Analysis) används vid en ny utvärdering av analyserade körningar automatiskt de kalibreringsdata som vid tidpunkten för datagenerering finns i mappen Spectra Components. För en analys av gamla körningar med hjälp av nya inlästa Spectra Components aktiverar du de båda fälten. Tänk på att ROX måste vara inställd som passiv referens (Reference) för en PCR-körning med artus C. trachomatis TM PCR Kit. En jämn fördelning av ROX-fluoroforer på alla PCR-beredningar i ett parti genom blandning av C. trachomatis TM Master, säkerställer igenkänning och att tube-to-tube-variationer (skillnader i fluorescens mellan olika PCR-beredningar) avräknas, genom Sequence Detection Software (normalisering). 36 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Obs!: Exponeringstiden (Exposure Time) vid användning av 96-brunnars reaktionplattor för optiska mätningar tillsammans med optisk självhäftande folie (Optical Adhesive Covers) eller optiska reaktionsrör med platt lock uppgår till tio millisekunder. Om du använder optiska reaktionsrör med välvda lock, ska du ställa om tidsangivelsen till 25 millisekunder. Fig. 15: Viktiga extrainställningar (Advanced Options). 8.6.2.6 Spara PCR-körningen Här kan du spara de angivna inställningarna (Setup) som mall, för att kunna använda dem senare i förändrad eller oförändrad form. Spara den här filen i Stationary File Format. Innan du startar den aktuella programmerade PCRkörningen måste du spara den på nytt i Normal File Format. Därmed säkerställer du att även de data som tillkommer under loppet av PCRkörningen sparas. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 37

8.6.2.7 Starta PCR-körningen Starta PCR-körningen genom att välja alternativet Run under menypunkten Instrument eller fältet Run på Analysis-planet. 38 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

8.6.3 Programmering av ABI PRISM 7900HT SDS För detektion av C. trachomatis-dna programmerar du en profil på ABI PRISM 7900HT SDS enligt följande sex arbetssteg (8.6.3.1-8.6.3.6). Alla uppgifter hänför sig till ABI PRISM 7900HT SDS Software Version 2.1. Ytterligare information om programmering av ABI PRISM 7900HT SDS finns i ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. För att få en bättre översikt är de inställningar som ska göras markerade med en svart ram i figurerna. 8.6.3.1 Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning Välj i ABI PRISM 7900HT SDS under File menypunkten New och gör följande grundinställningar för det nya dokumentet (se Fig. 16). En tidigare sparad mall (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) finns till förfogande i Template-listan eller genom att välja med Browse-funktionen (se 8.6.3.5 Spara PCR-körningen). Bekräfta uppgifterna (OK). Obs!: artus C. trachomatis TM PCR Kit kan inte användas tillsammans med plattformat 384 för ABI PRISM 7900HT SDS. Fig. 16: Förinställningar vid framtagning av en ny PCR-körning (New Document). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 39

8.6.3.2 Framtagning/val av detektorer Med hjälp av undermenyn Detector Manager under Tools (alternativ: välj Setup-planet/Add Detector-funktion) tillordnar du dokumentet motsvarande detektorfluoroforer. För detektion av C. trachomatis-dna samt Internkontroll med hjälp av artus C. trachomatis TM PCR Kit ska de Reporter/Quencher som anges i följande tabell definieras: Detektion Reporter Quencher C. trachomatis-dna FAM TAMRA Internkontroll (C. trachomatis TM IC) VIC Non Fluorescent För framtagning av de här detektorerna väljer du i Detector Manager nere till vänster alternativet New. Fig. 17: Framtagning av C. trachomatisspecifik detektor (Detector Manager). Fig. 18: Framtagning av IC-specifik detektor (Detector Manager). I det fönster som nu visas definierar du (enligt Fig. 17 och Fig. 18) för detektion av C. trachomatis-dna Reporter/Quencher-kombinationen FAM/TAMRA, för detektion av Internkontroll väljer du kombinationen VIC/Non Fluorescent. Genom att bekräfta uppgifterna (OK) kommer du tillbaka till Detector Manager. Markera de framtagna detektorerna och för över varje urval till Setup-planet (se Fig. 19) genom att klicka på alternativet Copy to Plate Document. Stäng fönstret (Done). 40 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Fig. 19: Val av detektorer (Detector Manager). 8.6.3.3 Tilldelning av nödvändig information till plattpositioner När du stängt Detector Manager (Done) hittar du de detektorer som du valt under 8.6.3.2 i tabellform på Setup-planet (Well Inspector) (se Fig. 20). Fig. 20: Tilldelning av nödvändig information till plattpositionerna. Markera de reserverade plattpositionerna för detektionen av C. trachomatis- DNA. Tilldela de valda detektorerna dessa positioner genom att aktivera Usealternativet för båda detektorerna. Ett kryss visas. För benämning av de olika reaktionsberedningarna väljer du motsvarande position på plattan och anger namnet under Sample Name. Tänk på att beredningar med identiska Sample Name och identisk detektortilldelning identifieras som replikat av programvaran och ett genomsnittsvärde på den kvantifierade patogenbelastning beräknas. Välj för varje provtyp motsvarande funktion (Task) enligt följande tabell: artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 41

Provtyp Funktion (Task) Koncentration (Quantity) Reporter Quencher Prov Unknown - FAM TAMRA Negativ kontroll NTC - FAM TAMRA Standard Standard se 1. Innehåll FAM TAMRA För framtagning av en standardkurva ska samtliga medföljande Kvantifieringsstandarder (C. trachomatis TM QS 1-4) användas för varje PCR-körning och de tillhörande koncentrationerna (se 1. Innehåll) ska anges för varje enskild standard i fältet Quantity. Tänk på att ROX måste vara inställd som passiv referens (Passive Reference) för en PCR-körning med artus C. trachomatis TM PCR Kit. En jämn fördelning av ROX-fluoroforer på alla PCR-beredningar i ett parti genom blandning av C. trachomatis TM Master säkerställer igenkänning och att tube-to-tube-variationer (skillnader i fluorescens mellan olika PCR-beredningar) avräknas genom Sequence Detection Software (normalisering). 8.6.3.4 Framtagning av temperaturprofilen För att ange temperaturprofilen växlar du i programvaran från Setup-planet till Instrument-planet. Ange motsvarande Fig. 21 den giltiga temperaturprofilen för detektion av C. trachomatis-dna. Kontrollera att reaktionsvolymen är inställd på 25 µl. Alternativet 9600 Emulation ska vara aktiverat, förinställningarna för Ramp-tid och Auto Increment vara oförändrade (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 42 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Fig. 21: Framtagning av temperaturprofilen. Vidare finns på Instrument-planet alternativet Data Collection. Om du väljer det här alternativet kommer du till fönstret som visas i Fig. 22. Varje Rampoch Plateau-temperatur är försedd med en symbol för datainsamling (Data Collection Icon), som visar insamlingen av data för den aktuella tidpunkten under körningen. Ta bort alla symboler genom att klicka på dem, fram till tidpunkten för Annealing-Extension-steget (Stage2/Step2), för att slippa onödiga fluorescensmätningar och därigenom göra körningstiden och datamängden så liten som möjligt. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 43

Fig. 22: Datainsamling (Data Collection). 8.6.3.5 Spara PCR-körningen Här kan du spara de angivna inställningarna (Setup) som mall, för att kunna använda dem senare i förändrad eller oförändrad form. Genom att spara inställningarna som ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) i mappen Template Directory ([D:]\Program Files\Applied Biosystems\SDS 2.1\ Templates), förinställd av Applied Biosystems, kan denna fil väljas direkt från Template-listan i New Document-fönstret. Mallar som sparats i andra mappar måste öppnas via Browse. Innan du startar PCR-körningen måste du spara den på nytt som ABI PRISM SDS Document (*.sds). Därmed säkerställer du att även de data som tillkommer under loppet av PCR-körningen sparas. 8.6.3.6 Starta PCR-körningen Starta PCR-körningen genom att välja alternativet Start under menypunkten Instrument. 44 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

9. Tolkning av resultat En föreliggande giltig kalibrering av färgerna (Pure Spectra Component File) och bakgrunden (Background Component File) krävs ovillkorligen innan instrumentet tas i drift. Följande kalibreringsfilerna är nödvändiga för en exakt beräkning av resultaten: Samtliga instrumentrelaterade störsignaler som påverkar mätningen elimineras av Sequence Detection Software från ABI PRISM Sequence Detection Systems med hjälp av Background Component Files. Därtill uppträder vid flerfärgs-analyser interferenser mellan emissionsspektran av de enskilda fluorescensfärgerna. Programvaran ABI PRISM SDS kompenserar dessa interferenser genom en beräkning med de spektraldata för de individuella färgerna som sparats i Pure Spectra Component File. Tilldelningen av de fluorescensdata som samlats i det totala mätbara spektrumet under PCR-körningen till de programmerade detektorerna utför programvaran även med hjälp av Pure Spectra Components. Därefter delas förmedlade fluorescensdata för de enskilda fluoroforera för att avräkna tubeto-tube-variationer (fluorescensskillnader mellan olika PCR-beredningar) genom signalen för passiv referens (ROX). De på detta sätt normaliserade signalerna kan utvärderas med hjälp av Amplification Plot. De kalibreringsfiler som används vid en utvärdering av en PCR-körning sparas automatiskt när du sparar körningen. Om inga kalibreringsfiler finns installerade skapar du dessa filer enligt instruktionerna i ABI PRISM SDS User Guide/Manual. Om du har fler än ett artus TM PCR-system integrerat i din PCR-körning (beakta temperaturprofilen), ska dessa testsystem analyseras separat. Prover med identisk benämning (Sample Name) och detektortilldelning identifieras automatiskt som replikat av ABI PRISM 7000 och 7900HT SDS Software och ett genomsnittsvärde på kvantifierade patogenbelastning beräknas. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 45

Följande resultat kan förekomma: 1. En FAM-fluorescenssignal detekteras. Analysresultatet är positivt. Provet innehåller C. trachomatis-dna. I detta fall är detektion av en VIC-fluorescenssignal (Internkontroll) oväsentlig, eftersom höga initiella koncentrationer av C. trachomatis-dna (positives FAM-fluorescenssignal) kan leda till en reducerad eller utebliven fluorescenssignal för Internkontrollen (konkurrens). Om en positiv signal inträffar efter cykel 40, rekommenderas att upprepa PCRkörningen. Vid upprepat positivt resultat skall provet betraktas som positivt. Vid ett negativt resultat kan ingen entydigt utsago göras. I detta fall är det lämpligt att åter gör en isolering av provet. 2. Ingen FAM-fluorescenssignal detekteras, utan endast en VIC-fluorescenssignal (signal för Internkontroll). Inget C. trachomatis-dna kan påvisas i provet. Det kan därför anses som negativt. Vid negativ C. trachomatis-pcr utesluter detektionen av Internkontroll-signalen möjligheten av en PCR-inhibering. 3. Varken en FAM-fluorescenssignal eller en VIC-fluorescenssignal detekteras. Något diagnosresultat kan inte erhållas. Information om felkällor och hur dessa åtgärdas finns i 10. Felsökning. Exempel på positiva och negativa PCR-reaktioner finns i figurerna 23/24 (ABI PRISM 7000 SDS), 25/26 (ABI PRISM 7700 SDS) och 27/28 (ABI PRISM 7900HT SDS). 46 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Fig. 23: Detektion av Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4) genom detektion av en FAM-fluorescenssignal (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (negativ kontroll). Fig. 24: Detektion av Internkontrollen (IC) genom detektion av en VICfluorescenssignal (ABI PRISM 7000 SDS) med samtidig amplifiering av Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativ kontroll). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 47

Fig. 25: Detektion av Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4) genom detektion av en FAM-fluorescenssignal (ABI PRISM 7700 SDS). NTC: non-template control (negativ kontroll). Fig. 26: Detektion av Internkontrollen (IC) genom detektion av en VICfluorescenssignal (ABI PRISM 7700 SDS) med samtidig amplifiering av Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativ kontroll). 48 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Fig. 27: Detektion av Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4) genom detektion av en FAM-fluorescenssignal (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (negativ kontroll). Fig. 28: Detektion av Internkontrollen (IC) genom detektion av en VICfluorescenssignal (ABI PRISM 7900HT SDS) med samtidig amplifiering av Kvantifieringsstandarderna (C. trachomatis TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativ kontroll). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 49

10. Felsökning Ingen FAM-fluorescenssignal för de positiva kontrollerna (C. trachomatis TM QS 1-4): Valet av detektorfärgämen vid analysen av PCR-data motsvarar inte angivelserna i protokollet. Välj för analysen av data detektorfärgämnet FAM för analytisk C. trachomatis-pcr och detektorfärgämnet VIC för PCR av Internkontrollen. Inställningen under Options för de data som ska utvärderas (Extension Phase Data Extraction) stämmer inte överens med inställningarna för Data Collection (för ABI PRISM 7700 SDS se 8.6.2.4 Framtagning av temperaturprofilen, för ABI PRISM 7900 HT SDS se 8.6.3.4 Framtagning av temperaturprofilen). Analysera PCR-körningen med korrigerade inställningar och upprepa utvärderingen (Analysis). Programmeringen av temperaturprofilen för ABI PRISM Sequence Detection Systems var felaktig. Jämför temperaturprofilen med angivelserna i protokollet (se 8.6 Programmering av ABI PRISM SDS). Felaktig sammanställning av PCR-reaktionen. Kontrollera arbetsstegen med hjälp av pipetteringsschemat (se 8.5 Förberedelser av PCR) och upprepa, om nödvändigt, PCR. Förvaringsanvisningarna för en eller flera av kit-komponenterna har inte följts enligt föreskrifterna i 2. Förvaring, eller hållbarhetsdatumet för artus C. trachomatis TM PCR Kit har löpt ut. Kontrollera både förvaringsanvisningar så väl som datum för reagenserna hållbarhet (se kit-etikett) och använd, om nödvändigt, ett nytt kit. Svag eller utebliven signal för Internkontrollen (VIC-fluorescenssignalen: varians större än Ct=22 ± 3 och/eller ett delta Rn värde <0,5 [ingen sigmoidalkurva]; threshold 0,05) samtidigt som C. trachomatis-pcr specifika FAM fluorescenssignalen saknas: 50 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

PCR-förhållandena motsvarar inte protokollet. Kontrollera PCR-förhållandena (se ovan) och upprepa, om nödvändigt, PCR med korrigerade inställningar. PCR har inhiberats. Kontrollera att du har använt ett reningsförfarande som rekommenderas av oss (se 8.2 DNA-isolering) och var noga med att följa tillverkarens anvisningar exakt. Förvissa dig om att vid DNA-isoleringen det rekommenderade extra centrifugeringssteget för fullständigt avlägsnande av etanol-rester genomfördes innan elueringen (se 8.2 DNA-isolering). Det förekommer DNA-förluster orsakade av reningsförfarandet. Har Internkontrollen tillsatts för isolering kan en utebliven signal för Internkontrollen betyda att det föreligger DNA-förluster orsakade av reningsförfarandet. Kontrollera att du har använt ett reningsförfarande som rekommenderas av oss (se 8.2 DNA-isolering) och var noga med att följa tillverkarens anvisningar. Förvaringsanvisningarna för en eller flera av kit-komponenterna har inte följts enligt föreskrifterna i 2. Förvaring, eller hållbarhetsdatumet för artus C trachomatis TM PCR Kit har löpt ut. Kontrollera både förvaringsanvisningar så väl som datum för reagenserna hållbarhet (se kit-etikett) och använd, om nödvändigt, ett nytt kit. De negativa kontrollerna har en FAM-fluorescenssignal i analytisk PCR. En kontamination föreligger under PCR förberedelserna. Upprepa PCR med oanvända reagenser i replikat Förslut de enskilda PCR-reaktionsrören om möjligt direkt efter tillsats av de undersökta proverna. Pipettera alltid positiv kontroll sist. Försäkra er om att arbetsplatser och apparater dekontamineras regelbundet. En kontamination orsakad av isoleringen föreligger. Upprepa isoleringen och PCR av de undersökta proverna med hjälp av oanvända reagenser. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 51

Försäkra er om att arbetsplatser och apparater dekontamineras regelbundet. Om du skulle ha ytterligare frågor eller om andra problem uppträder, ber vi dig kontakta vår tekniska service. 11. Specifikationer 11.1 Analytisk sensitivitet För bestämning av den analytiska sensitiviteten hos artus C. trachomatis TM PCR Kit bereddes en standard-spädningsserie från 100 till nominellt 0,0625 C. trachomatis-kopieekvivalenter * /µl. Denna analyserades sedan med hjälp av artus C. trachomatis TM PCR Kit med ABI PRISM 7000, 7700 och 7900HT Sequence Detection Systems. Undersökningarna genomfördes för varje instrument under tre olika dagar i form av åttafaldiga bestämningar. Resultaten har tagits fram med hjälp av en probitanalys. Den grafiska utvärderingen (ABI PRISM 7000 SDS) framgår av Fig. 29. Detektionsgräns (p = 0,05) ABI PRISM 7000 SDS 0,3 kopior/µl ABI PRISM 7700 SDS 0,2 kopior/µl ABI PRISM 7900HT SDS 0,2 kopior/µl Detta innebär att vid 95 % konfidens 0,3 kopior/µl (ABI PRISM 7000 SDS), 0,2 kopior/µl (ABI PRISM 7700 SDS) resp. 0,2 kopior/µl (ABI PRISM 7900HT SDS) kan detekteras. * För den standard som används här rör det sig om en klonad PCR-produkt, vars koncentration har bestämts spektral- och fluorescensfotometriskt. 52 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Probitanalys: Chlamydia trachomatis (ABI PRISM 7000 SDS) Fig. 29: Den analytiska Sensitiviteten hos artus C. trachomatis TM PCR Kit (ABI PRISM 7000 SDS). 11.2 Specificitet Specificiteten för artus C. trachomatis TM PCR Kit garanteras i första hand genom val av primers och prober samt val av stringenta reaktionsförhållanden. Primers och prober kontrolleras med en sekvensjämförelse-analys med avseende på eventuella homologier mot alla i genbanker publicerade sekvenser. Möjligheten att detektera alla relevanta serovarer säkerställs dels genom ett databasalignment, dels genom en PCR på ABI PRISM 7000 SDS med följande serovarer (se Tabell 1). artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 53

Tabell 1: Specifitetstest av relevanta serovarer. Chlamydia Serovarer Referenskälla C trachomatis (FAM) Internkontroll (VIC) C. trachomatis A ATCC VR-571B + + C. trachomatis B ATCC VR-573 + + C. trachomatis Ba ATCC VR-347 (prep 1) + + C. trachomatis C ATCC VR-872 + + C. trachomatis D ATCC VR-885 + + C. trachomatis E ATCC VR-348B + + C. trachomatis F ATCC VR-346 + + C. trachomatis G ATCC VR-878 + + C. trachomatis H ATCC VR-879B + + C. trachomatis I ATCC VR-880 + + C. trachomatis J ATCC VR-886 + + C. trachomatis K ATCC VR-887 + + C. trachomatis LGV I ATCC VR-901B + + C. trachomatis LGV II ATCC VR-902B + + C. trachomatis LGV II ATCC VR-577 + + C. trachomatis LGV III ATCC VR-903 + + ATCC: American Type Culture Collection Valideringen av specifiteten genomfördes även på 100 olika C. trachomatis negativa urinproverprover och 30 negativa utstryksprover, vilka inte genererade någon signal med de C. trachomatis specifika primers och prober som finns i C. trachomatis TM Master. För bestämning av specifiteten av artus C. trachomatis TM PCR Kit undersöktes den i Tabell 2 angivna kontrollgruppen på korsreaktivitet. Ingen av de testade patogenerna var reaktiv. 54 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Tabell 2: Kitets specifitetstest med eventuella korsreaktiva patogener. Kontrollgrupp C. trachomatis (FAM) Internkontroll (VIC) Salmonella typhimurium - + Staphyllococcus aureus - + Peptostreptococcus productus - + Neisseria gonorrhoeae - + Acinetobacter spp. - + Escherichia coli - + Klebsiella pneumoniae - + Gardnerella vaginalis - + Streptococcus agalactiae - + Streptococcus pyogenes - + Proteus mirabilis - + Haemophilus influenzae - + Herpes simplex 1 och 2 - + Candida albicans - + Candida glabrata - + Chlamydia psittaci - + Chlamydia pneumoniae - + 11.3 Precision Precisionsdatan för artus C. trachomatis TM PCR Kit tillåter framtagandet av totalvariansen av testsystemet. Denna totalvarians består av Intra-Assayvariabilitet (variabilitet mellan prover av samma koncentration inom en undersökningsomgång), Inter-Assay-variabilitet (variabilitet av analysresultat genererade på olika instrument av samma typ av olika användare innom ett laboratorium) och Inter-Batch-variabilitet (variabilitet av analysresultat vid användandning av olika batcher). Därvid beräknas standardavvikelsen, variansen och variationskoefficienten, såväl för det patogen-specifika som för Internkontroll-PCR. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 55

Dessa data togs fram för artus C. trachomatis TM PCR Kit med hjälp av Kvantifieringsstandarden med den minsta koncentration (QS 4; 10 kopior/µl). Undersökningarna utfördes i form av åttafaldiga bestämningar. Precisionsdatans resultat blev framtagna med hjälp av amplifikationskurvans Ct-värden (Ct: threshold cycle, se Tabell 3) och de därifrån förmedlade kvantitativa värdena togs fram i kopior/µl (se Tabell 4). Således utgör den totala statistiska spridningen hos ett prov med den benämda koncentrationen 2,80 % (Ct) resp. 13,41 % (konc.), för detektion av Internkontrollen 2,46 % (Ct). Dessa värden baseras på summan av alla enskilda bestämda variabiliteter. Tabell 3: Precisionsdata baserade på Ct-värdena. Intra-Assay-variabilitet: C. trachomatis TM QS 4 Intra-Assay-variabilitet: Internkontroll Inter-Assay-variabilitet: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Assay-variabilitet: Internkontroll Inter-Batch-variabilitet: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Batch-variabilitet: Internkontroll Totalvarians: C. trachomatis TM QS 4 Totalvarians: Internkontroll Varians Standardavvikelse Variationskoefficient [%] 0,36 0,13 1,20 0,22 0,05 1,01 0,37 0,13 1,22 0,23 0,05 1,08 0,76 0,58 2,44 0,68 0,46 3,13 0,86 0,74 2,80 0,53 0,28 2,46 56 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

Tabell 4: Precisionsdata baserade på de kvantitativa värdena (i kopior/µl). Intra-Assay-variabilitet: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Assay-variabilitet: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Batch-variabilitet: C. trachomatis TM QS 4 Totalvarians: C. trachomatis TM QS 4 Varians Standardavvikelse Variationskoefficient [%] 0,89 0,79 8,86 1,64 2,68 16,19 1,26 1,58 12,46 1,35 1,83 13,41 11.4 Robusthet Undersökningen av robustheten tjänar till att förmedla den totala felfrekvensen för artus C. trachomatis TM PCR Kit. Härför blandades 100 C. trachomatis negativa urinprover med 1 kopia/µl elutionsvolym C. trachomatis-kontroll-dna (ca. trefaldig koncentration av den analytiska sensitivitetsgränsen), samt 30 utstryk med 1 kopia/µl. Alla urin- och utstryksproven isolerades med QIAamp Viral RNA Mini Kit (se 8.2 DNA-isolering) och analyserades med artus C. trachomatis TM PCR Kit. Felfrekvensen för C. trachomatis var 0 % för alla proven. Internkontrollens robusthet prövades dessutom genom isolering och analys av 100 C. trachomatis negativa urinprover och 60 negativa utstryk. Felfrekvensen var 0 %. Inhibering kunde inte iakttas. Robustheten för artus C. trachomatis TM PCR Kit är således 99 %. 11.5 Reproducerbarhet Data för reproducerbarhet har insamlats för regelbunden utvärdering av prestanda för artus C. trachomatis TM PCR Kit samt jämförelse av prestanda med andra produkter, vilket uppfylls genom deltagande i provningsjämförelser. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 57

11.6 Diagnostisk utvärdering artus C. trachomatis TM PCR Kit i kombination med ABI PRISM 7000 SDS jämfördes i en studie med LCx C. trachomatis Assay * och APTIMA Combo 2 C. trachomatis Assay *. 150 retrospektiva utstryksprover (50 urethral-, 50 cervix- och 50 vulvautstryk) och 100 retrospektiva urinprov (50 manliga och 50 kvinnliga) undersöktes. Alla proven testades vid ett tidigare tillfälle med LCx och APTIMA Combo 2 Assay inom ramen för rutindiagnostik. För analysen blev proven bearbetade enligt tillverkarens angivelser. I anslutning lagrades provmaterialen fram till tidpunkten för analys med artus C. trachomatis TM PCR Kit i -20 C. Analysen föregicks av en DNA-isolering med QIAamp Viral RNA Mini Kit. De retrospektiva urin- och utstryksprov resulterade i en diagnostisk sensitivitet hos artus C. trachomatis TM PCR Kit av 99,2 % och en specificitet av 98,4 %. Inhibitationsfrekvensen låg på 0 %. Resultaten visas i Tabell 5. Tabell 5: Reslultat av jämförande valideringsstudie. Urethralutstryk Cervixutstryk Vulvautstryk Urinkvinnligt Urinmannligt Antalet prover Antal positiva prover (framtaget med LCx /APTIMA Combo 2 Assays) 50 50 % 50 50 % 50 50 % 50 50 % 50 50 % Totalt 250 50 % I jämförelse med LCx (artus/lcx ) I jämförelse med Aptima Combo 2 (artus/aptima Combo 2 ) Sensitivitet Specificitet Sensitivitet Specificitet 100 % (25/25) 100 % (25/25) 96 % (24/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 99,2 % (124/125) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 92 % (23/25) 100 % (25/25) 98,4 % (123/125) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 96 % (24/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 99,2 % (124/125) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 92 % (23/25) 100 % (25/25) 98,4 % (123/125) * LCx C. trachomatis Assay baserar på Ligase-kedje-reaktion (LCR) teknologin, APTIMA Combo 2 Assay på transcription mediated amplification (TMA). 58 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007

12. Särskild information om produktanvändning Samtliga reagenser är endast avsedda att användas för in vitrodiagnostik. Produkten ska användas av personal som fått särskilda instruktioner och har utbildning i in vitro-diagnostik (EN375). För att erhålla optimala PCR-resultat är det mycket viktigt att protokollet följs exakt. Använd inga komponenter efter det utgångsdatum som anges på förpackningen och etiketterna. Utgångna reagenser får inte användas. 13. Säkerhetsinformation Säkerhetsinformation för artus C. trachomatis TM PCR Kit hittar du i tillhörande säkerhetsdatablad (material safety data sheets, MSDS). Detta hittar du som kompakt och användarvänlig PDF-fil under www.qiagen.com/support/msds.aspx. 14. Kvalitetskontroll Enligt QIAGENs certifierade kvalitets-managment-system ISO 9001 och ISO 13485 testades varje tillverkningssats artus C. trachomatis TM PCR Kit mot fastlagda specifikationer, för att garantera en enhetlig produktkvalitet. 15. Referenser (1) Eickhoff M, Laue T, Ruckes T, Cramer SO, Krupp G, Tiemann C. Ultra- Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Real-Time-PCR in the LightCycler using SYBR Green Technology or 5 -Nuclease Probes. Clin. Lab. 2003; 49: 217 225. (2) Mackay IM. Real-Time-PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): 190-212. artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007 59

16. Symbolförklaring Används före Tillverkningssatsnummer Tillverkare Beställningsnummer Materialnummer Handbok Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik <N> Innehållet räcker för <N> test Temperaturintervall Kvantifieringsstandard Internkontroll 60 artus C. trachomatis TM PCR Kit 12/2007