11-13 december 2006 Christina Fjæraa Doktorand, avd för kemi och biomedicinsk vetenskap Karlstads Universitet Christina.fjaeraa@kau.se 054-7001687 Immunologi Laboration; ej organspecifika autoimmuna sjukdomar. Partikelagglutinationtest för reumatoid faktor (RAPA) Antinukleära antikroppar (ANA) 1
RAPA Referenser Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt s essential immunology (eleventh edition). Kapitel, 6, 7 och 18. Lea, Tor: Basal og klinisk immunologi, kapitel 17. Centralsjukhuset i Karlstad. Fujirebio Inc. Produktblad, Seroida -RA. Inledning Reumatoid artrit (RA) är en kronisk inflammationssjukdom i leder och bindväv. Symptomen är stelhet och smärta, till en början i fingrarna, och sedan i alla kroppens leder. Ledkapslarna förtjockas, lederna deformeras och ledhinnorna inflammeras. Sjukdomen drabbar människor i alla åldrar, och förekommer 3 gånger så ofta hos kvinnor som hos män. Undersökningar av ledvävnad och ledvätska hos patienterna visar tydliga tecken på immunologisk aktivitet. Ett viktigt laboratoriefynd vid RA är förekomst av Reumatoid faktor (RF). RF är en autoantikropp som binder till Fc- delen av IgG- molekyler. Bindningen till immunkomplex eller aggregat (denaturerat Ig) är bättre än den till nativt monomert IgG. RF kan vara av IgM-, IgGeller IgA- typ. RF förekommer hos över 80 % av alla patienter med RA och kan påvisas med laboratorietestet RAPA. Förkortningen RAPA står för SEROID-RA, en PArtikelagglutionationstest for Rheumatoid faktor (RF). RAPA- testet är en indirekt agglutinationstest. Gelatinpartiklar har klätts med denaturerat kanin- IgG. När serumprov från patienter med Rheumatoid faktor (RF) blandas med partiklarna sker en agglutination. 2
Material 10 stk patientprover (serum). Inaktiverade vid 56ºC, 35-60 minuter. I kit från kommersiell tillverkare finns: - PBS = reagens B = spädningsreagens. - Positiv kontroll. - Negativ kontroll. - Sensiterade partiklar (blå lösning, märkt C) OBS: Färdigt spädd i lösning A. - Osensiterade partiklar (blå lösning, märkt D) OBS: Färdigt spädd i lösning A. Övrigt som behövs för utförande: - 1 U-bottnad platta/ grupp. - Aluminiumfolie till övertäckning av plattan. Utförande Märk en U-formad 96-hålsplatta: A B C D E F G H +K -K P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1. Tillsätt 100 µl PBS i brunn A2- A12. Var noga med att det inte bildas luftbubblor. 2. Tillsätt 25 µl PBS till brunn C1-H1, B2-H2, B3-H3, B4- H4 osv. till och med brunnarna B12- H12. Undvik bubblor! 3. Kontrollera att alla brunnar förutom A1 och B1 nu har PBS i sig, antingen 100 µl (brunnar i A- raden), eller 25 µl (övriga brunnar). Lägg plattan mot en vit bakgrund, t.ex. Ett A4- papper så syns det tydligare. 3
4. Blanda kontrollerna och proverna genom att vända upp och ner några gånger. 5. Tillsätt 25 µl positiv kontroll i brunn B1 och C1. Var noga med att det inte bildas luftbubblor. I stället för att pipettera upp och ner för att blanda: skaka försiktigt plattan (knacka lite försiktigt med handen på plattans sida, försiktigt så att inget åker ur brunnarna!) 6. Titrera med 25 µl. Detta innebär att du från brunn C1 suger upp 25 µl av blandningen positiv kontroll och PBS och pytsar i brunn D1. Blanda genom att suga upp och pytsa ut 3-4 gånger. (Försök att undvika bubblor!) Sug upp 25 µl från brunn D1 och pytsa över i brunn E1. Blanda och fortsätt på samma sätt tills du kommer till brunn H1. du avslutar genom att suga upp 25 µl ur brunn H1 och kasta bort. Positiv kontroll är spätt 1/10 i kitet. Räkna ut serumspädningen i brunn B1-H1. 7. Tillsätt 25 µl negativ kontroll till brunn A2. Skaka försiktigt plattan som ovan. Titrera med 25 µl från A2 till brunn B2 till brunn C2 osv. till och med brunn H2. (Som för positiv kontroll). Räkna ut serumspädningen i brunn A2-H2. 8. Tillsätt 25 µl patientprov 1 till brunn A3. Skaka försiktigt plattan som ovan. Titrera med 25 µl från A2 till brunn B2 till brunn C2 osv. till och med brunn H2 som ovan. Räkna ut serumspädningen i brunn A3-H3. 9. Upprepa för samtliga patientprov. (Patientprov 2 i brunn A4, titrera med 25 µl till och med brunn H4, tillsätt patientprov 3 i brunn A5, titrera till och med brunn H5 osv..) Räkna ut serumspädningen i brunnarna. 10. Blanda och tillsätt 25 µl osensiterade gelatinpartiklar till brunnarna i B- raden. 11. Blanda och tillsätt 25 µl sensiterade gelatinpartiklar till brunnarna i raderna C-H. 12. Skaka försiktigt plattan (som ovan). Inkubera i rumstemperatur 3 timmar (Alternativt över natt om klockan är mycket). Räkna ut slutspädningen i alla brunnarna. 4
Avläsning och redovisning Reaktion Utseende - Kompakt knapp i botten på brunnen. +/- Liten ring i botten på brunnen. + Stor ring/ matta av agglutinerade partiklar i stora delar av brunnen. ++ Matta av agglutinerade partiklar täcker hela brunnen. Läs av och se om det har inträffat en agglutination. Vad har hänt i brunnarna? Försök att beskriva både en positiv och en negativ reaktion. Bestäm titrarna för positiv kontroll och patientproven samt ange om det är en specifik reaktion. För att ett patientprov skall svaras ut skall det ha skett en positiv reaktion i minst spädning 1/40. Har du något prov som uppfyller dessa kriterier? Dessa prov svaras ut till kliniken som positiva i spädning 1/?. OBS: I denna analysmetod räknas inte serumspädningen utan slutspädningen. (Det bör poängteras att det är väldigt ovanligt att man anger slutspädning och inte serumspädning, men enligt tillverkarna av kitet till testen skall man ange svaret i slutspädning. 5
ANA Referenser Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt s essential immunology (eleventh edition). Kapitel, 6, 7 och 18. Lea, Tor: Basal og klinisk immunologi, kapitel 17. Centralsjukhuset i Karlstad. Immunoconcepts Inc. Produktblad, ANA. Inledning Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en systemisk autoimmunsjukdom. Symptomen är hög feber, trötthet, hudförändringar, polyartrit, exsudat i lung- hjärtsäck och glomerulonefrit. Man finner även relativt symptomfattiga sjukdomsbilder med enbart ledvärk. Symptom med alla svårighetsgrader mellan dessa ytterligheter kan vara förenliga med SLE- diagnosen. Sjukdomen drabbar fler kvinnor än män (ca 10:1). Hos över 95 % av patienterna med SLE kan man påvisa cirkulerande antikroppar riktade mot olika komponenter i cellkärnor (anti- nukleära antikroppar, förkortas ANA). Antikroppar mot andra vävnadsantigener, t.ex. membranantigen på erytrocyter, granulocyter och trombocyter förekommer också. Kärnantikroppar (ANA) saknar organ- och arts -specificitet. Kärnantikroppar kan även påvisas vid andra bindvävssjukdomar, t.ex. Sjögrens syndrom, samt även en del fall av Rheumatoid artrit. Det är därför nödvändigt att vid en positiv ANA göra ytterligare studier för att undersöka antikropparnas specificitet. 6
ANA är en indirekt immunfluorescens metod (IFL). På ett objektglas finns celler (HEp-2, cellinje från humant bronkepitel) alternativt vävnadssnitt (råttlever). Då ett patientprov får reagera med dessa kommer eventuella antikroppar mot cellerna att fästa. Det är kärnantikroppar av olika specificitet som kommer att reagera. De antikroppar som finns i serum, men som inte bundit till preparatet tvättas bort. Kärnantikropparna synliggör man sedan genom att tillsätta fluorescin- märkta antihumana antikroppar. Finns det i preparatet antikroppar bundna kommer dessa att märkas av den andra antikroppen. De antihumana antikroppar som inte binder tvättas bort och preparatet kontrastfärgas svagt för att synliggöra hela cellerna. (behövs framför allt vid negativa prov). Fördelen med den här typen av test är att man förutom att få svar på om provet är positivt även morfologiskt kan se i mikroskopet var antikropparna binder. Flera olika typer av kärnfluorescensmönster förekommer: 1. Homogent. Vid SLE. 2. Kornigt. Vid SLE, MCTD (mixed connective tissue disease) och andra inflammatoriska bindvävssjukdomar. 3. Nukleolärt. Vid systemisk skleros/ sklerodermi. 4. Centromer. Framför allt vid CREST (variant av sklerodermi). 5. PCNA (Prolifererande cellers kärnantigen). Vid SLE. Material 10 stk patientprover (serum). Inaktiverade 56ºC, 35-60 minuter. I kit från kommersiell tillverkare finns: - Glas med HEp-2 celler. Singelförpackade i folie. - Små flaskor med positiv kontroll (grön lösning) och negativ kontroll (genomskinlig lösning). - Konjugat (stor flaska). - Evans blue counterstain. (Liten flaska med blå lösning). - Monteringsmedium (genomskinligt). 7
Övrigt som behövs för utförande: - Små plaströr till spädning av prover, 10 stk/ grupp. - PBS = Phosphate Buffered Saline, 0,01M ph = 7,2. Till spädning av prover. Finns färdigt i kolvar på labbänken. - Fuktig kammare = matlåda med fuktat filterpapper. - Kyvett med PBS + en droppe Tween- 20. - Bägare med destillerat vatten. Utförande OBS: Ta inte ut glasen med HEp-2 celler ur förpackningen innan ni är klara med förberedelserna! 1. Blanda proverna genom att vända på rören några gånger. Späd proverna 1/40 med PBS. 2. Ta fram ett objektsglas med HEp-2 celler. Märk med gruppnamn (med blyerts). 3. Tillsätt en droppe (= ca 25 µl) positiv kontroll till det lilla fältet märkt +. 4. Tillsätt en droppe( = ca 25 µl) negativ kontroll till det lilla fältet märkt -. 5. Tillsätt 20 µl patientprov 1-10 till respektive märkt brunn. 6. Inkubera 30 minuter i fuktig kammare. Rumstemperatur. 7. Skölj med PBS. Använd en sprutflaska. OBS: skölj inte direkt på brunnarna, då lossnar cellerna! 8. Tvätta glaset genom att låta det stå i en kyvett med PBS och en droppe Tween- 20 i 10 minuter. Doppa sedan glaset i en bägare med destillerat vatten 3-5 gånger. 8
9. Använd en tunn pappersservett och torka glaset försiktigt och noggrant runt brunnarna. OBS: Torka inte bort cellerna! Låt inte glaset stå torrt mer än 15 sekunder utan gå snabbt till nästa steg! 10. Tillsätt en droppe konjugat (konjugat är antihuman antikropp märkt med fluorescinisothiocyanat, FITC) till varje brunn. Konjugatet är färdigspätt i kitet. Var noga med att se till att droppflaskan inte får kontakt med preparatet. konjugatet kan då bli förorenat. 11. Inkubera 30 minuter i fuktig kammare. Rumstemperatur. Låt stå mörkt. 12. Skölj som i punkt 7. 13. Tvätta glaset genom att låta det stå i en kyvett med PBS och en droppe Tween- 20 i 10 minuter. 14. Tillsätt 5 droppar Evans blue till 100 ml PBS i en kyvett. Ställ i glaset och låt stå i 5 minuter. 15. Tvätta genom att doppa glaset i en bägare med destillerat vatten 3-5 gånger. 16. Torka baksidan av preparatet med en tunn pappersservett. Torka försiktigt på ovansidan glaset, men torka inte på cellerna, och var snabb så att preparatet inte torkar innan nästa steg. 17. Tillsätt 1-2 droppar monteringsvätska på glaset och lägg på ett täckglas. Packa försiktigt glaset in i aluminiumfolie. (Skyddar mot ljusexponering). 18. Provet är nu klart för avläsning i fluorescensmikroskop. Om proven inte skall läsas av direkt, (det går lika bra senare samma dag, eller nästa dag) behåll folien på och lägg i kylskåp. 9
Innan användning av fluorescensmikroskopet Tänk på att preparatet är ljuskänsligt! Håll glaset mörkt (t.ex. i folie) när ni går till mikroskopet och när ljuset är på i mörkerrummet. Bekanta er med mikroskopet innan ljuset släcks. Det finns en röd mörkerrumslampa ni kan tända under mikroskoperingen, men kom ihåg att släcka denna när ni lämnar rummet. Under mikroskoperingen skall den vanliga lampan på mikroskopet INTE vara tänd, endast argonlasern skall lysa. Lasern skall vara PÅ under hela dagen, ni skall alltså INTE stänga av lasern mellan grupperna. (Det sliter på den.) Sista gruppen för dagen stänger av lasern. Ni skall använda objektivet 40x oljelins. Ta EN droppe olja på första fältet, drag sedan med droppen till de andra fälten. OBS: Om ni tar mer olja kommer det bli kladdigt och svårt att se cellerna. Tänk på att fluorescensen kommer att avta med tiden. Använd ljusbländaren. 10
Positiv. Homogen. cytoplasma cellkärna Positiv. Kornig. Positiv. Nukleolär. Positiv. Centromer. Negativ 11