Snittning och färgning av lungpreparat från råtta.

Snittning och färgning av lungpreparat från råtta. Jeanette Valcich Biomedicinska analytiker utbildningen Lunds Universitet Handledare: Lille-Mor Lindeström Sammanfattning Syftet med denna laboration var att snitta, färga in och mikroskopera lungpreparat på råtta. Tre olika färgningar gjordes; Hematoxylin & Eosin (H&E), Van Gieson Elastica och Verhoeffs jod-järn-hematoxylin. Detta projekt koncentrerades på pullmonära blodkärl och bronkioler och hur de elastiska vävnaderna och andra skikt i dessa ser ut. Verhoeffs färgning blev bra, det var lätt att urskilja elastiska trådar från annan vävnad. Van Gieson färgningen var det däremot något fel på, det var svårt att skilja på bindväv och muskulatur, förmodligen berodde problemet på pikrinsyran. Även lymfoida ansamlingar och fettceller påträffades i lungpreparaten. Botildenborgsv. 23 213 62 Malmö 040-215602 walking_in_london@hotmail.com Nyckelord: lungor, H&E, Van Gieson Elastica, Verhoeffs jod-järn-hematoxylin, bronkioler, pullmonära artärer, pullmonära vener, elastiska trådar, lymfiod vävnad, BALT 1

Introduktion Lungorna står för kroppens mekaniska respirationssystem. Syre som behövs för cellulär respiration absorberas från atmosfären och tas upp i lungorna och in i blodsystemet, varefter koldioxid frisätts (1). Innan lungorna börjar delar sig trachea i två grenar, som kallas primära bronker. I hilus, där bronkerna går in i lungorna, passerar de pullmonära blodkärlen och lymfkärlen in och ut (2). Väl inne i lungorna delar även de primära bronkerna sig och bildar sekundära (lobära) bronker som därefter delar sig till tertiära (segment) bronker. Bronkioler är de tertiära bronkernas förgreningar och dessa delar sig i sin tur till terminala bronkioler som mynnar ut i små alveoler (2). Huvuddelen av lungorna består av alveoler omgivna av lungkapillärer och det är här gas utbytet sker (1). Två lager av serösa membran, som tillsammans kallas pleura (lungsäck), omger lungorna och skyddar dem (2). Under epitelet ligger lamina propria, som avtar lite, längre ut i respirationssystemet och består av elastiskbindväv och lymfoid vävnad. Den glatta muskulaturen under lamina propria ökar i bronkiolerna. Submucosalagret som finns under denna muskulatur avtar fram till de tertiära bronkerna där det försvinner helt tillsammans med brosket (1) och bronkiolkörtlarna (5). Brosket delas upp i plattor i bronkerna i stället för en sammanhängande "hästsko" som i trachea (2). Utanför brosket eller den glatta muskulaturen finns en fibroelastisk vävnad som kallas adventitia (1). I de stora bronkiolerna är epitelet cylindriskt flerradigt cilierat, i de terminala bronkiolerna blir epitelet enkelskiktat för att till sist bli kubiskt enkelskiktat cilierat (6). Bägarceller finns i trachea och bronker men avtar sedan i antal ju längre ut i förgreningarna man kommer (2). I den alveolära väggen finns två sorters epitelceller, typ I och typ II pneumocyter. Typ I är avlånga celler, varigenom gasutbytet sker. Typ II är runda eller kubiska celler, med den fria ytan täckt med microvilli, de håller alveolerna fuktiga genom att utsöndra alveolär vätska. Alveolära makrofager tar bort damm och andra främmande ämnen i alveolerna genom fagocytos (2). I detta projekt snittades lungor från hanråttor, varefter de färgades och undersöktes. Identifiering av olika typer celler och vävnadsstrukturer i lungorna gjordes. För detta ändamål utfördes tre olika färgningar: H&E (översiktsfärgning), Van Gieson Elastica (färgar elastiska trådar, kollagen bindväv och muskulatur) och Verhoeffs jod-järnhematoxylin (färgar elastiska trådar och kollagen bindväv). 2

Material och metod Preparation av lungor En hanråtta (ca 300g, Sprague Dawley, från Möllegaard Danmark) sederades intramuskulärt med 0,1 ml Diazepam (Stesolid Novum, Alpharma 5 mg/ml, spädd 1:1 med fysiologisk saltlösning 0.9 g/l.) samt sövdes intraperitonealt med 0,25 ml Pentobarbitalnatrium (Apoteket Produktion och Laboratorier, 60 mg/kg). Komplettering gjordes vid behov för att upprätthålla kirurgiskt narkosdjup. Buken klipptes upp och organen identifierades, varefter råttan avlivades med 1 ml Pentobarbitalnatrium. Organen skars ut, sköljdes i 0.01M PBS ph 7.2 (Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4, NaCl) och lades i fixeringslösning (4%-ig formalin i 0,1 M PBS, ph 7,2 (NA 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 )). Försöken utfördes enligt lokala föreskrifter och med godkännande från den lokala försöksdjursenheten vid Lunds Universitet. Dehydrering, inbäddning och snittning av lungor. Preparaten dehydrerades i en etanolserie med stigande koncentration, dränktes in i xylen (Histolab) och infiltrerades med flytande paraffin (Histolab). Lungorna snittades (4-5µm) på Leitz-slädmikrotome (Leitz 1512) och lades på laddade eller oladdade-objektglas (Menzel). Färgning Avparaffinering, dehydrering och hydrering av preparaten gjordes enligt Carson (1997, sid. 95). Rutinfärgningen H & E gjordes likaså enligt samma författare. Verhoeffs jod-järn-hematoxylin utfördes enligt metodbeskrivning från Moewis (978 sid. 180-181). Van Gieson elastica utfördes enligt metodbeskrivning från patologiska institutionen på universitet sjukhuset MAS (Lindeström, personlig kommunikation). Efter färgningarna monterades, med pertex (Histolab, Göteborg), ett täckglas över snittet för att skydda det från yttre åverkan. Mikroskopi av preparaten gjordes i ljusmokroskop. Resultat Med H&E färgades kärnor blå, erythrocyter och eosinofila granula svagt rosa till röda och cytoplasma och andra vävnadselement blev olika nyanser i rosa. I Figur 1 syns en artär intill en bronkiol i genom skärning. I preparatet hittades även en ansamling av fettceller (figur 2) och en tät anhopning av lymfocyter (figur 3). 3

Verhoeffs jod-järn-hematoxylin färgade elastiska trådar svarta, cellkärnorna blåsvarta, kollagen bindväv rosa och erythrocyter framträdde orange-röda. Vissa preparat blev mörkare än andra (data visas inte). På de preparat som inte blev för mörka framträder de elastiska trådarna skarpt både i artärer och bronkioler och även i bindväv (se figur 4 och 5). I figur 4 syns även en ansamling av lymfocyter som ligger intill en bronkiol (denna kan inte ses på bilden). Van Gieson elastica blev inte helt lyckad. De elastiska trådarna blev mörkbruna och kärnor svartbruna, men bindväv och muskulatur blev brungul istället för röd respektive gul. På vissa ställen framträder bindväven i svagt rosa (se Figur 6). Diskussion De olika färgningarna som användes har olika verkningssätt. Eftersom H&E färgningen är så vanlig har jag inte tänkt ta upp principerna vad gäller denna färgningen. Med Verhoeff jod-järn-hematoxylinfärgning överfärgas preparatet med en jod-järnhematoxylin lösning. Järnklorid och jod har en oxiderande funktion som omvandlar hamatoxylin till hematein som sedan förmodligen binder till preparatet med vätebindningar. Detta är en regressiv färgning, för att få de elastiska fibrerna, som färgen binder starkast till, att framträda måste preparatet differentieras med järn klorid. Det är viktigt att titta i mikroskop efter differentieringen, om preparatet fortfarande är för mörkt kan detta differentieras ytterligare. Om det istället har differentierats för mycket måste preparatet färgas om. Vissa preparat i detta projekt blev för mörka, på grund av osäkerhet i hur mörkt det skulle vara och ovilja att differentiera för mycket.. När differentieringen är bra används en motfärg, i detta försök användes Eosin, men ännu vanligare är det att använda van Gieson (3). Van Gieson Elastica är en färgning, som baseras på att färgämnet Orcein har stor spridning i sura alkoholiska lösningar och därför lätt diffunderar i kompakta vävnader. Det finns även teorier om att det är van der Waals bindningar eller vätebindningar tekniken bygger på (4). Andra ämne som används är syrafuchsin (sur anilin färg), som i en starkt sur lösning färgar kollagen. Pikrinsyra bidrar till det låga ph:t och färgar muskler och cytoplasma samt saltsyra som förstärker differentieringen mellan kollagen och muskler. Pikrinsyran man används måste vara mättad, om den inte är det kan kollagen färgas svagt rosa till orange, istället för klar rött och då kan kollagen, muskler och cytoplasma färgas i samma färg (3). Figur 6 är ett tydligt exempel på detta problem. Den glatta muskulaturen (G) 4

skulle vara mer gul, och bindväven (B) skulle vara röd, men så är inte fallet utan alla vävnader är mer eller mindre ljusbrun-gula. Varför det har blivit så är i detta fall svårt att säga eftersom pikrinsyran var mättad. Det kan ha varit något annat fel på denna, då även andra (bl.a. personer på Malmö Högskola, enligt Lindeström, personlig kommunikation) som använt pikrinsyran har upplevt samma problem. Detta är varför Eosin istället användes till den tidigare nämnda färgningen. Tyvärr gjordes endast snitt av lunga där bronkioler kunde ses, därför har inget brosk inga bronker, bägarceller eller flerradiga epitel synts till. Det gjordes inte heller något bra snitt på bronkioler med synligt kubiskt epitel. Man kunde på många av snitten tydligt se de olika skikten i blodkärlens och bronkiolernas väggar, särskilt med van Gieson och Verhoeff (figur 4-6). Eftersom artärer innehåller mer elastiska trådar (både lamina elastica interna och ofta externa), så är det lätt att skilja dem ifrån venerna vars vägg till största delen består av glatt muskulatur (tunica media) (1). Detta visas tydligt i figur 4, här är väggen dessutom skiktad, med tre tjockare strimmor av elastiska fibrer. Där det även finns en ansamling lymfocyter (Ba), denna är en del av en så kallad BALT (Bronchus associated lymfoid tissue). Sådana finns intill vissa bronkioler för att skydda lungorna från intränganden av främmande ämnen. Ansamlingen av lymfocyter (L) på figur 3 till hör inte BALT. Den ser ut att vara omsluten av något, men någon kärlvägg kan inte urskiljas. Kanske är det ett lymfatiskt kärl, men det borde inte finnas i denna del av lungan. I denna figur kan även en alveolär makrofag (M) ses, den skiljer sig får pneumocyterna med sin storlek och ljusa färgton. I figur 2 syns, som tidigare nämnts, fettceller (F). Detta var väldigt överraskande, eftersom det aldrig talas om att fettceller finns i lungorna. Tyvärr har det varit svårt att hittat information om detta fenomen. En artefakt (A) som jag inte vet vad den beror på finns både i figur 6 och 1, kanske är det mucosa eller blod som har kommit in i bronkiolen. 5

Källförteckning 1. Yuong B. Heath J.W. Wheater s Functional Histology- a text and colour atlas, Churchill Livingstone, London, 4 th edition; 147, 154, 222; 2000 2. Tortora G.J, Gabrowski S.R. Principles of anatomy and physiologi, HarperCollins publisher, USA, Eighth edition; 717, 719, 720, 722;1996 3. Carson F.L., Histology-a self-intoductional text, 2 nd edition, Chicago; 137-139,1997 4. Moewis G., Histologisk teknik, Almqvist & wicksell förlag AB, Stockholm, 180-181;1978 5. Geneser F. Textbook of histology 1 st edition, Manygaard, Köpenhamn, 510; 1986 6. Junqueira L.C. Carnerio J. Kelly R.O. Basic histology sixth edition, Appelton & Lange, Rio de Janeiro, Brasilien, 235; 1989 7. Lille-Mor Lindeström 6

Figurer Figur 1 Ett exempel på en bronkiol (B) och en artär (A) med vägg av glattmuskulatur (G). Man kan även se ett blodkärl (b) i tvärsnitt. Inne i bronkiolen finns en artefakt (Ar). Skalstrecket på figuren är i verkligheten 110µm. Infärgat med H&E. 7

Figur 2 Upptill på bilden en tvärsnittad bronk med med cylindriskt enkel skiktat epitel (E) innehållande synliga kärnor (k). Nedre vänstra hörnet en ven (V) ovanför denna alveolära säckar (A) och en ansmaling av fettceller (F), vari någon kärna (K) syns. Skalstrecket motsvarar i verkligheten 110 µm. Infärgning med H&E. 8

Figur 3 Ansamling av lymfocyter (L) intill bronkiol. Till höger alveoler (A) och en tydlig makrofag (M). Skalstrecket motsvarar i verkligheten 56µm. Infärgat med H&E. 9

Figur 4 Ett del av en ven (V) och dess kärlväggen (K ) (tunica media). En artär (A) med en flerskiktad lamina elastica interna (E), tunica media (M) som förenas med bindväven (B) i lungan som leder till en bit av en BALT ansamling (Ba). Skalstrecket motsvarar 110µm i verkligheten. Infärgat med Verhoeffs jod-järn-hematoxylin. 10

Figur 5 En delav en bronkiol (B), med ett yttre skikt av cylindriskt enkel skiktat epitel (Ep). Under detta, lamina propria (L) som innehåller elastiska trådar (E) som till viss del sträcker ut sig i den glatta muskulaturen (G) och den kollagena bindväv (K) med en liten artär (A). Skalstrecket motsvarar i verkligheten 56 µm. Infärgade med Verhoeff järn-jod-hematoxylin. 11

Figur 6 En artär, med synlig lamina elastica interna (I), tunica media (B) runt om. En bronkiol, inifrån ett enkel radigt epitel (Ep), lamina propria (P) och sist glatt muskulatur (G). Det inre lagret i bronkiolen är en artefakt (Ar). Skalstrecket motsvarar i verkligheten 56 µm. Infärgning med van Gieson Elastica. 12