Introduktion till labkursen på Biokemi 1 Annica Theresia Blissing IFM Molekylär bioteknik
Upplägg Laborationen sträcker sig över flera tillfällen: Isolering, gelfiltrering, absorbansmätning och påvisande av sulfat Provberedning, SDS-PAGE, pipettkalibrering, gelinfärgning Dataanalys och diskussion kring resultat Rapport 2
Förberedelser Tillfälle 1 Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Tillfälle 2 Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Beräknat provvolym till SDS-PAGE Alltså VAD och VARFÖR Vi hjälper er med HUR! Tillfälle 3 analys och diskussion All insamlad data Funderat på förväntad molekylvikt 3
Laborationer på Biokemi 1 Vecka 45 fredag 10 15 onsdag torsdag 13 17 13 17 4 timmar per pass Oförberedd? Då kommer tiden inte att räcka till! 17 21 17 21 4
Teori inför laborationen 5
Separationstekniker Inom biokemi är det oerhört vanligt att man vill separera komponenter i en lösning. Isolera och rena hemoglobin Olika separationskriterier Centrifugering och utsaltning gelfiltrering Kontrollera renhet och bestämma molekylvikt med SDS-PAGE 6
Hemoglobin 7
Hemoglobin 4 subenheter kvartärstruktur 8
Erytrocyter Semipermeabelt membran Erytrocyt Porer och kanaler ClNa+ K+ K+ Na+ H2O joner Na+ Na+ Cl- Na+ Cl- K+ K+ K+ Diffusion ClSamma osmotiska tryck i och utanför cellen 7
Lysering H2O H2O H2O H2 O [NaCl] Isoton lösning 0.9% NaCl H2O H2O [NaCl] H2 O H2O H2O H2O Hypoton lösning < 0.9% NaCl H2O H2O Hyperton lösning > 0.9% NaCl H2O H2 O H2 O 10
Osmos 11
Utsaltning Proteiner har laddningar på ytan Olika sammansättning av laddningar på ytan löslighet Neutralisera laddningarna De faller ut vid olika saltkoncentrationer löslighet tillsätt motladdningar tills proteinets laddningar neutraliserats Separation med avseende på löslighet (NH4)2SO4 12
Gelfiltrering Separation med avseende på storlek och form. Tvärbunden glukospolymerer Små molekyler får plats i gelkornen Större molekyler får inte plats vandrar runt gelkornen Lång sträcka kortare sträcka Stora går snabbt Små går långsamt 13
14
Kromatogram Absorbans 280 nm baslinjeseparation Voidvolym Volym (ml) fraktioner 15
Gelfiltrering Separation med avseende på storlek och form. Kompakta molekyler tar sig lättare in i hålrummen. uppför sig som om de vore mindre än vad de egentligen är Avlånga och utsträckta molekyler tar sig mer sällan in i gelkornen. uppför sig som om de vore större än vad de egentligen är Calmodulin PDB molecule of the month Aug 2003 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momid=44 16
Gelfiltrering Omvänd sil Stora går snabbt Små går långsamt Separation med avseende på storlek och form. Calmodulin PDB molecule of the month Aug 2003 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do? momid=44 17
Gelelektrofores Laddad partikel rör sig mot pol i elektriskt fält jmf elektrolys polyakrylamidgel Proteiner har laddningar på ytan Tredimensionellt nätverk 18
Polyakrylamidgelelektrofores Tredimensionellt nätverk Bestämd porstorlek bisakrylamid Separation med avseende på storlek Stora molekyler retarderas Små molekyler passerar lättare Små går snabbt Stora går långsamt 19
Polyakrylamidgelelektrofores 20
Polyakrylamidgelelektrofores Proteinbanden färgas med coomassie visualisera 21
Polyakrylamidgelelektrofores MEN formen påverkar migrationen! Kan ha samma form men olika laddningar på ytan Calmodulin PDB molecule of the month Aug 2003 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do? momid=44 Nativ struktur påverkar migrationen form laddning Lösning: denaturera! 22
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis detergent disulfidbryggor och primärstruktur intakta β-mercaptoetanol bryter icke-kovalenta bindningar Sekundär Tertiär Kvartär denaturering negativ nettoladdning Binder till proteinet Alla peptidkedjor får samma form och laddning 23
SDS-PAGE Alla peptidkedjor samma laddning och form Samma elektroforetiska mobilitet Separation endast m a p storlek Molekylviktsbestämning Renhetsbedömning 24
SDS-PAGE Molekylviktsbestämning Mät vandringslängder Log-diagram Log molekylvikt Vandringslängd (mm) Exempelrapport på kurshemsidan 25
Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x + 5.37 5.3 Logaritmerad molekylvikt 5.1 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 0 10 20 30 40 50 60 vandringslängd (mm) 26
Renhetsbedömning SDS-PAGE Ett band = en molekylvikt Ofta en sorts protein Ett band = rent protein 27
Renhetsbedömning MEN vissa proteiner kan uppvisa fler än ett band Kom ihåg: Hb har 4 subenheter Så är inte alltid fallet! Hb:s subenheter väger lika ~ 16 000 g/mol endast ett band på gelen! 28
Jämförelse Gelfiltrering polyakrylamidgelelektrofores Störst först Minst först Separation med avseende på storlek 29
Jämförelse Gelfiltrering PAGE SDS-PAGE Calmodulin PDB molecule of the month Aug 2003 http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do? momid=44 Nativt protein Formen påverkar! Nativt protein Form och laddning påverkar! Denaturerat protein Endast storleken har betydelse 30
Jämförelse Använda gelfiltrering för molekylviktsbestämning? Kända referensproteiner på samma sätt som SDS-PAGE Kromatogram molekylviktsbestämning med gelfiltrering 4 3.5 3 absorbans 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 elueringsvolym (ml) 31
Isolering och rening av hemoglobin 32
Laborationer på Biokemi 1 Kom i tid Kom förberedd Labbar börjar med genomgång och kort förhör Förväntas ha koll på läget Närvaro förutsättning för att få labba! Obligatorisk närvaro Hela labpasset Meddela förhinder till handledare i god tid Meddela oss direkt om något händer! Rapportera närvaro efter avslutat labtillfälle Gör vid varje labtillfälle! 77
1.5 ml helblod 500 g, 15 min Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 34
1.5 ml helblod 500 g, 15 min pellet Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas H2O Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 35
1.5 ml helblod 500 g, 15 min Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 H2O 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 36
0.5 ml Viktigt att gelytan är rak! Gelen ekvilibrerad Gelfiltrering för att separera (NH4)2SO4 från Hb jämviktad anpassade buffertförhållanden från utfällningen Ekvilibreringslösning genom kolonnen 0.1 M KCl 37
gelytan Applicera försiktigt 0.5 ml Försiktigt så att inte gelytan ruggas upp! Öppna utflödet Låt provet sjunka in tills i nivå med gelytan Gelen får aldrig torrläggas! 38
gelytan Stäng utflödet Applicera lite KCl på samma sätt som provet Försiktigt så att inte gelytan ruggas upp! Tvätta in provet Låt prov och KCl sjunka in Gelen får aldrig torrläggas! 39
gelytan Fyll på med mer 0.1 M KCl Kör gelfiltreringen tills några ofärgade fraktioner erhålls Försiktigt så att inte gelytan ruggas upp! Gelen får aldrig torrläggas! 40
Absorbansmätning Lambert-Beers lag A=ε c l ε = 14480 M-1 cm-1 I I0 l = 1 cm c = koncentrationen i molar ε = molära absorptiviteten A= log l Io I Om A > 1 måste provet spädas 41
42
Påvisa sulfatjoner Giftigt! En droppe Ba(NO3)2 OBS! Inte till toppfraktionen! anvisad plats skyddsutrustning Högst koncentration Hb till SDS-PAGE 43
Kromatogram konstruerat av Forskarskolans elever 2011 44
Separation Men hur mycket Hb fick vi ut? hemoglobin fällning Separation! 45
Utbyte 0.5 ml supernatant absorbansvärden koncentration Massa eller substansmängd hemoglobin 46
Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x + 5.37 5.3 Logaritmerad molekylvikt 5.1 4.9 Använd för att räkna ut molekylvikten 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 0 10 20 30 40 50 60 vandringslängd (mm) 47
Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x + 5.37 5.3 Logaritmerad molekylvikt 5.1 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 0 10 20 30 40 50 60 vandringslängd (mm) 48
Viktigt! Molekylvikten säger INGENTING om provets renhet! Hur avgör man renheten? 49
Rapporten 50
51
Rapporten Utförlig och komplett rapport! Inledning Syfte och utförlig teori Resultat Redovisas tydligt Rådata, beräkningar, figurer/bilder, tabeller... Utförande Beskriv tillvägagångssätt Passiv form! Håll isär utförande och teori! Riskanalys Diskussion Diskutera resultaten Felkällor och hur de har påverkat resultatet Jämförelse GF + SDS-PAGE Akrylamid 52
Rapporten Examination 5 arbetsdagar En rapport för alla tillfällen Tänk på helheten! Elektronisk inlämning 3 rättningar Enligt riktlinjer Gäller även returer + punkterna i handledningen Copy paste oacceptabelt Se baksidan på försättsbladet Track changes aktiverat Fullständig! Saknas stycken retur right-first-time 53
Tips inför rapporten Skriv inledning och utförande så snart som möjligt Se det som förberedelse Skriv resultat och diskussion så snart som möjligt Se även Redovisning i kompendiet! Checka av att allt är med Passa på att fråga oss på schemalagd tid Vi svarar gärna! Utanför schemalagd tid jobbar vi med annat Säkrast: e-mail Använd allt tillgängligt material! Föreläsningsanteckningar Kursboken Labhandledningen 54
Förberedelser Tillfälle 1 gelfiltrering Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Tillfälle 2 SDS-PAGE Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Beräknat volym Hb Alltså VAD och VARFÖR Vi hjälper er med HUR! Tillfälle 3 analys och diskussion All insamlad data Funderat på förväntad molekylvikt 55
Vi ses på lab! Annica Blissing Linda Helmfors Cissi Andrésen annij@ifm.liu.se liand@ifm.liu.se cecan@ifm.liu.se 56