Linköpings universitet IFM/Kemi BIOKEMI 1 NKEA08. Laborationskompendium med sidhänvisningar till kurslitteratur samt övningsuppgifter

Transkript

1 Linköpings universitet IFM/Kemi BIOKEMI 1 NKEA08 Laborationskompendium med sidhänvisningar till kurslitteratur samt övningsuppgifter HT-2014

2 Innehållsföreteckning Sidhänvisningar till Berg, Tymoczko, Stryer Biochemistry 7th ed. 1 Att kunna till duggan 2 Titrerkurva för alanin 3 Cellstruktur 4-6 Metaboliskt schema 7 Proteiner, uppgifter till lektionen 8 Kolhydratmetabolism, uppgifter till lektionen 9 Fettsyrametabolism och reglering, uppgifter till lektionen Laborationsrapport: innehåll och inlämningsregler 12 Absorptionsspektrometri Preparation av hemoglobin med bl.a. gelfiltrering Bestämning av ett proteins molekylvikt med SDS-PAGE Kalibrering av automatpipett Alkoholdehydrogenas (ADH): Bestämning av reakionshastigheten Övningstenta med svar:

3

4 LINKÖPINGS UNIVERSITET IFM/Kemi BIOKEMI 1 SIDHÄNVISNINGAR TILL BERG, TYMOCZKO, STRYER: BIOCHEMISTRY, 7th ed. FÖRELÄSNING SIDOR Introduktion: Biokemi 1-5 Proteiner 18, Kolhydrater , Lipider och cellmembraner , 367 DNA Aminosyror Primär- och sekundärstruktur 33-35, 81-85, Tertiär- och kvartärstruktur Proteinrening Enzymer , , Bioenergetik , Glykolysen , , , Glukoneogenesen , , Citronsyracykeln , Andningskedjan och ATP-as , , Lipidmetabolism I: β-oxidationen , Lipidmetabolism II: Fettsyrasyntesen Reglering av enzymaktivitet: Översikt Kovalent modif Hormonverkan Glukagonverkan , , Nukleinsyrornas uppbyggnad och replikation , , Transkription och translation , , ,

5 Att kunna till Duggan! 1. Fullständigt namn och trebokstavkoden för de 20 aminosyrorna 2. Strukturen för de 20 aminosyrorna 3. Indelning av aminosyrorna vid ph 7 i opolära, polära oladdade, plusoch negativt laddade. 4. Jämföra olika aminosyrors polaritet 5. Ungefärliga pka-värden: -COO - bunden till α-kolet 2 + -NH 3 bundet till α-kolet 9 -COO - i R-grupper 4 R-grupper i Lys och Arg R-gruppen i His 6 R-gruppen i Cys 8 6. Veta att Cys kan bilda S-S bryggor 2

6 Titrerkurva för alanin 3

7 Prokaryot cell Prokaryoter, eller bakterier är vanligtvis en-celliga organismer. Prokaryoter saknar kärna (deras DNA är packat i en kärnregion I cytoplasman) Escherichia coli (E. coli) en av de mest välstuderade av alla levande organismer. E. coli celler är ~0.5µm diameter, 1.5µm långa Eukaryot cell Eukaryoter: växter, djur, svampar Har en membranombunden kärna som innehåller kromosomer. Är normalt 1000 ggr större i volym än prokaryota celler. Har membranombundna organeller. 4

8 E. coli cell 5

9 Eukaryotic cell (animal) 6

10 7

11 Proteinlektion: Under lektionen kommer uppgift 8, 11, 12, 15, 17 och 20 på sid i boken att gås igenom. Förutom dessa uppgifter går vi även igenom följande tre uppgifter: 1. Vilken nettoladdning får följande tetrapeptid vid ph 7? Ala-Lys-Asp-Ser 2. Hur påverkas ett proteins primär, sekundär, tertiär och ev. kvartärstruktur vid denaturering? 3. Lista skillnaderna mellan sekundärstrukturmotiven, α-helix och β-flak. 8

12 KOLHYDRATMETABOLISMEN: 1. Hur mycket ATP frisätts vid glykolysen och vad sker med pyruvat (i) vid aeroba förhållanden? (ii) anaeroba förhållanden? 2. Hur skiljer sig glykolysen och glukoneogenesen åt och vad är det som styr om respektive process är aktiv? 3. Vad innebär substratnivåfosforylering? 4. Vilken reaktion binder samman glykolysen och citronsyracykeln? 5. Redogör för hur mycket GTP, NADH och FADH 2 som bildas per varv i citronsyracykeln. 6. Vilka reaktioner gör citronsyracykeln energetiskt fördelaktig? 7. Ge exempel på andra biomolekyler som kan bildas från citronsyracykelintermediärer. 8. Beskriv översiktligt hur e - från NADH vandrar mot den slutliga e - -acceptorn O Förklara varför oxidation av NADH motsvarar 2.5 ATP medan oxidation av FADH 2 motsvarar 1.5 ATP. 10. Vad gör cytokromer till bra elektronbärare? 9

13 FETTSYRAMETABOLISMEN: 1. Ange korrekt svarsalternativ (a eller b): (i) Fettsyrasyntesen sker a. i mitokondrien. b. i cytosolen. (ii) Fettsyrasyntesen a. kräver ATP. b. genererar ATP. (iii) Fettsyranedbrytningen katalyseras av a. flera separata enzymer. b. ett enzymkomplex. (iv) Vid fettsyrasyntesen bildas fettsyran a. från metyländen till karboxyländen. b. från karboxyländen till metyländen. (v) Lipas katalyserar a. bildandet av fettsyror. b. nedbrytning av triacylglycerol. (vi) Lipasaktiviteten regleras a. hormonellt. b. av allostera effektorer. (vii) Enzymet som reglerar hastigheten för fettsyrasyntesen heter a. acetylcoadehydrogenas b. acetylcoakarboxylas (viii) Insulin a. aktiverar fettsyrasyntesen. b. inaktiverar fettsyrasyntesen. 2. Ange om det behövs oxidationsmedel eller reduktionsmedel för fettsyranedbrytningen och ange vilket/vilka. 3. Rita upp fettsyran 18:2 9,12 (linolsyra). 4. Varför omvandlas acetylcoa till malonylcoa innan fettsyrasyntesen och det mekanistiska motivet dekarboxylering återfinns i en annan metabol process vilken process och vilken reaktion åsyftas? 5. Cellerna är beroende av transportmolekyler för att alla metabola system ska fungera. a) Vilken transportör krävs för fettsyranedbrytningen, vad transporteras och vart? b) Vilken transportör krävs för fettsyrasyntesen, vad transporteras och vart? 6. a) Om du fick rådet att helt avstå från kolhydrater, hur skulle det då påverka din förmåga att bryta ner fett? Vad skulle bildas? b) Om du då fick rådet att se till att äta fettsyror med ett udda antal kolatomer, skulle det påverka din situation? 7. Beräkna hur mycket ATP som erhållits efter fullständig nedbrytning av laurat (dodekanoat, 12C). 10

14 REGLERINGEN: 8. Fosforylering/defosforylering är vanligt vid reglering av enzymaktivitet. a) Vad kallas ett enzym som fosforylerar ett annat protein? b) Vad kallas ett enzym som defosforylerar ett annat protein? c) Vilket ämne fungerar som fosfatdonator vid fosforyleringar? 9. Nämn några olika sätt att reglera nyckelenzymers aktiviteter. 10. Hur kan fosforylering/defosforylering vara så effektivt när det gäller att reglera ett enzyms aktivitet? 11. Skissa schematiskt på signalvägen från aktivering av receptor till aktivering av effektorer (t ex ett enzym) och ge exempel på second messengers. 12. Vissa proteiner är inaktiva om inte en serin eller treonin fosforylerats. I vissa fall har dock dessa proteiner kunnat aktiveras genom att serinen eller treoninen genom lägesspecifik mutagenes bytts ut mot en glutamat (glutaminsyras anjon). Förklara varför. 13. En muterad form av Gα-subenheten av ett G-protein gör GDP/GTP-utbyten även i frånvaro av en aktiverad receptor. Hur påverkar detta signaleringsvägen? 14. Vid muskelarbete utsöndras adrenalin för att stimulera nedbrytning av glukos för att ge muskeln energi. Glukos finns lagrat som glykogen. Adrenalin påverkar β-adrenerga receptorn vilket leder till aktivering av Gα och camp. camp-fosfodiesteras är ett enzym som omvandlar camp till AMP. Hur påverkar inhibitorer av camp-fosfodiesteras glukosmobiliseringen i musklerna? 11

15 Laborationsrapporter: På Biokemi kursens hemsida: hittar du instruktioner avseende rapportens innehåll samt regler för inlämning. Laborationsrapporter skickas in på följande mailadress: På hemsidan finns även en exempelrapport där du se hur en rapport i biokemi kan vara utformad. 12

16 LINKÖPINGS UNIVERSITET IFM/Kemi ABSORPTIONSSPEKTROMETRI ALLMÄNT En ljusstråle med en viss intensitet, som passerar genom ett medium, förlorar alltid en del av sin intensitet beroende på absorption förorsakad av joner och molekyler i mediet. Denna absorption är i allmänhet våglängdsberoende. Man kan därför registrera en specifik absorption mer exakt (signifikant), om ljusstrålen är monokromatisk, dvs ljuset består av endast en våglängd. Eftersom ljusabsorptionen är karakteristisk för de ämnen som ingår i mediet, kommer ljusstrålens intensitetsminskning att stå i relation till koncentrationen av de absorberande ämnena samt längden av strålens väg genom mediet. Matematiskt kan absorptionen uttryckas genom Lambert-Beers lag: A = log I o / I = ε l c A = absorbans I o = det infallande ljusets intensitet I = det utgående ljusets intensitet ε = den molära absorptiviteten (extinktionskoefficienten, M -1 cm -1 ) l = längden av strålens väg genom mediet (cm) c = koncentrationen av det absorberande ämnet (M) Termen I / I o benämns transmittans, T, och uttrycks i %, d.v.s. I / I o Vid samma våglängd är absorbanser additiva, d.v.s. i en lösning med n st absorberande ämnen är A tot = A 1 + A A n Ur Lambert-Beers lag fås även att absorbansen är linjärt beroende av det absorberande ämnets koncentration. Detta gäller dock inte om koncentrationen av ämnet är alltför hög. Den molära absorptiviteten är en konstant som påverkas av bl.a. våglängd, ph, lösningsmedlets polaritet och geometriska egenskaper hos den absorberande molekylen. Ofta används Lambert-Beers lag direkt vid t.ex. koncentrationsberäkningar för en viss absorberande substans. Man känner då absorptiviteten och även l som vanligtvis är 1 cm (standardkyvett), varvid man kan räkna fram c för en erhållen absorbans A. AKTIVITETSMÄTNINGAR Ett förfarande som ofta används inom biokemin är att spektrofotometriskt följa en enzymkatalyserad reaktion, i vilken substrat eller produkt absorberar ljus av en viss våglängd. Det är då möjligt att tillämpa ovannämnda mätningsmetod. 13

17 Absorbansminskningen (-ökningen) är därvid linjärt beroende av den hastighet, varmed substratkoncentrationen minskar (produktkoncentrationen ökar), d.v.s. A / t = ε l c / t Reaktionshastigheten v uttrycks vanligen i mol omsatt substrat per minut: v = A. reaktionsvolymen (l) / t. ε. l SPEKTRUM Om man vill undersöka ett ämnes absorption vid olika våglängder, kan man kontinuerligt registrera absorptionen som funktion av våglängden. Denna funktion kallas ämnets absorptionsspektrum. Tillvägagångssättet brukar kallas våglängdsscanning av engelskans scan, som betyder undersöka. DIFFERENSSPEKTRUM Två olika ämnen har inte identiska absorptionsspektra. Om skillnaderna är små, kan de vara svåra att upptäcka genom mätning av absorptionstopparnas lägen. I sådana fall registrerar man med en speciell teknik skillnaden mellan två spektra, vilket ger ett s.k. differensspektrum. Med hög känslighet kan mycket små skillnader mellan två spektra upptäckas. APPARATUR En apparat som mäter absorptionen i ett medium kallas spektrofotometer, och den arbetar på följande sätt. Ljus från en lampa, deuteriumlampa för UV-området, volframlampa för det synliga området, passerar en monokromator, ett spegelsystem med ett gitter, som delar upp ljuset i olika våglängder. Beroende på hur gittret vrids kan en spalt välja ut en ljusstråle med specifik våglängd. Denna monokromatiska ljusstråle träffar därefter kyvetten, som är en noggrant tillverkad behållare av kvarts, glas eller plast. Kvartskyvetter är dyrbara men kan användas för både UV-ljus och synligt ljus medan de billigare kyvetterna av glas bara fungerar i det synliga området. Numera finns plastkyvetter som kan användas ner till 260 nm. Den utgående strålen registreras av en ljuskänslig fotomultiplikator, som avger en spänning proportionell mot ljusstrålens intensitet. Spänningen räknas om och presenteras som ett absorbansutslag (transsmittansutlsag), digitalt eller på en skrivare. Spektrofotometrar är ofta av dubbelstråletyp (splitbeam), dvs en ljusstråle med en viss våglängd skickas växelvis genom referenskyvett och provkyvett. Detta sker med hjälp av choppern, en roterande skiva med omväxlande genomskinliga sektorer och spegelsektorer. I detta fall mäts absorbansskillnaden mellan kyvetterna. Numera finns 14

18 även enkelstråliga instrument, som med hjälp av datateknik kan justera för referensens absorbans. Om man vill följa en enzymatisk reaktion, där inte bara substrat eller produkt utan också reaktionsmediet absorberar, kan mediets absorbans subtraheras bort genom att man fyller både prov- och referenskyvett med mediet och nollställer fotometern innan försöket. Den absorbansökning som sedan registreras beror enbart på den reaktion man vill mäta. 15

19 Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering Teori Vid preparation av ett protein används en rad olika metoder för att specifikt rena fram det önskade proteinet. I vårt fall ska hemoglobin från nötblod isoleras med hjälp av centrifugering, utsaltning och gelfiltrering. Efter reningen registreras proteinets absorption för att mängden preparerat hemoglobin ska kunna beräknas. I blod finns hemoglobin, Hb, i de röda blodkropparna, erytrocyterna, vilka omges av ett semipermeabelt membran. Hemoglobin kan därför lätt separeras från proteinerna i blodplasman genom nedcentrifugering av blodkropparna. För att förbättra reningen tvättas blodkropparna med 0.9 % (isoton) NaCl-lösning. Det är mycket viktigt att denna lösning har rätt salthalt. Om koncentrationen av NaCl är för låg sker hemolys, dvs. vattnet tränger in genom membranet för att utjämna skillnaden i koncentration, varvid blodkroppen sprängs. Detta utnyttjas senare under preparationen för att frigöra hemoglobin ur de tvättade erytrocyterna. Om NaCl-koncentrationen är för hög, skrumpnar cellerna då vatten går ut genom membranet. Proteiner i vattenlösning är hydratiserade. Genom tillsats av stora mängder salt kan detta konkurrera med proteinet om vattnet, varvid proteinerna bildar större aggregat, som inte längre kan vara i lösning. Salter med envärda an- och katjoner, t.ex. KCl, är ganska ineffektiva vid utfällning av proteiner, medan de med högre valens, t.ex. (NH 4 ) 2 SO 4, ger mycket högre jonstyrkor och vanligen är mycket effektiva som fällningsmedel. Ammoniumsulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) är ett salt som ofta används vid proteinutfällning bl.a. på grund av sin stora löslighet. En mättad lösning av (NH 4 ) 2 SO 4 har koncentrationen 4 M. Vid tillsats av 385 mg (NH 4 ) 2 SO 4 per ml hemolysat kommer hemoglobinet att falla ut. Vissa mer lösliga proteiner blir dock kvar i saltlösningen. Genom centrifugering kan hemoglobin separeras från dessa. Fällningen löses i vatten inför det sista reningssteget då hemoglobinet ska separeras från kvarvarande proteinföroreningar och från saltet med s.k. gelfiltrering. Gelfiltrering är en metod, med vilken man kan separera föreningar med avseende på storlek och form. Gelen består av en tvärbunden glukospolymer, som är formad till små kulor. Graden av tvärbundenhet, dvs. porstorleken, och kulornas storlek kan varieras. Molekyler, som är större än de största porerna i gelen, kan inte penetrera gelpartiklarna. De passerar därför genom gelbädden med den rörliga fasen utanför partiklarna och elueras med den s.k. voidvolymen, mellanrumslösningen. Mindre molekyler tränger däremot in i gelpartiklarna och retarderas (bromsas) i olika grad beroende på storlek och form. Molekyler elueras därför i ordning efter minskande molekylstorlek och kan samlas upp i fraktioner, helt eller delvis separerade från varandra. 16

20 I vårt fall kommer de stora hemoglobinmolekylerna (M= g/mol) inte att retarderas.utan att följa med voidvolymen, medan de små jonerna bromsas kraftigt vid passage genom gelen. Material Blod Slangklämmor Graderade centrifugrör av plast 0.1 M KCl Bordscentrifug Gelmassa (Sephadex G-50 medium) Pasteurpipetter, nappar Kolonner+tillbehör 0.9 % NaCl Mättad Ba(NO 3 ) 2 (NH 4 ) 2 SO 4 (s) Stativ, muffar, klämmare Spatlar Tejp Vågskepp Eppendorfrör Mätglas Bägare Moment som utförs i förväg av handledare: Sephadex G-50 Medium får svälla på kokande vattenbad i 0.1 M KCl under 15 minuter eller i rumstemperatur under 3 timmar. Bäddvolymen i färdigsvälld Sephadex G-50 är ca 10 ml/g torr gel. Gelen får sedimentera och dekanteras några gånger för att avlägsna små partiklar, som annars kommer att täppa till gelen, varvid flödeshastigheten minskar. Gelen förvaras i 0.1 % azidlösning i kyl. Vid användning ska den vara rumstempererad och därefter avluftad ca 10 minuter i sugkolv. Kolonner försedda med glasfilter bör syradiskas och ultraljudbehandlas efter användning. Lösningar som görs i förväg av handledare: 0.1 M KCl 0.9 % NaCl mättad Ba(NO 3 ) 2 17

21 Utförande Packning av kolonn Den svällda gelen ska packas i en glaskolonn med 1 cm diameter. Montera kolonnen vertikalt och stäng utloppet. Häll i av den uppslammande gelsuspensionen (görs av handledare). Öppna kolonnen och tillför ekvilibreringslösning (0.1 M KCl) med hjälp av en hävert (flödeshastighet ca 1 ml/min). När gelen har sedimenterat färdigt, ska den vara fri från luftbubblor. Låt ekvilibreringslösning droppa igenom kolonnen under ca en halvtimme, så att gelen blir ekvilibrerad och klar för användning. OBS! Gelen får aldrig torrläggas, då tappar den sin separationsförmåga. När laborationen är slut töms kolonnen med hjälp av tryckluft. Be din handledare om hjälp med detta. Preparation av hemoglobin ut helblod Under tiden gelen ekvilibreras påbörjas preparationen av hemoglobin enligt reningsschemat nedan. 1.5 ml helblod i ett graderat centrifugrör finns förberett. Centrifugera (vikta rören!) och avlägsna supernatanten med en pasteurpipett. Undvik att blåsa bubblor i lösningen. Rör försiktigt upp blodkropparna i isoton NaCl-lösning genom att försiktigt vända röret. Centrifugera och avlägsna supernatanten. Uppskatta volymen blodkroppar och tillsätt dubbel volym avjonat vatten för att hemolysera blodkropparna. Vänd röret för att blanda. Väg upp 385 mg (NH 4 ) 2 SO 4 (s) per ml hemolysat och tillsätt detta till provröret med hemoglobin. Blanda ordentligt så att allt salt verkligen löser sig. Centrifugera och avlägsna supernatanten. Uppskatta volymen utfällt protein. Lös fällningen i tre delar vatten. Centrifugera ner denaturerade proteiner och andra olösliga rester. Denna ska genomgå gelfiltrering för att avsalta och rena hemoglobin. 18

22 Reningsschema 19

23 Gelfiltrering Låt ovanlösningen på kolonnen droppa ur så att vätskan kommer i samma nivå som gelytan. Stäng kolonnen. Applicera försiktigt 0.5 ml av den röda proteinlösningen på toppen av gelen med hjälp av en pasteurpipett. Öppna kolonnen och låt provet sjunka in till i nivå med gelen. Stäng kolonnen. Gör om proceduren, men med elueringsmedel (0.1 M KCl) i stället för proteinlösning, för att tvätta in provet. Fyll kolonnen med KCl-lösning utan att gelen rörs upp. Justera flödeshastigheten till ca 0.5 ml/min. Anteckna hur stor volym (voidvolymen) som samlats upp när det röda hemoglobinet närmar sig utloppet. Fortsätt sedan uppsamlandet i 1.5 ml Eppendorfrör i fraktioner om 1 ml. Fortsätt eluera till minst 2 färglösa fraktioner erhålls. Därefter mäts absorbansen på fraktionerna. Absorbansmätning och påvisande av NH 4 SO 4 Bestäm absorbansen vid 544 nm för de röda fraktionerna. Häll tillbaka proven i resp. Eppendorfrör. Om absorbansen är högre än 1.5 måste en del av provet spädas med avjonat vatten (exakt spädning med hjälp av mätpipett). Påvisa därefter sulfatjoner i alla fraktioner utom den med högst absorbans genom att tillsätta en droppe mättad Ba(NO 3 ) 2 - lösning i varje rör. Anteckna i vilka rör det blir fällning. OBS! Ba(NO 3 ) 2 är giftigt! Hanteras försiktigt och endast på anvisad plats. ε 544 nm = M -1 cm -1 M = g/mol Toppfraktionen märks upp enligt: namn (initialer eller dylikt) datum innehåll koncentration eller uppmätt absorbans Lämna toppfraktionen till handledaren för senare reningsanalys med SDS-PAGE. Ett kromatogram ska konstrueras utifrån absorbansvärdena. Avsätt hemoglobinets absorbans mot elueringsvolym i ml. Ta hänsyn till eventuell spädning av proverna genom att multiplicera det avlästa absorbansvärdet med spädningsfaktorn. Ange också på lämpligt vis i vilka fraktioner (NH 4 ) 2 SO 4 återfanns. Voidvolymen ska ingå i kromatogrammet. 20

24 Bestämning av ett proteins molekylvikt och renhet med SDS-PAGE Denna laboration går ut på att bestämma molekylvikten för ett protein genom att analysera det med sodiumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores, SDS-PAGE. Detta är en mycket vanlig metod för bestämning av ett proteins renhet. SDS-PAGE används också för att bestämma ett proteins molekylvikt. Som referenser vid analysen används ett antal proteiner med kända molekylvikter. Gelfiltrering kan också användas för detta ändamål. Elektrofores bygger på att laddade molekyler vandrar mot en av elektroderna då de placeras i ett elektriskt fält. Polyakrylamidgel är en polymerisationsprodukt av akrylamid och en förgrenare som kallas N,N -metylenbisakrylamid. Vid polymerisationen erhålls ett kontinuerligt, tredimensionellt nätverk genom att växande polyakrylamidkedjor binds samman av bisakrylamiden. För att akrylamid ska polymerisera måste katalysatorer användas så att fria radikaler bildas, vilka initierar reaktionen. Vanligen utnyttjas en blandning av ammoniumperoxodisulfat ((NH 4 ) 2 S 2 O 8 ) och tetrametyletylendiamin (TEMED) för detta ändamål. Polyakrylamidgelens tredimensionella och kontinuerliga nätverk har en bestämd porstorlek och kommer i viss mån att hindra stora och avlånga molekylers vandring. Vandringshastigheten är dessutom beroende av molekylernas nettoladdning. Proteinernas nettoladdning beror på buffertens ph. Om t.ex. ph > pi (isoelektriska punkten för proteinet) är nettoladdningen negativ. Polyakrylamidgelelektrofores, PAGE, separerar alltså molekyler efter laddning, storlek och form. När ett protein behandlas med SDS (sodiumdodecylsulfat) som är en detergent, förstörs sekundär-, tertiär- och eventuell kvartärstruktur, och en cigarrformad peptidkedja med negativ nettoladdning bildas. Nettoladdningen är direkt proportionell mot proteinets storlek och laddningstätheten blir densamma i alla protein-sds-komplex. Detta leder till att komplexen får en elektroforetisk mobilitet som är omvänt proportionell mot logaritmen för molekylvikten, d.v.s. de mindre proteinerna vandrar snabbare än de större. För att bryta disulfidbryggor och för att förhindra att nya bildas behandlas proteinerna dessutom med β-merkaptoetanol. För bestämning av ett proteins molekylvikt används ett antal referensproteiner med kända molekylvikter vid analysen, en så kallad molekylviktsstandard. Dessa appliceras i en separat brunn, men på samma gel som proteinet med okänd molekylvikt. Lämplig mängd att applicera i en brunn är 10 µg protein i 25 µl lösning. Tänk på att slutvolymen i ert beredda eppendorfrör med Hb blir ca 50 µl när provbuffert, β-merkaptoetanol och bromfenolblått tillsats! På denna laboration kommer färdiggjutna geler att användas. Det går bra att gjuta gelerna själv, men man måste då hantera de hälsovådliga kemikalierna, akrylamid och bisakrylamid, i dragskåp. Se riskanalyspärm. 21

25 Molekylviktsstandarden innehåller: Fosforylas b g/mol Serum albumin g/mol Ovalbumin g/mol BCAII g/mol Trypsinhämmare g/mol α-laktalbumin g/mol OBS! De okända proteinerna (anonyma provet) behöver inte vara samma som referensproteinerna. Lösningar Följande lösningar finns färdiga i dragskåpet. Elektrodbuffert: 30.3 g Tris, ph g Glycin 10.0 g SDS Avjonat vatten till 1000 ml utan att justera ph. Förvara vid + 4 o C. Späd 10 gånger före användning. Blanda noga. Provbuffert: 3.55 ml Avjonat vatten 1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, ph ml Glycerol 2.0 ml 10% (w/v) SDS Bromfenolblått: ca 0.05 g Bfb 100 ml avjonat vatten filtrera lösningen Infärgningslösning: Safe stain, 1 l 0,1 g Coomassie Blue G mm HCl 10% EtOH Tillsätt Coomassie till ca 900 ml dest.vatten. Tillsätt HCl. Tillsätt EtOH. Volymjustera. Sätt på omrörning över natt i rumstemp. Kan återanvändas 3 gånger. 22

26 Bereds vid labtillfället: Beredning av hemoglobinprov: 40 µl provbuffert X µl hemoglobinlösning (rådgör med labhandledare) 2 µl β-merkaptoetanol 10 µl bromfenolblått Blanda i ett Eppendorfrör och gör hål i locket med en blyertspenna eller kanyl. Värm på kokande vattenbad i 5 minuter. Beredning av anonymt prov: 40 µl avjonat vatten 40 µl provbuffert 10 µl proteinlösning (anteckna provets nr o färg) 2 µl β-merkaptoetanol 10 µl bromfenolblått Blanda i ett Eppendorfrör och gör hål i locket med en blyertspenna eller kanyl. Värm på kokande vattenbad i 5 minuter. Ta försiktigt bort den vita tapen och kammen från kassetten. Spara kammen, den ska användas senare. Skölj brunnarna med elektrodbuffert. Placera kassetten i kassetthållaren. Fyll de två buffertkamrarna med elektrodbuffert. (Görs av labhandledare) Applicera prover och referens med automatpipett. En brunn rymmer max 30 µl. Starta och kör elektroforesen vid 200 V. Avbryt körningen när banden med bromfenolblått har vandrat till slutet av gelen. Efter avslutad elektrofores, lossa kassetten från kassetthållaren. Öppna kassettens sidor genom att föra in och försiktigt vrida kammens spets i var och en av inskärningarna i sidorna. Håll plastskivan med gelen upp och ner över en skål med avjonat vatten. Lossa försiktigt gelen med en spatel så att den trillar ner i skålen. Skölj gelen genom att micra i lite avjonat vatten. Den ska bli ordentligt varm dock utan att koka. Upprepa 3 ggr och byt vatten mellan varje. (Görs av labhandledare) Häll av vattnet efter sista värmningen och häll på Safe stain så att det täcker gelen ordentligt. Micra. Låt stå över natt. För att avfärga gelen häll av Safe stainlösningen. Skölj gelen med avjonat vatten ett par gånger. Till sist häll på avjonat vatten så att gelen väl täcks och lägg i en bit av en papperservett (suger åt sig färgen). Låt stå över natt eller längre. Ställ skålen med gelen på en ljusramp och mät hur långt referensproteinerna, hemoglobinet från gelfiltreringen samt det anonyma proteinet har vandrat. Konstruera ett 23

27 diagram där vandringslängderna för referensproteinerna avsätts mot log M. Avläs från diagrammet molekylvikten för hemoglobin och för det anonyma proteinet. Av olika anledningar kan ett protein ibland uppvisa flera band. Molekylvikt för hemoglobin: g/mol Redovisning Enligt anvisningar tidigare i kompendiet. Dessutom ska följande ingå: 1. Kromatogram, kommentera separationen. 2. Beräkning av koncentrationen Hb i supernatanten som applicerades på gelen i mg/ml. 3. Noggrant avritad eller fotograferad gel. Märk ut vilka brunnar som tillhör labgruppen. 4. Kommentera Hb:s renhet. 5. Log-diagram 6. Beräkning av molekylvikt för preparerat Hb och för anonyma proteinet (ange vilket nummer det hade). Jämför med litteraturvärden och kommentera. Utförlig jämförelse mellan SDS-PAGE och gelfiltrering med avseende på molekylviktsbestämning. Utgå från teorin bakom teknikerna 24

28 LINKÖPINGS UNIVERSITET IFM/Kemi KALIBRERING AV AUTOMATPIPETT INTRODUKTION I denna laboration ska du lära dig hantera ett volumetriskt instrument, automatpipetten, på rätt sätt. För att veta om de instrument du använder verkligen visar korrekt värde och ger den önskade volymen, måste du kalibrera dessa. De kalibrerade pipetterna kommer du bl.a. att använda under spektrofotometermoment. TEORI Automatpipetterna kan antingen ha fast volym eller variabel volym. De variabla arbetar i olika intervall från 0 upp till µl, t.ex. 0,5-10 µl, 5-40 µl, µl. Efter inställning av volym (de variabla modellerna), låser man vanligen inställt värde. Vid varje mättillfälle förses automatpipetten med en plastspets. Allmänt gäller att blå spetsar passar till pipetter i intervallet µl, gula spetsar till µl. Det finns dock flera olika typer av blå och gula spetsar, så man bör försäkra sig om att spetsarna verkligen passar till den pipett man ska använda. Spetsar utgör en stor kostnad på lab. Det går att spara spetsar, om man planerar sitt experiment. Vid t.ex. pipettering av spädningsserier pipetterar man den mest utspädda lösningen först. Därigenom kan man använda samma spets flera gånger. HANDHAVANDE Automatpipetter är dyrbara precisionsintrument och måste behandlas varsamt. Om de utsätts för slag och stötar kan man inte lita på att de ger avsedd volym. En pipett med vätska i spetsen ska aldrig läggas ner. Vätskan kan rinna in och förstöra den. Om man misstänker att vätska kommit in i pipetten, ska man lämna den till labhandledare för rengöring. 25

29 PIPETTERINGSTEKNIK 1. Fäst en spets, som passar den volym du ska pipettera, på pipetten. Berör bara den övre delen av spetsen för att undvika kontamination. 2. Fatta pipetten så att du med tummen, mjukt och kontrollerat, kan trycka ner kolven på pipettens ovansida. Tryck ner till första stoppet och håll kvar i detta läge. 3. För ner spetsen några millimeter i lösningen och släpp långsamt och försiktigt upp kolven. Vänta någon sekund och kontrollera att inga luftbubblor finns i vätskepelaren. 4. Lyft upp pipetten och stryk av tippen mot kärlväggen. Om spetsen varit långt under vätskeytan, bör den torkas av med Kleenex. 5. För ner spetsen i det kärl dit lösningen ska överföras. Om pipetteringen sker till en vätska, bör spetsen sänkas ner några millimeter i denna. Tryck ner kolven till första stoppet och sedan till andra för att tömma spetsen helt. 6. Håll kolven nedtryckt och dra upp spetsen ur lösningen. 7. Skjut av spetsen med spetsavkastaren (finns på de flesta automatpipetter). KALIBRERING Innan automatpipetter används, bör man försäkra sig om att de ger rätt volym. Tyvärr är detta ett problem, och det har förstört många experiment. Vid kalibrering av pipetter använder man analysvåg och avjonat vatten och väger den volym man pipetterat. Vanligen kalibrerar man en variabel pipett vid den undre och övre gränsen för dess kapacitet. För att få tillförlitliga värden bör man göra detta ett antal gånger för varje volym. Detta ger en uppfattning om den slumpmässiga variationen i pipetteringarna. KALIBRERINGSTEKNIK Labhandledaren visar dig först, hur du hanterar en automatpipett. Därefter kalibrerar du en pipett avsedd för volymer i intervallet µl. Gör minst 5 invägningar av avjonat vatten för pipettens största resp. minsta volym. Väg på analysvåg i liten E-kolv (< 50 ml) eller i vågskepp. Anteckna mätvärdena i tabellen nedan och kontrollera att det högsta och 26

30 det lägsta värdet i en mätserie inte skiljer sig mer än 1 % från varandra, d.v.s. 0.4 mg (0.4 µl) resp. 2.0 mg (2.0 µl). Lämna in tabellen med grönt försättsblad. AUTOMATPIPETT NUMMER: 40 µl % skillnad mellan högsta och lägsta 200 µl EV. KOMMENTARER TILL HUR PIPETTEN FUNGERAR: 27

31 LINKÖPINGS UNIVERSITET IFM/Kemi ALKOHOLDEHYDROGENAS BESTÄMNING AV REAKTIONSHASTIGHETEN INLEDNING Alkoholdehydrogenas, ADH, är ett enzym som innehåller zink, och som i närvaro av koenzymet NAD + reversibelt oxiderar primära och sekundära alkoholer till motsvarande aldehyder och ketoner. ADH finns i bakterier, jäst, växter och i lever och näthinna hos djur. Jästenzymet har praktisk betydelse vid alkoholjäsning och bakning. I levern katalyserar ADH tillsammans med andra mekanismer nedbrytningen av etanol. Det ADH som finns i näthinnan har till funktion att reducera retinal till retinol (vitamin A). På så sätt regenereras det pigment som krävs vid synprocessen. Alkoholdehydrogenas från jäst har en molekylvikt på och består av fyra identiska subenheter (peptidkedjor). Det katalyserar oxidationen av etanol men även av andra alkoholer, t.ex. propanol, butanol och metanol. Reaktionshastigheterna för oxidation av de tre sistnämnda alkoholerna är lägre än 50 % av den för etanol. TEORI Följande reaktion ska studeras: R-CH 2 OH + NAD + R-CHO + NADH + H + NAD +, fungerar som acceptor för elektroner i form av hydridjoner och är nödvändig för enzymets funktion. Till skillnad från NAD + absorberar NADH ljus av våglängden 340 nm, och reaktionen kan därför följas med en spektrofotometer. Eftersom 1 mol alkohol är ekvivalent med 1 mol NADH, är absorbansförändringen per tidsenhet ett direkt mått på reaktionshastigheten, v. Reaktionshastigheten ska anges som antal µmol substrat (alkohol) som oxideras per minut, och kan beräknas med Lambert-Beers lag: A = ε. l. c A / t = ε. l. c / t v = reaktionsvolymen. c / t = reaktionsvolymen. A / t. ε. l ε för NADH vid 340 nm är M -1 cm -1, l är 1 cm. 28

32 MATERIAL Spektrofotometer och kyvetter 0.1 M pyrofosfat-glycinbuffert, ph g glycin / 300 ml buffert. Justera ph med HCl. Förvara i rumstemperatur. 0.1 M NAD + löst i bufferten. Förvara i isbad. Etanol 95 % Metanol pa Butanol pa Propanol pa ADH-lösning: Späd jäst-adh (Roche 1g/34 ml ) med buffert till 0,1 mg ADH/ml. Gör spädningen samma dag som laborationen går och förvara lösningen i isbad. Pipetter och tippar UTFÖRANDE Nollställ spektrofotometern vid 340 nm och med känsligheten 0-1 absorbansenheter. Använd pyrofosfat-glycinbufferten som referensmedium. Beräkna buffertvolym för varje ADH tillsatts så att slutvolymen vid mätningen blir 3,000 ml. a) Pipettera i kyvetten, först buffert sedan 25 µl NAD + och 25 µl EtOH. Sist tillsätts ev. ADH. Slutvolymen i kyvetten ska vara 3,000 ml. Blanda m.h.a. parafilm och torka av kyvetten med en näsduk. Ställ ner kyvetten i fotometern och tryck på START. Registrera ev. reaktion utan katalysator. Om den uteblir, behöver den inte kontrolleras i fortsättningen, men blanda ändå noga före tillsats av ADH. Blanda i en ny kyvett enligt a) och tillsätt sedan 10 µl ADH. Blanda snabbt och ställ tillbaka kyvetten i fotometern. Registrera absorbansförändringen under så lång tid att en tangent kan dras till kurvan. Töm kyvetten och skölj noga, annars kan rester av alkohol bli kvar. Upprepa försöket några gånger för att kontrollera att det går att få reproducerbara värden. Töm och skölj kyvetten. Upprepa med 25, 50, 75 resp. 100 µl ADH. Ett försök per volym. b) Enligt a) men tillsätt 25 µl propanol i stället för etanol. Dessa försök görs med 100 µl ADH. Upprepa med 25 µl butanol resp. metanol. 29

33 RESULTAT Substrat ADH ADH A / t v v 100/v etanol (µl) (mg) (min -1 ) (µmol / min) a) etanol % b) propanol 100 % butanol 100 % metanol 100 % Avsätt v (µmol/min), med etanol som substrat, mot mg ADH, även för försöket utan enzym, i ett diagram ritat på dator eller mm-papper. c) Para ihop följande ordpar : Enzym Substrat Kofaktor Produkt Aldehyd ADH Alkohol NAD+ REDOVISNING Enligt allmänna regler för rapportskrivning. Ifylld tabell och diagram över reaktionshastigheten som funktion av enzymmängden ska ingå. Glöm inte att ange enheter. Redovisa svar från uppgift c. 30

34 LINKÖPINGS UNIVERSITET IFM/Kemi TENTAMEN I BIOKEMI 1 NKEA08, 92KE kl Skriv endast en uppgift per blad. Redovisa beräkningar och motivera svar. Besvara delfrågor i tur och ordning. Hjälpmedel: miniräknare Ansvariga lärare: Magdalena Svensson (285686, ) och Helena Herbertsson (285605, ) 31

35 1.a) Rita följande tetrapeptid: Thr-Ile-Arg-Glu vid ph 7. Rita/markera huvudkedja, sidokedjor, α-kol, N- och C-terminal. Ange även vilken nettoladdning tetrapeptiden har vid ph 7. (4p) b) Nästa alla peptidbindningar i proteiner har trans konfiguration. Men en aminosyra finner man någorlunda ofta i cis form, vilken och varför? 2p c) Vilken information om ett proteins struktur kan du få genom att studera en Ramachandranplot? 1p d) Vilken typ av bindningar stabiliserar en α helix? Ange även två faktorer som destabiliserar en α helix. 3p 2.a) Du har med hjälp av gelfiltreringskromatografi renat fram ett protein Q, från en blandning av proteiner. Se tabell nedan. Protein Mw A B C Q Visa hur ett kromatogram skulle kunna se ut efter detta reningssteg. Ange enhet på axlarna i kromatogrammet samt indikera var i kromatogrammet som protein Q återfinns. (3p) b) För att kontrollera renheten av protein Q körs en SDS-PAGE. Hur förväntar du dig att gelen ser ut under förutsättning att protein Q är ett heterodimert protein? (2p) c) Protein Q har ett pi på 4,3. Vilken typ av aminosyror är troligen vanliga i detta protein? (2p) d) Du har ett vattenlösligt globulärt enzym. För att närmare studera den katalytiska aktiviteten hos detta enzym muterar du en Lys i aktiva ytan till i tur och ordning Asn, Glu och Arg. Vilken effekt av enzymaktiviteten förväntar du dig vid: i) Lys Asn ii) Lys Glu iii)lys Arg (3p) 32

36 3. a) Reaktionshastigheten för en enzymkatalyserad reaktion mättes vid olika temperaturer, se figur nedan. Förklara varför reaktionshastigheten först ökar med ökande temperatur för att sedan drastiskt avta. (3p) b) Förklara följande två begrepp: i) koenzym ii) produktinhibering (4p) c) ATP-syntas är ett multienzymkomplex som katalyserar ATP-syntes. i) Vilken/vilka subenheter är direkt involverade i katalysen? ii) De subenheter hos ATP-syntas vilka är lokaliserade till membranet består mestadels av α-helixstruktur. Varför är α-helixstruktur fördelaktigare för membranproteiner än β-flak? (3p) 4. a) i) Hur är triacylglycerol uppbyggd? ii) Vad har triacylglycerol respektive fosfolipider för funktion i kroppen? (2p) b) Vilken molekyl kan kallas kroppens energivaluta och varför är denna molekyl så energirik? (2p) c) Vad har NAD + och FAD för funktion i kroppen? (1p) d) Var i cellen sker glykolysen och vilken är glykolysens slutprodukt? (1p) 33

37 e) i) Vad omvandlas glykolysens slutprodukt till i det direkt påföljande steget då O 2 finns tillgängligt och ange en process där den molekylen förbrukas? ii) Ge ett exempel på vad som kan bildas i frånvaro av O 2. (2p) f) I glykolysen bryts glukos ner medan processen då glukos bildas kallas glukoneogenesen. Glukoneogenesen brukar ibland kallas för en omvänd glykolys. Det är inte helt sant för vissa av reaktionsstegen är olika. Ge exempel på ett steg som skiljer sig åt, beskriv på vad sätt det skiljar sig åt och varför är det inte helt omvända processer? (2p) 5. a) Glukosmetabolismens totalreaktion kan skrivas C 6 H 12 O O 2 6 CO H 2 O + energi. i) I vilken process krävs egentligen O 2 och till vad? ii) Ge exempel på ett steg där CO 2 frigörs. (2p) b) i) Hur kopplas elektrontransporten i andningskedjan till ATP-syntes? (1p) ii) Beskriv elektronernas vandring i elektrontransportkedjan. (2p) c) Under vilka betingelser bildas ketonkroppar och vilket ämne fungerar som utgångsmaterial? (2p) d) Vad menas med att citronsyracykeln är en amfibol process? (1p) e) Då en mättad fettsyra, dodekansyra/laurinsyra, som innehåller 12 kolatomer bryts ner bildas motsvarande 78 ATP. i) Motsvarande hur mycket ATP bildas i de första delstegen då den här fettsyran bryts ner till acetylcoa? ii) Motsvarande hur mycket ATP fås sedan när all acetylcoa bryts ner i citronsyracykeln? (2p) 6. a) Skissa översiktligt på händelseförloppet från att en ligand binder till en receptor, som exempelvis β-adrenerga receptorn som diskuterats under kursen, tills proteinkinas A (PKA) aktiveras. (2p) b) Fosforyleringar är ett vanligt sätt att ändra ett enzyms aktivitet, antingen ökar aktiviteten efter forforylering eller så minskar den. i) Vad kallas ett enzym som fosforylerar ett annat enzym? ii) Ge en förklaring till hur fosforylering kan ha så stor betydelse för ett enzyms aktivitet. (2p) 34

38 c) Ofta är energistatus ett viktigt kontrollkriterium. Borde fettsyrasyntes eller β-oxidation aktiveras om [ATP] är hög? Motivera. (1p) d) i) Processen då nukleotidsekvens i DNA omvandlas till aminosyrasekvens i ett protein delas upp i två delprocesser. Vilka och vad sker vid respektive delprocess? ii) trna-molekyler spelar en avgörande molekyl i en av dessa delprocesser. Beskriv deras funktion. (3p) e) Varför finns det DNA-polymeraser med s k exonukleasfunktion medan motsvarande inte finns hos några RNA-polymeraser och vad innebär exonukleasfunktionen? (1p) f) Vad är en intron och vad kallas processen då exoner och introner separeras? (1p) 35

39 36