Handbok till RespiFinder RG Panel

Mars 2015 Handbok till RespiFinder RG Panel 25 Version 1 Kvalitativ in vitro-diagnostik För användning med Rotor-Gene Q-instrument 4692163 PathoFinder B.V., Randwycksingel 45, 6229 EG Maastricht, NEDERLÄNDERNA Distribueras av QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND R2 1075775SV Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN är den ledande tillverkaren av innovativa provtagnings- och analystekniker som möjliggör isolering och detektion av innehållet i alla biologiska prover. Våra avancerade produkter och tjänster av hög kvalitet garanterar framgång från prov till resultat. QIAGEN skapar standarder inom: rening av DNA, RNA och proteiner nukleinsyra- och proteinanalyser mikrorna-forskning och RNAi automatisering av provtagnings- och analystekniker Vårt uppdrag är att göra det möjligt för dig att uppnå utomordentliga framgångar och genombrott. Det finns mer information på www.qiagen.com.

Innehåll Avsedd användning 4 Sammanfattning och förklaring 4 Testprincip 5 Målgener 7 Material som medföljer 10 Kitinnehåll 10 Material som behövs men inte medföljer 10 Varningar och försiktighet 11 Allmänna försiktighetsåtgärder 12 Förvaring och hantering av reagens 13 Hantering och förvaring av prover 13 Procedur 14 Extraktion och beredning av nukleinsyra 14 Använda en negativ kontroll 14 Använda en intern kontroll och bärar-rna 15 Protokoll PCR-amplifiering och smältanalys 17 Tolkning av resultat 34 Normalisering 34 Analys 34 Tröskel 34 Felsökningshandbok 35 Kvalitetskontroll 39 Begränsningar 40 Prestandaegenskaper 40 Litteraturhänvisningar 40 Symboler 40 Kontaktinformation 41 Beställningsinformation 42 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 3

Avsedd användning RespiFinder RG Panel är ett kvalitativt multiplex-pcr-test för att detektera och differentiera 16 RNA-virus,* 2 DNA-virus och 3 bakterier, vilka samtliga kan orsaka luftvägsinfektioner hos människor: adenovirus, bocavirus, corona NL63, corona OC43, corona 229E, corona HKU1, hmpv, influensa A, influensa B, influensa A H1N1v, parainfluensa 1, parainfluensa 2, parainfluensa 3, parainfluensa 4, rhinovirus/enterovirus, RSV-A, RSV-B, Bordetella pertussis, Legionella pneumophila och Mycoplasma pneumoniae. RespiFinder RG Panel underlättar diagnostiseringen av luftvägsinfektion när den används tillsammans med andra kliniska fynd och laboratoriefynd. Negativa resultat indikerar inte nödvändigtvis frånvaro av viral eller bakteriell luftvägsinfektion; negativa resultat ska inte användas som den enda grunden för beslut om diagnos, terapi eller övrig behandling. Positiva resultat utesluter inte samtidig infektion med andra patogener. Den eller de detekterade patogenerna behöver inte vara den definitiva sjukdomsorsaken. Andra laboratorietester och bedömningar av den kliniska presentationen måste inkluderas i den slutliga diagnosen. Produkten ska endast användas av utbildad laboratoriepersonal. Sammanfattning och förklaring Akut luftvägsinfektion är den mest utbredda typen av akut infektion hos vuxna och barn och är en signifikant sjukdomsorsak hos patienter med nedsatt immunförsvar. Luftvägsinfektioner (LVI) brukar delas in i övre luftvägsinfektioner (ÖLI) och nedre luftvägsinfektioner (NLI). ÖLI inkluderar rinorré, konjunktivit, faryngit, otitis media och sinuit. NLI inkluderar pneumoni, bronkiolit och bronkit. Både virus och bakterier kan orsaka akut LVI, och antalet kausala agens är både stort och diversifierat, vilket utgör en stor utmaning vid diagnostisering. Nukleinsyraamplifieringstest har visat sig vara snabba, sensitiva och specifika alternativ i antingen singleplex- eller multiplex-format. Multiplex-assayer möjliggör samtidig amplifiering av mer än ett mål, vilket ger insikt i signifikansen för blandade infektioner och luftvägssjukdomens prognos och recidiv. * RespiFinder RG Panel detekterar 16 RNA-virus men differentierar inte rhinovirus från enterovirus. 4 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Testprincip RespiFinder RG Panel är baserad på SmartFinder-tekniken, en teknik som möjliggör en mycket komplex analys av upp till 13 mål i en enda reaktion med realtids-pcr. RespiFinder RG Panel innehåller olika uppsättningar av MultiFinder-prober i kombination med 12 fluorescensmärkta prober för SMART (single-tube multiplex amplification in real time, multiplex-amplifiering i realtid i ett enda rör) som gör det möjligt att detektera 21 olika patogener plus en intern kontroll. Reaktionen startar med en pre-amplifiering som kombinerar ett steg med omvänd transkription med ett PCR-steg för att amplifiera det (c)dna som utgör målet. Därefter överförs en del av pre-amplifieringsreaktionen till 2 PCRrör. Två separata SmartFinder-reaktioner utförs, vilka består av ett steg för probhybridisering och ett steg för probligering och -amplifiering. Detektionen utförs med användning av smältkurvsanalys. En schematisk beskrivning av hela arbetsflödet visas i figur 1. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 5

Figur 1. Översikt över arbetsflödet med RespiFinder RG Panel. RespiFinder RG Panel används tillsammans med Rotor-Gene Q MDx- eller Rotor- Gene Q-instrument för att detektera nukleinsyror i patogen(er). En intern kontroll (IC) ingår i assayen för att skilja mellan äkta negativa prover och falska negativa prover på grund av nukleinsyranedbrytning, PCR-inhibering eller misslyckat test. Det tillförda provet består av totala nukleinsyror som har extraherats och renats från nasofaryngeala pinnprover. Beredningen av prover är en separat process som inte ingår i panelen. Använd lämpliga metoder eller produkter för att hantera patientprover och extrahera och rena nukleinsyror (se Hantering och 6 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

förvaring av prover, sidan 13, och Extraktion och beredning av nukleinsyra, sidan 14). Målgener Målgener som används för prob- och primerutformning visas i tabell 1. Tabell 1. Målgener för RespiFinder RG Panel Mål Kontroll Gen Patogenk od Intern kontroll (IC) MS2 phage lysis protein gene IC Virus Adenovirus Hexon gene (H) Adeno Bocavirus Noncapsid gene (NP1) Boca Corona 229E Nucleocapsid protein gene (NP) 229E Corona HKU1 Nucleocapsid phosphoprotein gene (N) HKU1 Corona NL63 Nucleocapsid protein gene (NP) NL63 Corona OC43 Nucleocapsid protein gene (NP) OC43 hmpv Nucleocapsid protein gene (NP) hmpv Influensa A Matrix protein gene (M1) InfA Influensa B Matrix protein gene (M1) InfB Influensa A H1N1v Neuraminidase gene H1N1 Parainfluensa 1 Parainfluensa 2 Parainfluensa 3 Hemagglutinin-neuraminidase gene (HN) Hemagglutinin-neuraminidase gene (HN) Hemagglutinin-neuraminidase gene (HN) PIV1 PIV2 PIV3 Parainfluensa 4 Major nucleocapsid protein gene (N) PIV4 Tabell fortsätter på nästa sida Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 7

Tabell 1. Fortsättning Mål Virus (fortsättning) Rhinovirus/ enterovirus Gen 5' untranslated region polyprotein gene (PP) Patogenk od Rhino/ entero RSV-A Major nucleocapsid protein gene (N) RSVA RSV-B Major nucleocapsid protein gene (N) RSVB Bakterier Bordetella pertussis Insertionssekvens 481 (IS481) B. pert Chlamydophila pneumoniae* Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Major outer membrane gene (OmpA) Macrophage inhibitor potentiator gene (Mip) Cytadhesin protein gene (P1) C. pneu L. pneu M. pneu * Obs! Detektionen av Chlamydophila pneumoniae med RespiFinder RG Panel är endast avsedd att användas i forskning. Den ska inte användas för diagnostik. Avsikten är inte att utfärda några garantier eller utfästelser avseende tillhandahållandet av information för diagnos, förebyggande eller behandling av en sjukdom. För varje prov utförs en pre-amplifiering och 2 SmartFinder-reaktioner. Patogenerna, märkningarna och den indikerade Tm (smältpunkten) för de motsvarande SMART-hybridiseringsproberna i de 2 SmartFinder-reaktionerna visas i tabell 2. 8 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Tabell 2. Mål och motsvarande Tm-värden för SMART-prober Märkning SMART-prob Tm ( C) acceptansintervall Patogenkod (blandning 1) Patogenkod (blandning 2) Cy5 prob 1 50,5 53,5 L. pneu OC43 Cy5 prob 2 54,5 57,5 B. pert NL63 Cy 5 Cy5 prob 3 60,0 63,0 Rhino/entero 229E Cy5 prob 4 66,0 69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 prob 5 70,5 73,5 M. pneu Cy5 prob 6 76,5 79,5 H1N1 ROX prob 1 52,5 55,5 RSVA PIV1 ROX prob 2 57,5 60,5 Adeno PIV2 ROX ROX prob 3 62,5 65,5 hmpv PIV3 ROX prob 4 66,5 69,5 RSVB PIV4 ROX prob 5 72,5 75,5 InfA Boca ROX prob 6 76,5 79,5 InfB BHQ 1 BHQ1 prob 1 70,5 73,5 IC IC * Obs! Detektionen av Chlamydophila pneumoniae med RespiFinder RG Panel ska endast göras för användning i forskning. Den ska inte användas för diagnostik. Avsikten är inte att utfärda några garantier eller utfästelser avseende tillhandahållandet av information för diagnos, förebyggande eller behandling av en sjukdom. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 9

Material som medföljer Kitinnehåll RespiFinder RG Panel (25) Katalognr 4692163 Antal reaktioner 25 Innehåll Lockfärg Volym Pre-amplification Master Mix (Masterblandning för pre-amplifiering) Lila 180 µl Internal Control (IC) (Intern kontroll) Svart 300 µl Pre-amplification Primermix (Primerblandning för pre-amplifiering) Hybridization Buffer (Hybridiseringsbuffert) Vitt 65 µl Gult 80 µl Probemix 1 (Probblandning 1) Rött 40 µl Probemix 2 (Probblandning 2) Blått 40 µl TwoStep Buffer (TwoStep-buffert) Grönt (i guldbrunt rör) 1 600 µl Ligase Enzyme (Ligasenzym) Brunt 50 µl Taq Polymerase (Taq-polymeras) Orange 20 µl Dilution Buffer (Spädningsbuffert) Transparent 1 700 µl RespiFinder RG Panel Handbook (Handbok till RespiFinder RG Panel) (Engelska) 1 Material som behövs men inte medföljer Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Om du vill ha mer information hänvisas till tillämpliga säkerhetsdatablad (SDS) som kan erhållas från produktleverantören. 10 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Reagenser RNA/DNA-extraktionskit (se Extraktion och beredning av nukleinsyra, sidan 14) Vatten, fritt från RNas/DNas Förbrukningsprodukter Engångsspetsar som innehåller hydrofoba filter Engångsspetsar med låg retention som innehåller hydrofoba filter RNas/DNas-fria rör om 1,5 ml RNas/DNas-fria PCR-rör om 0,2 ml (enkelrör med lock eller strip-rör med individuella lock) Strip Tubes and Caps (strip-rör och lock), 0,1 ml (kat.nr 981103 eller 981106) för användning med Rotor-Gene Q-instrument Utrustning Justerbara pipetter:* 0,1 2 µl, 2 20 µl, 20 200 µl Justerbar flerkanalspipett:* 1 10 µl (valfritt) Vortexblandare* Bänkcentrifug* med rotor för 2 ml-rör Centrifug* för 0,2 ml-reaktionsrör Kylblock eller is Termocykler* för 0,2 ml PCR-rör med ett uppvärmt lock och rampfrekvenser på 1 5 C/sekund (för pre-amplifiering och hybridisering; t.ex. GeneAmp PCR System 9700 blockbaserad termocykler) Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-* eller Rotor-Gene Q 5plex HRM*- instrument och tillbehör Varningar och försiktighet För in vitro-diagnostisk användning Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt säkerhetsdatablad (SDS) för mer information. Dessa är tillgängliga online i praktiskt och kompakt PDF-format * Säkerställ att instrumenten är kontrollerade och kalibrerade enligt tillverkarens rekommendationer. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 11

på www.qiagen.com/safety där du kan hitta, granska och skriva ut datablad för alla kit och kitkomponenter från QIAGEN. Säkerhetsinformation för reningskitet som används: se relevant kithandbok. Säkerhetsinformation om instrument: se användarhandboken för respektive instrument. Kassera prov- och analysavfall enligt lokala säkerhetsregler. Allmänna försiktighetsåtgärder Var alltid noga med följande: Denna molekylära assay ska endast utföras av kvalificerad laboratoriepersonal. Förvara och extrahera positiva material (patientprover och positiva kontroller) separerade från alla andra reagenser och tillsätt dem till reaktionsblandningen på en separat plats. Använd engångshandskar vid utförandet av assayen. Använd engångsspetsar som innehåller hydrofoba filter för att förhindra korskontaminering. Använd engångsspetsar med låg retention som innehåller hydrofoba filter vid hantering av RT-PCR-enzymblandning, ligasenzym och Taq-polymeras. Använd PCR-flaskor som är fria från RNas/DNas. Tina alltid RNA/DNA-prover på is och förvara dem på is eller i ett kylblock. Förvara alltid enzymer på is eller i ett kylblock när de är utanför frysen. Hantera enzymer med försiktighet och blanda mycket varsamt. När reagenser är tinade ska de centrifugeras i 5 sekunder i en centrifug och blandas försiktigt genom pipettering upp och ned. Alla cykling-program ska matas in i Rotor-Gene Q-programvaran innan assayen utförs. Centrifugera alltid PCR-flaskor och -plattor kortvarigt och öppna försiktigt för att undvika aerosoler. Obs! För att förhindra kontaminering rekommenderar vi starkt att experimenten utförs i PCR-dragskåp, i följande 3 separata områden: Område 1: Bered masterblandningarna för pre-amplifiering, hybridisering och ligering/smältanalys. 12 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Område 2: Tillsätt RNA/DNA-prov till blandningen. Område 3: Utför pre-amplifiering, hybridisering och smältkurvsanalys i 3 steg: Utför pre-amplifieringen. Tillsätt pre-amplifieringsprodukter till hybridiseringsblandningen (helst inne i ett PCR-dragskåp) och utför hybridisering. Tillsätt hybridiseringsprodukter till TwoStep-blandningen (helst inne i ett PCR-dragskåp) och utför ligering, amplifiering och smältkurvsanalys. Förvaring och hantering av reagens Komponenterna i RespiFinder RG Panel ska förvaras mörkt vid 30 till 15 C och är stabila fram till det utgångsdatum som anges på etiketten. Upprepad tining och frysning (>5 x) ska undvikas, eftersom detta kan försämra assayens prestanda. Hantering och förvaring av prover Detektionen av respiratoriska patogener är beroende av insamling av patientprover av hög kvalitet, snabb transport av proverna till laboratoriet och lämplig förvaring innan proverna testas på laboratoriet. Nasofaryngeala pinnprover är lämpliga för detektionen av virala och/eller bakteriella infektioner i luftvägarna. Kliniska patientprover ska transporteras till laboratoriet så snart som möjligt, delas upp i alikvoter och bearbetas. Patientproverna ska förvaras vid 4 C. Om de inte kan bearbetas inom 48 timmar ska de förvaras frysta vid eller under 20 C, helst 70 C. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 13

Procedur Extraktion och beredning av nukleinsyra QIAamp MinElute Virus Spin Kit från QIAGEN, som visas i tabell 3, är validerat för rening av DNA och RNA från den indikerade humana provtypen som ska användas med RespiFind RG Panel. Utför nukleinsyrareningen enligt anvisningarna i handboken till kitet. Tabell 3. Reningskit som är validerat för användning med RespiFinder RG Panel Provtyp Nasofaryngeala pinnprover Kit för nukleinsyraisolering QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) Katalognummer (QIAGEN) 57704 Använd 200 µl provmaterial och eluera i 60 µl elueringsbuffert. Vi rekommenderar starkt att du inte försöker koncentrera nukleinsyrorna eftersom detta kan öka risken för inhibering av RT-PCR-enzymerna. En intern kontroll tillsätts till det lyserade provet (se Använda en intern kontroll och bärar-rna, sidan 15). När du använder QIAamp MinElute Virus Spin Kit rekommenderar vi att du tillsätter lyseringsbuffert till provet i ett dragskåp med laminärt luftflöde. Extraktionsproceduren kan fortsätta på en bänk så snart provet är lyserat. Det är tillrådligt att dekontaminera dragskåpet med laminärt luftflöde efter användning med en dekontamineringslösning (t.ex. 1 000 ppm blekmedel)* och belysa med UV-ljus i 30 minuter. Förhindra i möjligaste mån frysning-tiningscykler av extraherat DNA/RNA och förvara nukleinsyraextrakt vid 4 C när de bearbetas inom en dag. För längre perioder ska extraherat RNA/DNA förvaras vid 20 C eller 70 C. Använda en negativ kontroll Varje körning ska innehålla en negativ kontroll. En negativ kontroll består av 200 µl vatten för PCR plus intern kontroll (IC). Denna negativa kontroll * Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Om du vill ha mer information hänvisas till tillämpliga säkerhetsdatablad (SDS) som kan erhållas från produktleverantören. 14 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

behandlas som ett vanligt prov, inklusive proceduren för extraktion av nukleinsyra. I den slutliga analysen fungerar signalen för den negativa kontrollen som en referens för bakgrundssignalen i FAM/ROX- och FAM/Cy5- kanaler och för den positiva IC-signalen i kanalen Green (grön) (IC). Använda en intern kontroll och bärar-rna Vid användningen av QIAamp MinElute Virus Spin Kit i kombination med RespiFinder RG Panel krävs att den interna kontrollen (IC) förs in i reningsförfarandet för att övervaka effektiviteten av provberedning och analys nedströms. Dessutom krävs det beredning av bärar-rna för QIAamp MinElute Virus Spin Kit. IC är en MS2-fag och tillhandahålls som en kontroll för lysering, RNA/DNAextraktion, assayprestanda för RespiFinder RG Panel och som kontroll för möjlig PCR-inhibering. IC tillsätts tillsammans med bärar-rna till lyseringsbufferten innan provet tillsätts. Mängden tillsatt IC är oberoende av provets initiala volym. Mängden tillsatt IC är beroende av elueringsvolymen. Med användning av QIAamp MinElute Virus Spin Kit elueras extraherat RNA/DNA i 60 µl. Volymen IC som ska tillsättas till AL-buffert är 5,5 µl per prov (se tabell 4). I fall av en kraftig infektion och/eller flera infektioner är IC-smälttoppen eventuellt inte synlig i den slutliga analysen. Detta förklaras av det faktum att stora mängder patogennukleinsyra förbrukar det mesta av reagenserna i assayen. När IC-signalen saknas trots att det finns en eller flera specifika smälttoppar vilket indikerar en infektion, är assayen följaktligen fortfarande giltig. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 15

Tabell 4. Volymer av AL-buffert, blandning av bärar-rna och AVE-buffert, samt IC som krävs Antal prover Volym ALbuffert (ml) Volym bärar- RNA-AVE (µl) Volym för intern kontroll (µl) 1 0,22 6,2 5,5 2 0,44 12,3 11 3 0,66 18,5 16,5 4 0,88 24,6 22 5 1,1 30,8 27,5 6 1,32 36,9 33 7 1,54 43,1 38,5 8 1,76 49,2 44 9 1,98 55,4 49,5 10 2,2 61,5 55 11 2,42 67,7 60,5 12 2,64 73,8 66 16 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Protokoll: PCR-amplifiering och smältanalys Saker som ska utföras före start Tina templat-rna/dna (om fryst) och alla reagenser, och förvara rören på is. Bered något större mängder än vad som behövs av de olika blandningarna för att kompensera för pipetteringsförluster. Procedur Pre-amplifiering 1. Vänd på masterblandningen för pre-amplifiering flera gånger för att säkerställa att masterblandningen är helt tinad och homogeniserad. Centrifugera röret kortvarigt. Bered blandningen för preamplifieringsreaktion i enlighet med tabell 5 och förvara den på is. Reaktionsblandningen innehåller vanligtvis alla komponenter som behövs för PCR, förutom provet. Obs! Hybridiseringsblandningarna (steg 6) och TwoStep-blandningen (steg 12) kan beredas samtidigt med pre-amplifieringsblandningen och ska förvaras mörkt vid 4 C fram till användning. Det går bara att bereda alla 3 blandningarna samtidigt när hela protokollet följs utan förseningar; det får inte vara några pauser mellan de olika stegen. Det kan inte garanteras att blandningarna är stabila efter längre förvaring (t.ex. över natten). Tabell 5. Beredning av reaktionsblandningen för pre-amplifiering Antal prover (färg på lock till reagensrör) 1 12 Spädningsbuffert (transparent) 6,25 µl 75 µl Masterblandning för pre-amplifiering (lila) Primerblandning för pre-amplifiering (vitt) 6,25 µl 75 µl 2,5 µl 30 µl Total volym 15 µl 180 µl Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 17

2. Blanda försiktigt men noggrant blandningen för pre-amplifieringsreaktion och pipettera 15 µl av blandningen i varje 0,2 ml PCR-rör. Tillsätt sedan 10 µl av eluerad prov-dna/rna eller negativ kontroll (se tabell 6). 3. Tillslut PCR-rören. Blanda väl. Centrifugera rören kortvarigt och sätt tillbaka rören på is eller i ett kylblock. Tabell 6. Beredning av pre-amplifieringsreaktionerna Antal prover 1 12 Blandning för preamplifieringsreaktion 15 µl 15 µl vardera Prov eller negativ kontroll 10 µl 10 µl vardera Total volym 25 µl 25 µl vardera 4. Programmera den blockbaserade termocyklern enligt tabell 7. Tabell 7. Termocyklerprogram för pre-amplifiering Omvänd transkription: 20 minuter 50 C Initialt aktiveringssteg: 2 minuter 95 C 3-stegscykling: Denaturering 25 sekunder 94 C Annealing (hybridisering) 25 sekunder 55 C Elongering 40 sekunder 72 C Antal cykler 40 Uppehåll: 20 C 5. Starta pre-amplifieringsprogrammet medan PCR-rören är kvar på is. Vänta tills termocyklern når 50 C. Placera sedan rören i blocket i termocyklern och stäng det uppvärmda locket. 18 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Hybridisering 6. Bered hybridiseringsblandning 1 enligt tabell 8 och hybridiseringsblandning 2 enligt tabell 9, och blanda försiktigt men noggrant. Om hybridiseringsblandningarna bereddes redan i steg 1 väntar du tills pre-amplifieringsprogrammet är avslutat och fortsätter sedan till steg 7. Tabell 8. Beredning av hybridiseringsblandning 1 Antal prover (färg på lock till reagensrör) 1 12 Hybridiseringsbuffert (gult) 1,5 µl 18 µl Probblandning 1 (rött) 1,5 µl 18 µl Spädningsbuffert (transparent) 3,0 µl 36 µl Total volym av hybridiseringsblandning 1 6,0 µl 72 µl Tabell 9. Beredning av hybridiseringsblandning 2 Antal prover (färg på lock till reagensrör) 1 12 Hybridiseringsbuffert (gult) 1,5 µl 18 µl Probblandning 2 (blått) 1,5 µl 18 µl Spädningsbuffert (transparent) 3,0 µl 36 µl Total volym av hybridiseringsblandning 2 6,0 µl 72 µl 7. För varje prov pipetteras 6 µl hybridiseringsblandning 1 i ett nytt PCR-rör, och 6 µl hybridiseringsblandning 2 pipetteras i ett nytt PCR-rör. 8. När pre-amplifieringsprogrammet avslutas (steg 5) tar du ut PCR-rören ur termocyklern och centrifugerar kortvarigt. Pipettera 2 µl av varje pre-amplifieringsreaktion i vart och ett av de 2 rören ett med hybridiseringsblandning 1 och ett med hybridiseringsblandning 2 (se tabell 10). Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 19

Tabell 10. Beredning av hybridiseringsreaktionerna Antal prover 1 12 Hybridiseringsblandning 1 (steg 7) 6,0 µl 6,0 µl vardera Pre-amplifieringsreaktion (steg 8) 2,0 µl 2,0 µl vardera Total volym 8,0 µl 8,0 µl vardera Hybridiseringsblandning 2 (steg 7) 6,0 µl 6,0 µl vardera Pre-amplifieringsreaktion (steg 8) 2,0 µl 2,0 µl vardera Total volym 8,0 µl 8,0 µl vardera 9. Tillslut PCR-rören och centrifugera kortvarigt. 10. Programmera den blockbaserade termocyklern enligt tabell 11. Tabell 11. Termocyklerprogram för hybridisering Denaturering: 10 minuter 98 C Hybridisering av proberna: 30 minuter 60 C Uppehåll: 60 C 11. Placera rören som innehåller blandningarna av pre-amplifieringsreaktion och hybridiseringsblandningar i blocket i termocyklern och stäng det uppvärmda locket. Starta hybridiseringsprogrammet. Ligering och PCR 12. Bered TwoStep-blandningen enligt tabell 12. Blanda försiktigt men noggrant och förvara på is fram till användning. Obs! Eftersom proverna delades i 2 delar (hybridiseringsblandning 1 och hybridiseringsblandning 2), måste TwoStep-blandningen beredas tvåfalt. Det behövs 32,0 µl TwoStep-blandning till varje hybridiseringsblandning. Om TwoStep-blandningen bereddes redan i steg 1 fortsätter du med steg 13. 20 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Tabell 12. Beredning av TwoStep-blandningen Antal prover (färg på lock till reagensrör) 1* 2 x 1 2 x 12 TwoStep-buffert (grönt) 30,6 µl 61,2 µl 734,4 µl Ligasenzym (brunt) 1,0 µl 2,0 µl 24,0 µl Taq-polymeras (orange) 0,4 µl 0,8 µl 9,6 µl Total volym 32,0 µl 64,0 µl 768,0 µl * Obs! Beredning av 1x TwoStep-blandning behövs aldrig eftersom 2 x 1-volymen av TwoStep-blandning måste beredas för varje prov. 13. Skapa en temperaturprofil för Rotor-Gene Q-instrumentet enligt följande steg. En översikt över termocyklerprogrammet visas i tabell 13, sidan 22. Inställning av allmänna analysparametrar Figur 2, 3 Skapa nya kanaler Figur 4 7 Redigera förstärkningen Figur 8, 9 Programmera temperaturprofilen Figur 10 16 Programmera smältprogrammet Figur 17, 18 Sammanfattning och spara templatet Figur 19, 20 Starta körningen Figur 21 Alla specifikationer hänför sig till Rotor-Gene Q, programversion 2.1.0. Mer information om hur du programmerar Rotor-Gene Q-instrument hittar du i användarhandboken till instrumentet. I illustrationerna är dessa inställningar inramade i svart fet stil. Illustrationer ingår för RotorGene Q-instrument. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 21

Tabell 13. Översikt över termocyklerprogram för TwoStep-cykling Kommentarer Ligering av proberna: 15 minuter 54 C Initialt denatureringssteg: 2 minuter 95 C PCR 1: 3-stegscykling: Denaturering 15 sekunder 94 C PCR med hög specificitet Annealing (hybridisering) 15 sekunder 60 C Elongering 15 sekunder 72 C Antal cykler 10 PCR 2: 3-stegscykling: Denaturering 15 sekunder 94 C Annealing (hybridisering) 15 sekunder 50 C Insamling* Denaturering 15 sekunder 72 C Antal cykler 23 Denaturering: 2 minuter 95 C Smältprogram: 45 85 C Insamling * Insamlingskanaler: Green (grön), förstärkning 4; Red (röd), förstärkning 1; FAM /ROX, förstärkning 8; och FAM/Cy5, förstärkning 10. Insamlingskanaler: Green, Red, FAM/ROX och FAM/Cy5. Använd Optimize gain before melt on all tubes (Optimera förstärkning före smältning på alla rör.) The gain giving the highest fluorescence less than 95 will be selected (Förstärkningen som ger högst fluorescens under 95 väljs). 22 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

14. Öppna först dialogrutan New Run Wizard (Guide för ny körning) (figur 2). Kryssa i rutan Locking Ring Attached (Låsring fäst) och klicka på Next (Nästa). 1 2 Figur 2. Dialogrutan New Run Wizard 15. Välj 40 för reaktionsvolymen och klicka på Next (figur 3). 1 2 Figur 3. Inställning av allmänna assayparametrar Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 23

16. Klicka på knappen Create New (Skapa ny) i nästa dialogruta New Run Wizard (figur 4) och programmera 2 ytterligare kanaler, så som visas i figur 5 7. 1 Figur 4. Skapa nya kanaler. 1 2 Figur 5. Skapa ny kanal FAM/ROX. 24 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

1 2 Figur 6. Skapa ny kanal FAM/Cy5. 1 2 Figur 7. Nya kanaler inkluderade. 17. Redigera förstärkningen för varje kanal så som visas i figur 8. De slutliga förstärkningsinställningarna för varje kanal anges i figur 9. Förstärkningsinställningarna för Rotor-Gene Q-instrumentet väljs för att förhindra saturation i detektionskanalerna. Om saturation observeras i någon av detektionskanalerna, ska dock förstärkningsinställningarna för denna saturerade kanal anpassas och en ny smältkurvsanalys ska utföras. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 25

1 2 Figur 8. Redigera förstärkningen. Som ett exempel visas i figuren inställning av förstärkning till 4 för kanalen Cycling Green. 1 Figur 9. Slutliga förstärkningsinställningar för alla kanaler. Kanaler som krävs är: Green, förstärkning 4; Red, förstärkning 1; FAM/ROX, förstärkning 8; och FAM/Cy5, förstärkning 10. 26 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

18. Klicka på knappen Edit Profile (Redigera profil) i nästa dialogruta New Run Wizard, (figur 10), och programmera temperaturprofilen enligt figur 11 13. 1 Figur 10. Redigera profilen. 1 2 Figur 11. Ligering av proberna. 3 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 27

1 2 3 Figur 12. Initialt denatureringssteg. 1 2 5a 4 5 3 Figur 13. Amplifiering av de ligerade proberna. 6 28 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

1 2 4a 4 5 3 Figur 14. Amplifiering av de ligerade proberna inklusive signalinsamling vid 50 C. Kanaler som behövs för insamling visas i figur 15. 6 1 2 Figur 15. Urval av alla kanaler som behövs för insamling. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 29

1 2 Figur 16. Denaturering av PCR-produkter och prober. 3 1 2 Figur 17. Smältprogram. 3 30 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

1 2 Figur 18. Insamling under smältprogram. 1 Figur 19. Sammanfattning av temperaturprofil. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 31

19. Spara templatet för senare användning (figur 20). 1 Figur 20. Spara templat för senare användning. 20. Låt TwoStep-blandningen (från steg 12) utjämnas till rumstemperatur (15 25 C) och pipettera 32,0 µl av TwoStep-blandningen i varje strip-rör för Rotor-Gene Q-instrumentet. Obs! För varje prov ska 32,0 µl TwoStep-blandning pipetteras i vart och ett av 2 nya rör. 21. Pipettera varje hybridiseringsreaktion (8 µl) i strip-rören som innehåller TwoStep-blandningen. Den slutliga volymen är 40 µl per prov. Obs! Håll kvar hybridiseringsreaktionerna vid 60 C tills de tillsätts till TwoStep-blandningen. 22. Tillslut strip-rören med lämpliga lock och placera dem omedelbart i rotorn till Rotor-Gene Q-instrumentet. 23. Placera rotorn i Rotor-Gene Q-instrumentet. Kontrollera att låsringen (tillbehör till Rotor-Gene-instrumentet) är placerad överst på rotorn för att förhindra att rören öppnas av misstag under körningen. 32 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

24. Starta körningen (figur 21) med användning av det sparade templatet (steg 19). 1 Figur 21. Starta körningen. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 33

Tolkning av resultat Normalisering På Rotor-Gene Q-instrument måste rådata för kanalen FAM/Cy5 först normaliseras för att kompensera för interaktionen mellan de olika kanalerna. För normalisering av Cy5-signalerna öppnar du råkanalen Melt FAM/Cy5 (filterinställningar 470 660 nm). Klicka på knappen Option (Alternativ) och välj Normalise to Melt FAM/ROX (Normalisera till Melt FAM/ROX). Den nyskapade rådatafilen Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX måste dessutom normaliseras för kanalen Red (filterinställningar 625/660 nm). Du gör detta genom att öppna den nya rådatafilen Melt FAM/Cy5/Melt FAM/ROX, klicka på knappen Option och välja Normalise to Melt Red (Normalisera till smältning röd). Med denna normalisering korrigeras den temperaturberoende fluorescensen för Cy5, vilket leder till en mer symmetrisk smälttopp. Analys För att analysera rådatafilen öppnar du fönstret Analysis (Analys) och väljer den lämpliga normaliserade rådatafilen för FAM/Cy5 under fliken Melt (Smältning). Signaler i kanalen Green (IC) (filterinställningar 470 510 nm) och kanalen FAM/ROX (filterinställningar 470 610 nm) behöver inte normaliseras; även motsvarande rådatafiler för kanalerna FAM/ROX och Green väljs. De olika smälttemperaturerna för SMART-proberna anges i tabell 14, sidan 35. Tröskel När förstärkningsoptimeringen i Rotor-Gene Q-programvaran i smältningsprogrammet för TwoStep-reaktionen används enligt beskrivningen i tabell 13 (sidan 22) och figur 17 (sidan 30), ska följande tröskelvärden ställas in i kurvorna för smältkurvsanalys för att analysera provresultat. Kanalen FAM/ROX : Tröskel = 1 Kanalen FAM/Cy5 (normaliserad): Tröskel = 0 Kanalen Green (IC): Välj Flip sign for df/dt (Vänd på tecken för df/dt), och välj alla prover som inte visade någon positiv smälttopp i kanalerna FAM/ROX och FAM/Cy5 med båda blandningarna. Ställ in tröskel manuellt vid den högsta fluorescensnivån vid 50 C som erhållits med dessa negativa prover. Prover som visar smältningstoppar med båda blandningarna inom acceptansintervallet på Tm för den interna kontrollen (70,5 73,5 C) kan nu kallas äkta negativa prover. Prover som endast 34 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

visar ett positivt internt kontrollresultat eller inget alls måste kallas ogiltiga. Ogiltiga prover måste upprepas. Tabell 14. Mål och motsvarande Tm-värden för SMART-prober Märkning SMART-prob Tm ( C) acceptansintervall Patogenkod (blandning 1) Patogenkod (blandning 2) Cy5 prob 1 50,5 53,5 L. pneu OC43 Cy5 prob 2 54,5 57,5 B. pert NL63 Cy5 Cy5 prob 3 60,0 63,0 Rhino/entero 229E Cy5 prob 4 66,0 69,0 C. pneu* HKU1 Cy5 prob 5 70,5 73,5 M. pneu Cy5 prob 6 76,5 79,5 H1N1 ROX prob 1 52,5 55,5 RSVA PIV1 ROX prob 2 57,5 60,5 Adeno PIV2 ROX ROX prob 3 62,5 65,5 hmpv PIV3 ROX prob 4 66,5 69,5 RSVB PIV4 ROX prob 5 72,5 75,5 InfA Boca ROX prob 6 76,5 79,5 InfB BHQ1 BHQ1 prob 1 70,5 73,5 IC IC * Obs! Detektionen av Chlamydophila pneumoniae med RespiFinder RG Panel är endast avsedd att användas i forskning. Den ska inte användas för diagnostik. Avsikten är inte att utfärda några garantier eller utfästelser avseende tillhandahållandet av information för diagnos, förebyggande eller behandling av en sjukdom. Felsökningshandbok Denna felsökningshandbok kan vara till hjälp för att lösa eventuella problem som uppstår. För ytterligare information, se även sidan Frequently Asked Questions (Vanliga frågor) på vårt tekniska supportcenter: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. Dessutom svarar teamet för QIAGEN:s tekniska service gärna på frågor om informationen och Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 35

protokollen i denna handbok eller prov- och analysmetoder (för kontaktinformation, se baksidan eller besök www.qiagen.com). 36 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Kommentarer och förslag Inga specifika smältningstoppar är synliga och IC-smältningstopp är ej synlig a) Programmeringsfel i termocyklingsprogram Programmera termocyklern enligt Protokoll: PCRamplifiering och smältanalys, sidan 17, och upprepa assayen. b) Pipetteringsfel eller reagens saknas c) IC inte tillsatt eller IC tillsatt innan lyseringsbuffert tillsatts till provet d) Det finns PCRinhibitorer i provet Upprepa RespiFinder-assayen enligt Protokoll: PCR-amplifiering och smältanalys, sidan 17. Det är viktigt att tillsätta IC och bärar-rna till lyseringsbufferten, helst efter det att den tillsatts till provet, oavsett vilket extraktionsprotokoll som används (se Använda en intern kontroll och bärar-rna, sidan 15). I annat fall kan IC brytas ned på grund av nukleaser i provet. Upprepa nukleinsyraextraktion och RespiFinder-assayen. Upprepa assayen med användning av en femfaldig spädning av isolerat RNA/DNA. Ingen IC-smältningstopp är synlig i närvaro av patogenspecifika smältningstoppar Kraftig infektion och/eller multi-infektion Falska smältningstoppar är synliga Korskontamination IC har utkonkurrerats i assayen. Resultatet är fortfarande giltigt. Se till att reaktionsstegen utförs i olika rum för att förhindra korskontamination. Upprepa RespiFinder-assayen. Kontrollera cyklingprogrammet och se till att alla hanteringssteg utförs enligt beskrivningen i Protokoll: PCR-amplifiering och smältanalys, sidan 17. Se till att du arbetar på is där detta anges i protokollet. Upprepa RespiFinder-assayen. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 37

Kommentarer och förslag Ökade bakgrundsfluorescenssignaler kan ses när ingen specifik amplifiering har skett i provreaktionen a) Inhiberande faktorer som finns i provets nukleinsyraextrakt obstruerar effektiv, specifik amplifiering Ökade bakgrundssignaler kan ligga över tröskelvärdena för RespiFinder RG Panel men är lätta att känna igen som icke-specifika smältningstoppar. Ett exempel på en ökad bakgrund visas i figur 22, sidan 39. b) Frånvaro av intern kontroll i negativa prover Ökade bakgrundssignaler kan ligga över tröskelvärdena för RespiFinder RG Panel men är lätta att känna igen som icke-specifika smältningstoppar. Upprepa RespiFinder-assayen. Ett exempel på en ökad bakgrund visas i figur 22, sidan 39. 38 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Kanalen FAM/ROX Blandning 1 Blandning 2 Äkta positiv Negativ kontroll Ingen IC Negativ kontroll Ingen IC Kanalen FAM/Cy5 Blandning 1 Blandning 2 Ingen IC Negativ kontroll Äkta positiv Negativ kontroll Ingen IC Kanalen Green (IC) Blandning 1 Blandning 2 Negativ kontroll Ingen IC Ingen IC Negativ kontroll Figur 22. Exempel på ökad bakgrund. Negativ kontroll: Linjer motsvarar den negativa kontrollen som inte visar några signaler varken i kanal FAM/ROX eller FAM/Cy5 men en specifik intern kontroll-topp i kanal Green (IC). Äkta positiv: De indikerade linjerna för FAM/ROX-blandning 1 och FAM/Cy5-blandning 2 motsvarar prover som visar äkta positiva smälttoppar. Ingen IC: Linjer som motsvarar ett prov utan tillsats av intern kontroll. För detta prov skedde ingen specifik amplifiering, vilket ledde till en ökad bakgrundsfluorescens i kanalen FAM/ROX, vilken inte visar några tydliga smälttoppar men fluorescensnivåer ovanför tröskelvärdet. Kvalitetskontroll RespiFinder RG Panel tillverkas av PathoFinder BV i Maastricht, Nederländerna, inom kvalitetssystem som är ackrediterade enligt ISO13485:2003 och EN ISO 13485:2012. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 39

Begränsningar RespiFinder RG Panel underlättar diagnostiseringen av luftvägsinfektion när den används tillsammans med andra kliniska fynd och laboratoriefynd. Negativa resultat indikerar inte nödvändigtvis frånvaro av viral eller bakteriell luftvägsinfektion. Negativa resultat ska inte användas som den enda grunden för beslut om diagnos, terapi eller övrig behandling. Positiva resultat utesluter inte samtidig infektion med andra patogener. Den eller de detekterade patogenerna behöver inte vara den definitiva sjukdomsorsaken. Andra laboratorietester och bedömningar av den kliniska presentationen måste inkluderas i den slutliga diagnosen. Prestandaegenskaper fastställdes med validerade EQA-paneler från QCMD. Produkten ska endast användas av utbildad laboratoriepersonal. Detektionen av Chlamydophila pneumoniae med RespiFinder RG Panel är endast avsedd att användas i forskning. Den ska inte användas för diagnostik. Avsikten är inte att utfärda några garantier eller utfästelser avseende tillhandahållandet av information för diagnos, förebyggande eller behandling av en sjukdom. Prestandaegenskaper Se www.qiagen.com/p/respifinder-rg-panel-ce för prestandaegenskaper för RespiFinder RG Panel. Litteraturhänvisningar QIAGEN upprätthåller en stor och uppdaterad databas online med vetenskapliga publiceringar där QIAGEN-produkter används. Omfattande sökalternativ gör att du kan hitta de artiklar du behöver, antingen genom en enkel nyckelordssökning eller genom att specificera tillämpning, forskningsområde, titel osv. Om du vill ha en fullständig referenslista kan du besöka QIAGENS referensdatabas online på www.qiagen.com/refdb/search.asp eller kontakta QIAGENS tekniska support eller din lokala distributör. Symboler Följande symboler kan finnas på förpackningar och i märkningen: <N> Innehåller reagenser som räcker för <N> reaktioner 40 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Använd före Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialnummer GS1-artikelnummer (Global Trade Item Number) Temperaturbegränsningar Tillverkare Konsultera bruksanvisningen Försiktighet Kontaktinformation För teknisk hjälp och ytterligare information, besök vårt center för teknisk support på www.qiagen.com/support, ring 00800-22-44-6000 eller ring en av QIAGENS avdelningar för teknisk support eller lokala distributörer (se baksidan eller besök www.qiagen.com). Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 41

Beställningsinformation Produkt Innehåll Kat.nr RespiFinder RG Panel (25) CE För 25 reaktioner: Masterblandning för pre-amplifiering, intern kontroll, primerblandning för pre-amplifiering, probblandningar, ligasenzym, Taqpolymeras och buffertar 4692163 QIAamp MinElute Virus Spin Kit för samtidig rening av viralt DNA och RNA från nasofaryngeala pinnprover för användning med RespiFinder RG Panel QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50) För 50 miniberedningar: 50 QIAamp MinElute-kolonner, QIAGEN-proteas, bärar-rna, buffertar, provrör (2 ml) Rotor-Gene Q MDx för IVD-validerad PCR-analys i realtid i kliniska applikationer Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Termocykler för realtids-pcr och analysator med högupplösningssmältning med 5 kanaler (grön, gul, orange, röd, karmosinröd) plus HRM-kanal, laptopdator, programvara, tillbehör: inkluderar 1 års garanti på reservdelar och utförande, installation och utbildning ingår inte 57704 9002032 Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Termocykler för realtids-pcr och analysator med högupplösningssmältning och 5 kanaler (grön, gul, orange, röd och karmosinröd) plus HRM-kanal, laptopdator, program, tillbehör: inkluderar 1 års garanti på reservdelar och utförande, installation och utbildning 9002033 42 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

Produkt Innehåll Kat.nr Rotor-Gene Q för enastående prestanda vid realtids-pcr Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Rotor-Gene Q-tillbehör Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) Termocykler för realtids-pcr och analysator med högupplösningssmältning med 5 kanaler (grön, gul, orange, röd, karmosinröd) plus HRM-kanal, laptopdator, programvara, tillbehör: inkluderar 1 års garanti på reservdelar och utförande, installation och utbildning ingår inte Termocykler för realtids-pcr och analysator med högupplösningssmältning och 5 kanaler (grön, gul, orange, röd och karmosinröd) plus HRM-kanal, laptopdator, program, tillbehör: inkluderar 1 års garanti på reservdelar och utförande, installation och utbildning 250 strips med 4 rör och lock för 1 000 reaktioner, 10 50 µl 10 x 250 strips med 4 rör och lock för 10 000 reaktioner, 10 50 µl 9001580 9001650 981103 981106 Uppdaterad licensinformation och produktspecifika friskrivningsklausuler: se respektive QIAGEN-kithandbok eller användarhandbok. QIAGENkithandböcker och användarhandböcker finns att tillgå på www.qiagen.com eller kan beställas från QIAGEN teknisk support eller från lokal återförsäljare. Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015 43

Denna sida har med avsikt lämnats tom

Varumärken: QIAGEN, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene (QIAGEN Group); BHQ (Biosearch Technologies, Inc.); Cy (GE Healthcare); FAM, GeneAmp, ROX (Life Technologies Corporation); RespiFinder (PathoFinder BV). Begränsat licensavtal för RespiFinder RG Panel Användning av denna produkt innebär att köparen eller användaren av produkten godkänner följande villkor: 1. Produkten får enbart användas i enlighet med protokollen som medföljer produkten och denna handbok och får enbart användas tillsammans med komponenter som ingår i panelen. QIAGEN beviljar ingen licens under någon av företagets immateriella tillgångar för användning eller inkorporering av de medföljande komponenterna i denna panel med/i komponenter som inte ingår i denna panel, förutom vad som beskrivs i protokollen som medföljer denna produkt, denna handbok och ytterligare protokoll som finns på www.qiagen.com. Vissa av dessa ytterligare protokoll har tillhandahållits av QIAGEN-användare för QIAGEN-användare. Dessa protokoll är inte noggrant testade eller optimerade av QIAGEN. QIAGEN lämnar ingen garanti för dem och garanterar heller inte att de inte utgör ett intrång på rättigheter för tredje part. 2. Förutom de uttryckligen angivna licenserna kan QIAGEN inte garantera att denna panel och/eller dess användning inte kränker rättigheterna för tredje part. 3. Denna panel och dess komponenter har licensierats för engångsbruk och får inte återanvändas, renoveras eller säljas på nytt. 4. QIAGEN frånsäger sig specifikt alla andra licenser, uttryckliga eller underförstådda, bortsett från dem som uttryckligen angivits. 5. Köparen och användaren av denna panel samtycker till att inte vidta eller tillåta att någon annan vidtar några steg som kan leda till eller underlätta några åtgärder som är förbjudna enligt ovan. QIAGEN kan kräva upphävande av detta begränsade licensavtal i domstol och ska ersättas för alla undersöknings- och rättegångskostnader, inklusive advokatkostnader, vid eventuellt försök att upprätthålla detta begränsade licensavtal eller någon av företagets immateriella rättigheter avseende panelen och/eller någon av dess komponenter. För uppdaterade licensvillkor, se www.qiagen.com. Meddelande till köparen Denna produkt är en RespiFinder-produkt som tillverkas av PathoFinder BV i Maastricht, Nederländerna, inom kvalitetssystem som är ackrediterade enligt ISO13485:2003. Dessa produkter säljs för användning av endast slutanvändaren och får inte återförsäljas, distribueras eller omförpackas. 2015 QIAGEN, med ensamrätt. 46 Handbok till RespiFinder RG Panel 03/2015

www.qiagen.com Australia techservice-au@qiagen.com Austria techservice-at@qiagen.com Belgium techservice-bnl@qiagen.com Brazil suportetecnico.brasil@qiagen.com Canada techservice-ca@qiagen.com China techservice-cn@qiagen.com Denmark techservice-nordic@qiagen.com Finland techservice-nordic@qiagen.com France techservice-fr@qiagen.com Germany techservice-de@qiagen.com Hong Kong techservice-hk@qiagen.com India techservice-india@qiagen.com Ireland techservice-uk@qiagen.com Italy techservice-it@qiagen.com Japan techservice-jp@qiagen.com Korea (South) techservice-kr@qiagen.com Luxembourg techservice-bnl@qiagen.com Mexico techservice-mx@qiagen.com The Netherlands techservice-bnl@qiagen.com Norway techservice-nordic@qiagen.com Singapore techservice-sg@qiagen.com Sweden techservice-nordic@qiagen.com Switzerland techservice-ch@qiagen.com UK techservice-uk@qiagen.com 1075775SV 151018271 Sample & Assay Technologies