2008-01-18/LGM Amplifiering och analys av humant mitokondrie-dna med hjälp av PCR teknik och agarosgelelektrofores
Syfte: Med två olika DNA extraktionsmetoder försöka få fram tillräckligt mycket celler från kindens insida för att kunna amplifiera mitokondrie DNA med hjälp av PCR teknik och analys med agarosgelelektrofores. Er uppgift blir att arbeta fram en metod för detta mha er labhandledare. Inför planeringen: Lägg upp en tidsplan för arbetet Vem gör vad i gruppen? Vilka kontrollförsök ska vara med i de olika stegen? Vilka lösningar behövs Under arbetets gång, glöm inte att föra noggranna anteckningar vad ni gör att använda vid redovisning och rapportskrivande. Metod 1: DNA Preparation DNA preparation med skrap från kindens insida med borste 1) Tillsätt 600 l 50 mm NaOH till ett skruvlocksrör 2) Tag fram en borste och håll den enbart i skaftet för att undvika kontaminering 3) Borsta och skrapa kindens insida i 30 sekunder, Ta i men inte för hårt så det börjar blöda!! 4) Sätt ner borsten i skruvlocksröret och klipp av borsten så att de får plats i röret, vortexa röret ett par sekunder 5) Sätt röret i ett inkubationsblock, 95 C i 10 min 6) Vortexa ytterligare ett par sekunder 7) Ta försiktigt upp borsten med en pincett och kasta den 8) Neutralisera lösningen genom att tillsätta 50 l 1M Tris-HCl, ph 8.0. Blanda lösningen genom att vända röret ett par gånger.
Metod II: DNA preparation sköljning med isoton sportdryck 1) Skölj munnen under ca 1-1,5 minut med 3-5 ml isoton sportdryck. Skrapa försiktigt loss celler från munnens insida med hjälp av tänderna medan du sköljer. 2) Spotta ut drycken med saliv och munceller i en engångsmugg 3) Mät upp 1 ml av drycken med hjälp av en automatpipett och för över detta till ett epp.rör. Var noga med att du får med celler från muggens botten och undvik att få med skum från saliven. 4) Centrifugera lösningen 5 minuter 13000 rpm i en bordscentrifug. 5) Häll bort supernatanten, gör detta med en snärt. Finns det någon pellet? om inte, har du förmodligen fått för lite celler, upprepa då moment 3 och 4 för att få mera celler 6) Låt röret stå upp och nedvänt på en Kleenex för att rinna av. 7) Tillsätt 0.5 ml Chelex (eller motsvarande) blandning för att adsorbera föroreningar som kan störa PCR reaktionen. Blanda med vortex. 8) Sätt röret i ett kokande vattenbad i 10 minuter för att lysera cellerna 9) Tag upp röret och centrifugera under 1minut 13000 rpm. Chelex kulor (eller motsvarande), celldelar hamnar på botten medan mitokondrie-dna:t blir kvar i supernatanten. 10) För över l av supernatanten i ett rent epp. rör för att användas för nästa steg dvs amplifiering. Om provet inte ska användas direkt så kan det frysas i detta steg.
Frågeställningar/funderingar: PCR amplifiering Utgående från primersekvensen, ge förslag på lämplig PCR cykel Vad händer om annealingtemperaturen är för hög respektive för låg? Hur beräknas smältpunkten för primers? Vad bör man tänka på vid design av primers? Vilka kontroller är lämpliga att ha med? Tillsätt nedanstående i ett PCR rör till totalvolymen 20 l. Gör upp inom labskiftet olika försöksserier. Sterilt H 2 O X l Primer_forward 1-5 l Primer_reverse 1-5 l 2mM dntp 2 l 10 X PCR buffert 2 l Taq Polymerase 1 l DNA 1-5 l 20 l
Agarosgelelektrofores Frågeställningar/funderingar: Vilka kontroller bör vara med vid elektroforesen Vad händer om du har för låg respektive för hög spänning vid elektroforesen? Vilken koncentration på agarosgelen ska du använda? När är elektroforesen klar? Hur ska du detektera DNA:t? Gjutning av agarosgel 1. I en 250 ml flaska väg upp 0.5-2.0 g agaros, tillsätt 10 ml 10 XTBE buffert och späd till totalvolymen 100 ml. 2. Värm agarosgelen i en mikrovågsugn tills den är helt flytande. Låt blandningen svalna en stund och gjut sedan agarosgelen. Låt gelen svalna minst 30 minuter. Elektroforetisk separation av DNA 1. Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1 x TBE buffert så att det täcker gelen. 2. Blanda 4 l laddningsbuffert med DNA och H 2 O till totalvolymen 20 l, glöm inte kontroll! 3. Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett 4. Separera DNA fragmenten genom att lägga på en spänning på ~100 volt. Kom ihåg att DNA är negativt laddat 5. Färga in gelen med Etidiumbromid i ~15 minuter 6. Fotografera av gelen och analysera resultatet
Referenser Appendix Primer_forward 5 -TTAACTCCACCATTAGCACC-3 Primer reverse 5 -GAGGATGGTGGTCAAGGGAC-3