Flödescytometri Hematologi med mikroskop Bürkerkammare eller blodutstryk, Diff Cellens storlek Kärnans storlek Cytoplasmans färg Eventuella granula, antal och storlek Räknar ofta 100-200 celler Begränsat till vad man ser 1
Automatiserad hematologi t.ex. FACS eller Sysmex Storlek Eventuella granula Ytstrukturer (märkta med fluorescens) Räknar typiskt 5.000 300.000 celler på några få minuter 2
Uppbyggnad, FACScan DATAANALYS D Side scatter Ut i slask Laser D Forward scatter Bärarvätska Celler sugs in Hydrodynamisk fokusering 3
Ljusspridning Forward scatter (FSC) Ljusspridning Side scatter (SSC): 4
SSC (Granula) FSC (Cellstorlek) SSC Granulocyter Mycket granula Granulering Side scatter Monocyter Lymfocyter Lite granula Liten cell Celldiameter (storlek) Forward scatter Stor cell FSC 5
Mycket granula Granulocyt Granulering Side scatter Monocyt Lite granula Lymfocyt Liten cell Celldiameter (storlek) Forward scatter Stor cell Flödescytometri 3-partsdiff granulocyter lymfocyter monocyter 6
Storlek, forward scatter Granulering, side scatter Fluorescensinmärkning Uppbyggnad, FACScan DATAANALYS Orange fluorescens Röd fluorescens Grön fluorescens D D D D Side scatter Ut i slask Laser D Forward scatter Bärarvätska Celler sugs in 7
Fluorescensmärkta antikroppar DIREKT INDIREKT Fluorescensmarkörer Cellyteproteiner Antikroppar märkta med fluorescens CD markörer Intracellulära proteiner Antikroppar märkta med fluorescens DNA / RNA Fluorescerande kemikalier Intracellulära processer 8
CD-markörer CD = cluster of differentiation Antigen som uttrycks på cellens yta Celltyp CD-markör Leukocyt CD 45 Monocyter CD 14 T- lymfocyter CD 3 B- lymfocyter CD 19 T- helper celler CD 4 T- cytotox celler CD 8 9
CD-markörer Fluorescens Antikroppar med fluorokrom 10
Olika fluorokromer FITC, fluorescein-iso-thio-cyanat (grön) PE, phyco-erytrin (orange) PerCp (röd) Alla dessa kan exciteras vid 488nm Emmission: FITC: 530 nm, PE: 575 nm, PerCp: 670 nm 11
Mycket fluorescens PE Lite fluorescens Lite fluorescens FITC Mycket fluorescens Vadkanmanmäta? 2-6 parametrar på varje cell eller partikel Ljusspridning Liten vinkel, FSC (forward scatter) Stor vinkel, SSC (side scatter) Fluorescens Grön (FITC) Orange (PE) Röd (PerCp) (Blå) 12
Optik och elektronik Förutsättningar Kvalitetskontroll att instrumentet har tillräcklig känslighet att reagensen är reproducerbara att provbehandling kan upprepas att analysen är reproducerbar 13
Dyr utrustning och dyra reagens Begränsningar Kräver tränad personal Väldigt känsligt system Fluorescensen bleks av lasern-man kan inte köra samma prov flera gånger Provbehandling Provtagningsrör - antikoagulantia, ex: lymfocyter EDTA, stamceller - ACD lösning förvaringstid varierar - analys inom 30h Karlstad - analys inom 6h, ofta snabbare än så Temperatur: perifert blod 18-22 C 14
Laboration FACS/Mikroskop 3 och 3 labbar ihop 2 blodprov, 1 normal, 1 onormal 3 metoder: Bürker, Diff, FACS Jämföra resultaten och metoderna Cellytemarkörer, CD Allmän leukocytmarkör CD45 Monocytmarkör CD14 Lymfocytsubpopulationer CD3 T-lymfocyter CD4 CD8 CD19 B-lymfocyter Delar upp lymfocyter i T och B celler Delar upp T cellerna i hjälparoch cytotox celler 15
Dataanalys I, ljusspridning Granulering, Side scatter granulocyter monocyter lymfocyter Celldiameter (storlek) Forward scatter Fortsatt undersökning av lymfocyter SSC/ granulering Ni gatar lymfocyterna granulocyter monocyter lymfocyter FSC/ Celldiameter (storlek) 16
Dataanalys II, fluorescenssignal Mycket Fluorescens ( + ) -, + +,+ Orange Fluorescens PE -, - Lite Fluorescens ( - ) Lite fluorescens ( - ) +, - Grön fluorescens FITC Mycket fluorescens ( + ) Dataanalys II, fluorescenssignal Mycket Fluorescens ( + ) Orange Fluorescens PE Lite Fluorescens ( - ) Lite fluorescens ( - ) Grön fluorescens FITC Mycket fluorescens ( + ) 17
Kontroll Mycket fluorescens Orange fluorescens PE Markering som skapar 4-fält < 2% celler i övre, yttre rutan Lite fluorescens Lite fluorescens Grön fluorescens FITC Mycket fluorescens Identifiera lymfocyter, CD 45 / CD 14 Orange Fluorescens PE Monocyter CD 14 Markering kopieras från kontrollröret Grön fluorescens FITC Lymfocyter CD 45 18
Lymfocyter indelning i B- och T-celler Orange fluorescens PE B-celler CD19 Markering kopieras från kontrollröret Grön fluorescens FITC T-celler CD3 T- lymfocyter indelning i hjälpar- och cytotox-celler Orange fluorescens PE CD4 Markering kopieras från kontrollröret Grön fluorescens FITC CD8 19
Analys Använder programmet CellQuest (gate- statistics) Läser ut %-andelen lymfocyter i provet, %-andelen B-och T-lymfocyter, %-andelen T-helper och T- cytotox Bedömning Jämför metoderna: Bürker, Diff, FACS, Sysmex Stämmer resultaten överens? Fördelar, nackdelar med respektiva metoder. Felkällor? Examination: Labrapport 20