Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3 Laborationsdatum: 17 22 november 2010 Grupp: 2 Projekt: Rening och karakterisering av Karboanhydras Labbhandledare: Ulla Andersson och Märit Karls
Innehållsförteckning 1 Introduktion... 3 2 Material och Metod... 3 2.1 Separation och hemolys av erytrocyter...3 2.2 Affinitetskromatografi...3 2.3 Mätning av enzymaktiviteten...3 2.4 Proteinbestämning...4 2.5 SDS Polyakrylamidelektrofores(SDS PAGE)...4 3 Resultat... 4 4 Diskussion... 5 5 Litteraturförteckning... 6 6 Bilagor... 7 6.1 Bilaga I Diagram från Affinitetskromatografi...7 6.2 Bilaga II Primärdata från aktivitetsbestämningen, mätning av enzymaktiviteten...8 6.3 Bilaga III Primärdata från proteinbestämningen...9 6.4 Bilaga IV Standardkurva för proteinbestämning av CA...9 6.5 Bilaga V Standardkurva för molmassabestämning av CA... 10 7 Instuderingsfrågor... 10
1 Introduktion Syftet med laborationen är att rena karboanhydras (CA) från erytrocyer som innehåller stora mängder av enzymet. Enzymet katalyserar reaktionen där koldioxid och vatten omvandlas till bikarbonat. Karboanhydras är ett mycket effektivt enzym som ökar reaktionshastighet med en faktor 10 6. För reningen använder vi oss av koblod. Reningen utförs mha affinitetskromatografi. Reningen följs upp genom aktivitetsbestämning, proteinbestämning samt kontroll av renhet och bestämning av molmassan mha SDS polyakryamidelektrofores (PAGE). 2 Material och Metod För en mer detaljerad beskrivning av metoden se laborationskompendiet Projekt: Rening och karakterisering av Karboanhydras 2010 (1). 2.1 Separation och hemolys av erytrocyter Erytrocyterna separeras från plasman genom centrifugering. Supernatanten innehåller plasman med de olika plasmaproteinerna och övriga blodceller. Pelleten innehåller erytrocyterna. Pelleten tvättas två gånger med NaCl för att få bort rester av plasman. Genom att tillsätta iskallt vatten lyserar man cellerna och får ut CA. Detta gör att koncentrationen av salt blir större i erytrocyterna än utanför. Detta vill utjämnas och gös genom att vatten diffunderar in i cellen. Cellera blir större och större och då de är riktigt stora spricker cellväggen. Hela mängden hemolysat ( 50 ml) späds med buffert till 250 ml. Av det tas ett prov, Provpåsättning (prov 1). (1, sid 6 7) 2.2 Affinitetskromatografi Metoden används för att rena karboanhydras från erytrocyterna innehållande en mängd andra proteiner, till största delen hemoglobin. Man använder sig av en ligand, i detta fall sulfanilamid som är bunden till gelkornen. Karboanhydras kommer att binda till sulfanilamid, som är en icke kompentitiv hämmar till CA och bilda ett Enzym Ligand komplex medan alla andra proteiner kommer passera ut ur kolonnen. Av vätskan med proteinerna som runnit rakt igenom tas ett prov, Rakt igenom (prov 2). För att få ut enzymet ut måste den elueras vilket det görs genom att man använder sig av en annan icke kompetitiv, Clˉ vilket binder till samma ställe som sulfanilamid. Denna lingand är fri vilket gör att då CA binder till Clˉ och bildar EI komplex stället för med sulfanilamid kommer CA komma ut ur kolonnen. Vi använde oss av ett flöde på 20mL/h och en fraktionstid på 10 minuter under elueringen. (1, sid 7 9) 2.3 Mätning av enzymaktiviteten Karboanhydras enzymaktivitet mäts med para nitrofenylacetat (pnpa) som substrat, vilket ger en gul färgad produkt, para nitrofenoxidjon som absorbansmaximum vid 400 nm. Man kan därför följa bildning av produkten genom att mäta absorbansökningen vid denna våglängd. Först mäter man spontanaktiviteten, aktiviteten utan enzymet CA. Därefter mäter man totalaktiviteten, aktiviteten med enzym. Till sist mäter man aktiviteten med en hämmare till CA. Totala aktiviteten minus aktiviteten mätt med hämmare ger den totala aktiviteten av CA.
Aktiviteten mäts på prov 1, prov 2, fraktionsrören innehållande proteiner samt affinitetspoolen (fraktionerna med högst innehållande enzymaktivitet, dvs innehållande mest enzym). (se bilaga II) Vid varje mätning använder man 2,82 ml buffert och 40 μl prov. Från affinitetspoolen tas prov 3, Affinitetspool. Dessutom tas ett fjärde prov på fraktionen med allra högst enzymaktivitet Toppfraktion. (1, sid 9 13) 2.4 Proteinbestämning Proteinbestämningen görs enligt Lowry på samtliga av proverna. Detta görs genom att mäta absorbansen vid 750nm och sedan läsa av proteinmängden i standardkurva (bilaga IV). Standardkurvan görs genom att mäta absorbansen på en standard, Bovin serum albumin (BAS) med olika proteinmängder (bilaga III). Absorbansen sätts sedan in på y axeln och koncentrationen på x axeln. Mellan punkterna dras en rät linje. (1, sid 13 15) 2.5 SDS Polyakrylamidelektrofores(SDS PAGE) Är en typ av elektrofores metod som används bl a för att se om man har fått den önskade reningen, se förändringen efter varje reningssteg och bestämma minsta molmassan för proteiner. En separationsgel och en koncentrationsgel gjuts. Koncentrationsgelen är till för att samla ihop proteinerna till ett band innan de separeras i separationsgelen. Proteinerna separeras efter storlek. Gelen färgas in med SimplyBlue SafeStain för att kunna se banden och gelen kopieras. Molmassan bestäms på det proteinband i provpåsättningen, som innehåller mest protein (tjockaste bandet). Detta görs genom att rita upp en standarkurva med logaritmen för molmassan på standardproteinerna på y axeln och Rf värdena på x axeln som är markörproteinets vandringsväg delat på frontens vandringsväg. (se bilaga V) (1, sid 16 20) 3 Resultat Resultatet aktivitetsbestämning, proteinbestämning samt kontrollen av renheten av CA kan ses i tabell I nedan. Renhetsfaktorn är ett mått på renheten, ju högre värde desto renare protein. Om renhetsfaktorn är hög har man lyckats bra med reningen men man vill inte bara ha rent enzym utan man vill även ha mycket enzym så därför räknar man ut utbytet. Det totala utbytet (toppfraktion + pool) = 35,6 %. Tabell I Reningsschema Renigssteg nr Volym (ml) Aktivitet (μmol/min ml) Totalaktivitet (μmol/min) Protein (mg/ml) Totalmängd protein (mg) Specifik aktivitet (μmol/min mg) Reningsfaktor Utbyte % 1 210 0,555 116,55 26,5 5565 0,021 1 100 2 210 0,255 53,55 28,4 5964 0,009 0,75 45,9 3 29 1,335 38,715 0,153 4,437 8,725 415,5 33,2
4 1 2,76 2,76 0,295 0,295 9,356 445,5 2,4 1: Provpåsättning, 2: Rakt igenom, 3: Affinitespool och 4: Toppfraktion. Resultatet på SDS PAGE kan man se i figur 1.. Trots att bilden inte är vår v egna gel (färgnigen misslyckades) så borde den har ungefär samma utseendee som bilden. Figur 1. Bild på SDS gelen innehållande fr v Prov 1: Provpåsättning, markör, m Prov 2: Rakt igenom, Prov 3: Affinitespool, markör och Prov 4: Toppfraktion med två olika provmängdep er.(bilden är inte vår egna gel). Genom avläsning i standardkurvan för bestämning av molmassan (bilaga V) fick k vi fram en molmassa på 12 534 Da för hemoglobin och 31 586 Da för karboanhydras.. 4 Diskussion För prov 1 fick vi en totalaktivitett på 116,55 μmol/min och för prov 2 fick vi 53,6 μmol/min. Detta beror på att i prov 1 hade vi alla plasmans proteiner med karbananhydras därför fick vi högre aktivitet än i prov 2. I prov 2 fanns alla proteiner utom karbananhydras som har bundit till sulfanilamid på gelen och därför fick vi mindre aktivitet i det provet. Men vi kan inte säga om allt karbananhydras har bundit till gelen. Detta för att vi fick fyra lite olika värden vidd mätningarna av aktiviteten i prov 2. Detta kanske beror på att vi mätte aktiviteten en gång först på prov 1 och prov 2 och sedan mätte aktiviteten på dubbelproven en timme t senare. Detta kanske påverkar enzymaktivitet eller så beror det på att vi vid de första mätningarna använde ett substrat i plaströr och vid mätningarna av dubbelprov använde vi substrat förvarat f i ettt glasrör. En annan förklaring kanske kan vara attt vi råkade blanda om proven, vid första mätningen var de färska men vid andra mätningen hade de stått en stund utan omblandning. Resultatet på det totala utbytet som s vi fick till 35,6 % är väl inte sådär jättebra. Mera av CA gick rakt igenom kolonnen än fastnade i gelen och kom sedan ut vid elueringen då det varr 46% som gick rakt igenom. Detta kan bero på att vi satta till mera av hemolysatet till provpåsättningen än vad man egentligen skulle för att få ett större utslag på aktiviteten. Eftersom vi v hade en större mängd CA kan
det vara så att gelen inte räckte till för att binda allt CA och överflödet av CA gick rakt igenom kolonnen. Utbytet på Rakt igenom, Affinitespool och Toppfraktion tillsammans blir inte 100% (blir 81,5%) vilket man kan tycka att det borde bli. Detta beror förmodligen på att vi inte tog med alla fraktionerna som innehöll CA i poolen utan bara de fraktioner som innehöll mest (fraktion 3 13). Dessutom kan det vara så att en del CA satt kvar i gelen. Något jag tycker är lite konstigt är att totala mängden protein är större i prov 2, rakt igenom än i provpåsättningen. Proteinmängden kan inte bli större, den borde bli mindre eftersom CA fastna i gelen. Detta kan ev bero på felmätning av absorbansen, fel avläsning i standardkurvan eller feldragning av linjen i standardkurvan (kanske inte i vårt fall, linjen är ganska bra dragen), eller en kombination av alla. Det är även möjligt att vi kanske glömde blanda innan provet toga, men jag är inte så säker på det då vi försökte vara noga med att blada efter att vi glömde blanda om vid mätningen av Slope värdet. En annan förklaring skulle kunna vara att vi förväxlat prov 1 och 2. De mest troliga kanske ändå är de två senare förklaringarna. Om man tittar på renhetsfaktorn ska den vara hög för prov med mycket Ca och lita annat protein, hög renhet. Den är lägst i prov 2 vilket den borde och högst i prov 4 som innehåller mest CA borde vara renast. Renhetsfaktorn i prov 3 och 4 är högre än i prov 1, från början vilket är bra för då har vi fått bort andra proteiner som fanns i provet från början. Man kan inte bara titta på renhetsfaktorn utan man måste även titta på utbytet eftersom man inte bara vill har rent prov utan man vill även ha mycket. Vad gäller molmassan för hemoglobin (Hb) fick vi ju ett värde på 12 534 Da medan litteraturvärdet på molmassan för Hb ligger på ungefär 66 000 Da. (2) Det kan man tycka är en stor skillnad men detta beror på att Hb består av fyra lika stora subenheter på vardera ungefär 16 500 Da. Det vi får fram är alltså molmassan för en av subenheterna eftersom vi har denaturerat proteinerna och därför fått fyra polypeptidkedjorna var för sig. Möjligtvis kanske laborationen kunde ha gått bättre men det var första gången vi gjorde många av momenten och man lär ju sig av sina misstag (får man hoppas). 5 Litteraturförteckning 1. Laborationskompendiet Projekt: Rening och karakterisering av Karboanhydras 2010 i kursen Analytisk Kemi och Biokemisk metodik. 2. http://www.ne.se/lang/hemoglobin 2010 11 23
6 Bilagor 6.1 Bilaga I Diagram från Affinitetskromatografi a) Kromatogram från provpåsättningen b) Kromatogram från elueringen
6.2 Bilaga II Primärdata från aktivitetsbestämningen, mätning av enzymaktiviteten Prov Prov 1 Prov 1 Prov 2 Prov 2 Prov 2 Prov 2 Prov 2 Rör 2 Rör 3 Rör 4 Rör 5 Rör 6 Rör 7 Rör 8 Rör 9 Rör 10 Rör 11 a 0,046 0,049 0,05 0,045 0,05 0,045 0,045 0,043 0,048 0,038 0,043 0,041 0,040 0,040 0,041 0,041 0,041 Slope värde (ΔA/min) b c 0,116 0,078 0,121 0,085 0,110 0,110 0,098 0,074 0,101 0,090 0,106 0,085 0,100 0,088 0,042 0,040 0,100 0,038 0,161 0,035 0,220 0,038 0,221 0,037 0,165 0,036 0,127 0,036 0,134 0,038 0,106 0,037 0,087 0,039 b c 0,038 0,036 0,000 0,024 0,011 0,021 0,012 0,002 0,062 0,126 0,182 0,184 0,129 0,091 0,096 0,069 0,048
Rör 12 Rör 13 Rör 14 Rör 15 Pool Pool 0,040 0,039 0,041 0,042 0,042 0,039 0,074 0,066 0,060 0,061 0,143 0,111 0,036 0,039 0,039 0,037 0,038 0,038 0,038 0,027 0,021 0,024 0,105 0,073 a = spontanaktiviteten, b = enzymaktiviteten + spontanaktiviteten, c =annan enzymaktivitet än CA + spontanaktivitet, b C = totala CA aktiviteten.. Pool är sammanslagning av rör 3 13. 6.3 Bilaga III Primärdata från proteinbestä ämningen Prov Absorbans Proteinmängd (μg) Standardd 1 Standardd 2 Standardd 3 Standardd 4 Standardd 5 Standardd 6 Standardd 7 Standardd 8 Prov 1 a Prov 1 b Prov 2 a Prov 2 b Prov 3 a Prov 3 b Prov 4 a Prov 4 b Blank 0,042 0,065 0,086 0,171 0,247 0,313 0,374 0,110 0,206 0,119 0,214 0,036 0,072 0,064 0,118 0 10 15 20 40 60 80 100 26,5 53 29,5 54,5 7 16,5 15 29 a och b är dubbelprov med olika mängd provvolymer. 6.4 Bilaga IV Standardkurva för proteinbestämning av CA
6.5 Bilaga V Standardkurva för molmassabestämning av CA Standardkurva Molmassabestämning Log Molmassa y = 1,2949x + 5,0576 R² = 0,981 Rf Primärdata till standardkurvan Rf Log Molmassa 0,103 4,989 0,172 4,821 0,276 4,653 0,414 4,491 0,552 4,332 0,724 4,158