Genetisk diagnostik och monitorering av KML en översikt

Genetisk diagnostik och monitorering av KML en översikt Introduktion Kronisk myeloisk leukemi (KML) är en klonal stamcellssjukdom som känneteck- nas av en hyperplasi av granulocytopoesen där samtliga mognadsstadier brukar förekomma. Ofta ses även hyperplasi av trombocytopoesen. KML karakteriseras vidare av en specifik cytogenetisk avvikelse: uppkomsten av en translokation t(9;22)(q34;q11) vilket leder till en s.k. Philadelphiakromosom. På molekylärgenetisk nivå innebär denna translokation att en fusionsgen, BCR- ABL1, skapas. ABL1 är ett tyrosinkinas, och fusionsproteinet BCR- ABL1 medför en abnorm aktivering av ABL1- signaleringsvägen, vilket i sin tur leder till ökad proliferation, inhibition av apoptos (programmerad celldöd) och ökad cell- migration. Insikten om den molekylärgenetiska bakgrunden till KML har medfört att man kunnat utveckla höggradigt effektiva terapier i form av tyrosinkinashämmare som specifikt inhiberar signalering från fusionsproteinet BCR- ABL1. Den första tyrosinkinashämmaren i kliniskt bruk var imatinib (Glivec ), och nu finns sedan en tid ytterligare två godkända preparat, dasatinib (Sprycel ) och nilotinib (Tasigna ). Nationella riktlinjer för diagnostik och behandling av kronisk mye- loisk leukemi finns utgivna av svenska KML- gruppen, och återfinns på adressen http://www.sfhem.se/kml/. Denna översikt avseende den genetiska diagnos- tiken och monitoreringen av KML är avsedd att utgöra ett komplement till de nationella riktlinjerna. Genetisk diagnostik av KML Diagnosen KML ställs genom morfologisk bedömning av blod- och benmärgs- utstryk, samt påvisande av BCR- ABL1- fusionen i celler från benmärg eller blod. Denna fusion kan påvisas med tre olika metoder, konventionell cytogenetik (karyotypering), fluorescent in- situ hybridisering (FISH) och reverse- transcriptase polymeraskedjereaktionen (RT- PCR). För en detaljerad diskussion kring respektive metods för- och nackdelar hänvisas till de nationella riktlin- jerna. Det bör poängteras att det finns en risk att en BCR- ABL1- fusion missas om man endast utnyttjar en cytogenetisk eller molekylärgenetisk metod det finns varianttranslokationer som inte detekteras med sedvanlig cytogenetik, och i säll- synta fall kan atypiska transkript föreligga som inte fångas via RT- PCR. Vid miss- tanke om KML bör därför BCR- ABL1- fusionen uteslutas med två oberoende tekniker. 1 (7)

Cytogenetisk monitorering av KML Uppföljning med sedvanlig cytogenetik på benmärgsprov var standardmetoden vid KML innan introduktionen av tyrosinkinashämmare, då det endast var en minoritet av patienterna som uppnådde s.k. komplett cytogenetisk respons (CCgR). CCgR definieras som att inga philadelphiakromosompositiva (Ph+) celler återfinns när man analyserar 20-30 celler i metafas. Efter introduktionen av imatinib har flertalet patienter fått ett djupare behandlingssvar vilket medfört ett behov av känsligare tekniker för monitorering (se nedan). Den konventionella cytogenetiken har dock en fortsatt plats inom uppföljningen vid KML, särskilt då detta är den enda teknik som kan identifiera ytterligare cytogenetiska avvikelser utöver Ph. Förekomst av sådana avvikelser vid diagnos har kopplats till en sämre prognos även under tyrosinkinashämmarbehandling (Marin et al, 2008). För närvarande rekommenderar svenska KML- gruppen att cytogenetiskt svar utvärderas vid diagnos samt efter tre och sex månaders behandling. Sedan var sjätte månad till dess CCgR har uppnåtts. Därefter årligen endast om molekylär monitorering inte kan utföras, samt vid terapisvikt och vid uppkomst av oför- klarad anemi, leukopeni eller trombocytopeni. Man kan notera att en patient med stabilt molekylärt svar motsvarande major molecular response (MMR, se nedan) således inte längre behöver följas med sedvanlig cytogenetik och därmed följande benmärgsprovtagning. Molekylärgenetisk monitorering av KML Även patienter med komplett cytogenetisk respons kan ha en betydande kvarva- rande leukemibörda (se figur 1), och i samband med utvecklingen av tyrosin- kinashämmare har behovet av känsligare metoder för monitorering av minimal restsjukdom (MRD) ökat. Den metod som idag rutinmässigt används är realtids kvantitativ RT- PCR (RQ- PCR eller qrt- PCR). RQ- PCR är i korthet en semi- kvantitativ metod för att mäta kvoten BCR- ABL1- transkript relaterat till en kontrollgen (ofta ABL1 eller GUS). Analysen utförs som regel på perifert blod, vilket minimerar behovet av benmärgsundersökningar för patienten. Svenska KML- gruppen rekommenderar för närvarande att patienter med KML följs med RQ- PCR var tredje månad tills MMR har uppnåtts (se nedan), och därefter endast var sjätte månad. Vid tendens till stigande nivå av BCR- ABL1 rekommenderas dock tätare kontroller. 2 (7)

Major Molecular Response (MMR) Som framgår av figuren ovan så motsvarar komplett cytogenetisk respons ungefär ett uppmätt RQ- PCR- värde på BCR- ABL1 om 1%. Den s.k. IRIS- studien (The International Randomized Study of Interferon and STI571) är registrerings- studien för imatinib, och utgör därför den studie som både är störst och har längst uppföljning när det gäller tyrosinkinashämmarbehandling vid KML. IRIS- studien har sökt utvärdera den kliniska betydelsen av djupare svar på behand- lingen, och fastställde därför en endpoint major molecular response (MMR), som definierades som en 3- log reduktion av BCR- ABL1 från en gemensam base- line i studien. I en nyligen publicerad analys av IRIS- studien beskriver förfat- tarna att patienter som uppnått MMR senast 18 månader efter behandlingsstart har 95% event- free survival och inga fall av progression till accelererad fas eller blastkris vid sju års uppföljning. Sannolikheten för förlust av CCgR var endast 3% för patienter som uppnått MMR, jämfört med 26% för patienter med CCgR men inte MMR (Hughes et al, 2010a). För att kunna jämföra kliniskt uppmätta RQ- PCR- kvoter med resultaten från IRIS- studien så har ett omfattande internationellt standardiseringsarbete utförts där laboratorier genom att konvertera sina uppmätta resultat till den så kallade internationella skalan (IS) kunnat definiera när MMR uppnåtts, vilket motsvarar ett värde BCR- ABL1 0,1% utryckt på IS. För en beskrivning av detta standardiseringsarbete inom Europa, se (Müller et al, 2009). 3 (7)

Punktmutationer i BCR- ABL1 kan medföra resistens mot tyrosinkinashämmare Specifika punktmutationer i BCR- ABL1 kan innebära en konformationsändring av fusionsproteinet, vilket i sin tur kan medföra resistens mot insatt behandling med tyrosinkinashämmare. Svenska KML- gruppen rekommenderar f.n. mutationsanalys vid en minst 5- faldig ökning (dvs 0,5 log) av BCR- ABL1- nivån som konfirmerats genom två separata RQ- PCR- analyser. Enligt en aktuell studie bör man dock eventuellt reservera mutationsdiagnostiken till tillfällen då patienten förlorar MMR, alternativt vid behandlingssvikt eller suboptimalt behandlingssvar enligt tabellen nedan (Soverini et al, 2011). Ett hundratal olika mutationer i BCR- ABL1 har hittills beskrivits. Tolkningen av den kliniska betydelsen av enskilda mutationer är därför ofta svår och bör ske i samråd mellan behandlande hematolog och genetisk expertis. Som en enkel tumregel så uppvisar identifierade mutationer vid stigande BCR- ABL1- nivå under pågående imatinib- behandling ofta åtminstone partiell resistens mot imatinib, varför byte till nilotinib eller dasatinib kan vara relevant. Endast ett fåtal punktmutationer har visats medföra resistens även för andragenerationens tyrosinkinashämmare. Således uppvisar mutationen T315I höggradig resistens mot samtliga tillgängliga tyrosinkinashämmare. Vid mutationerna Q252H, V299L, T315A och F317L/V/I/C förefaller nilotinib vara ett bättre val än dasatinib, och omvänt tycks dasatinib vara mer effektivt än nilotinib vid före- komst av mutationerna Y253F/H, E255K/V och F359V/C/I. Utvärdering av behandlingssvar i klinisk praxis Baserat på resultaten från IRIS- studien samt andra rapporter så har European LeukemiaNet publicerat rekommendationer avseende klinisk handläggning av KML (Baccarani et al, 2009). Utvärdering av behandlingssvar på imatinib sammanfattas i tabellen nedan, som även återfinns i de svenska KML- riktlinjerna. Som framgår av denna tabell så har såväl cytogenetik som molekylärgenetik en central plats vid den kliniska uppföljningen av KML. Vid diagnos 3 månader CHR och Ph+ <65% 6 månader Minst PCgR (Ph+ 35%) Optimalt Suboptimalt Behandlingssvikt Varning Inget CgR (Ph+ >95%) < PCgR (Ph+ >35%) 12 månader CCgR PCgR (Ph+ 1-35%) Mindre än CHR Inget CgR (Ph+ >95%) < PCgR (Ph+ >35%) 18 månader MMR < MMR < CCgR Vid alla tidpunkter Stabil MMR, sjunkande BCR- ABL1 Förlust av MMolR, mutationer (A) Förlust av CHR, förlust av CgR, mutationer (B), CCA/Ph+ CCA; klonala kromosomavvikelser i Ph+ (CCA/Ph+) eller Ph- (CCA/Ph- ) celler. Mutationer; A=kvarvarande känslighet för imatinib, B=okänsliga för imatinib. Sokal HR CCA/Ph+ < MMR Ökning av BCR- ABL1, CCA/Ph- 4 (7)

Framtida perspektiv djupare och snabbare svar? Trots att MMR har associerats med förbättrad PFS enligt vad som beskrivs ovan, så har molekylär respons tidigare inte kunnat valideras som en surrogatmarkör för totalöverlevnad. Nyligen publicerade dock den tyska KML- gruppen en studie som visade signifikant bättre överlevnad vid tre års uppföljning (99% vs 95%) för patienter som uppnått MMR vid 12 månaders behandling med imatinib jämfört med dem som inte uppnått detta mål (Hehlmann et al, 2011). Detta är viktigt inte minst då det kan användas som argument för att avstå från benmärgsundersökningar i större utsträckning än idag och i första hand förlita sig på RQ- PCR på perifert blod. Man bör dock notera att i denna studie var överlevnadsfördelen för patienter med MMR främst jämfört med patienter med BCR- ABL1 >1% IS (99% vs 93%), dvs även BCR- ABL1- värden mellan 0,1-1% IS hade den mer gynnsamma prognosen. CCgR motsvarar c:a 1% BCR- ABL1, och man kunde inte heller i den tyska studien visa en skillnad i totalöverlevnad för patienter som uppnådde MMR jämfört med dem som endast uppnådde CCgR. Resultaten från denna studie antyder sammantaget att BCR- ABL1 1% IS kan komma att etableras som ett viktigt terapeutiskt mål som på sikt kan ersätta CCgR. Det primära syftet med studien ovan var att utvärdera om högdos imatinib (800mg med tillåten dosreduktion vid biverkningar) var mer effektivt än standarddos imatinib 400 mg. Med denna design uppnådde man också signifi- kant högre andel MMR i högdosgruppen (59% v 44%). I en jämförelse mellan nilotinib och imatinib vid nydiagnosticerad KML i den sk ENESTnd- studien så visade 24- månadersuppföljningen en signifikant fördel för nilotinib (62% vs 37% av patienterna hade uppnått MMR). Detta kunde visas vara kopplat till en lägre risk för progression till accelererad fas och blastkris för patienterna som erhöll nilotinib, och också en tendens till färre KML- relaterade dödsfall (Saglio et al, 2010; Hughes et al, 2010b). I den motsvarande DASISION- studien för dasatinib jämfört med imatinib sågs vid 18 månaders uppföljning en fördel för dasatinib (57% vs 41% MMR). Med denna uppföljningstid kunde man dock inte visa en signifikant skillnad avseende progression till AP/BC (Kantarjian et al, 2010; Shah et al, 2010). Sammanfattningsvis indikerar studierna ovan att andragenerationens tyrosinkinashämmare (och högdos imatinib) ger en snabbare och djupare reduktion av antalet leukemiceller än standarddos imatinib, och att detta möjli- gen kan leda till minskad risk för sjukdomsprogression och förbättrad överlev- nad, men att det senare ännu ej kunnat styrkas. Detta har också gjort att man sökt definiera ännu djupare responskriteria än MMR vid KML- behandling. Complete Molecular Response (CMR) CMR, eller komplett molekylär respons är ett tekniskt svårpreciserat begrepp som ändå etablerats i aktuella kliniska KML- studier. Problemet med denna term är att den semikvantitativa RQ- PCR- tekniken inte har någon självklar definition av icke detekterbara nivåer, utan att det beror på känsligheten i analysen, och alltså till viss del på hur intensivt man letar efter förekomst av BCR- ABL1- tran- skript. Man har därför olika definitioner av CMR i olika studier, vilket gör att det delvis har varit svårt att jämföra resultat. I de aktuella nilotinibstudierna 5 (7)

ENESTnd och ENEST1st har man valt en praktisk lösning att tala om begreppen CMR 4 och CMR 4.5. CMR 4 definieras här antingen som detekterbar sjukdom med en 4- log reduktion av transkript, dvs BCR- ABL1 0,01% IS, eller icke detekterbara nivåer av BCR- ABL1 där analysen håller en sådan känslighet att man skulle ha detekterat transkript i denna nivå. I praktiken är detta alltså en definition som innefattar samtliga patienter som ligger minst 1 log under MMR (och CMR 4.5 innebär på motsvarande sätt minst 1,5 log under MMR) och begrep- pet komplett är här förvirrande då det även inkluderar patienter med mätbar minimal restsjukdom. Oavsett problematiken kring definitionen av CMR så är det rimligt att anta att ännu djupare svar är kopplade till bättre respons, och i ENESTnd- studien kunde man i 24- månadersdata visa att signifikant fler patienter på nilotinib jämfört med imatinib uppnådde CMR 4 (44% vs 20%) resp CMR 4.5 (26% vs 10%) (Hughes et al, 2010b). En ytterst relevant klinisk fråga är om behandling med tyrosinkinashämmare skulle kunna avslutas hos patienter med tillräckligt djup respons. Den franska STIM- studien (Stop Imatinib) har undersökt denna frågeställning (Mahon et al, 2010). Patienter med minst två års kontinuerlig CMR (i denna studie definierat som CMR 5, dvs 5 log reduktion av BCR- ABL1) inkluderades i studien, behand- lingen med imatinib avslutades och patienterna monitorerades med RQ- PCR för BCR- ABL1 varje månad. Efter 12 månaders uppföljning hade 41% av patienterna kvarvarande CMR utan tecken till återfall i sjukdomen. Av de 42 patienter som fick molekylär relaps så kunde CMR återupprättas efter start av imatinib hos 26 av dessa, övriga 16 uppvisade sjunkande nivåer av BCR- ABL1. Ur säkerhets- synpunkt kan noteras att ingen patient i studien progredierat till accelererad fas eller blastkris. Tills vidare bör tyrosinkinashämmarbehandling dock endast av- slutas inom ramen för klinisk studie. En större europeisk stopp- studie (EURO- SKI; Stop Kinase Inhibitors) kommer förmodligen att igångsättas under slutet av 2011. Sammanfattning Jag har i denna översikt beskrivit betydelsen av cytogenetisk och molekylärgene- tisk monitorering vid KML, och försökt visa den gradvisa förskjutning som nu sker från cytogenetiska analyser på benmärg till molekylärgenetiska analyser utförda på perifert blod. Jag har även lyft fram aktuella studier som antyder att det sannolikt är gynnsamt att uppnå ännu djupare och snabbare svar vid insatt behandling, och att det troligen kommer att vara möjligt att avsluta tyrosinki- nashämmarbehandlingen hos en andel av KML- patienterna. Dessa perspektiv medför än högre krav på känslig, standardiserad och reproducerbar molekylär- genetisk uppföljning för patienter med KML. Genetiska kliniken i Lund, 16 juni 2011 Hans Ehrencrona, docent, specialistläkare 6 (7)

Referenser Baccarani M, Cortes J, Pane F, et al. (2009): Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol. 27:6041-51. Hehlmann R, Lauseker M, Jung- Munkwitz S, et al. (2011): Tolerability- adapted imatinib 800 mg/d versus 400 mg/d versus 400 mg/d plus interferon- α in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. J Clin Oncol.29:1634-42. Hughes TP, Hochhaus A, Branford S, et al. (2010a): Long- term prognostic significance of early molecular response to imatinib in newly diagnosed chronic myeloid leukemia: an analysis from the International Randomized Study of Interferon and STI571 (IRIS). Blood. 116:3758-3765. Hughes TP, Hochhaus A, Saglio G, et al. (2010b): ENESTnd Update: Continued Superiority of Nilotinib Versus Imatinib In Patients with Newly Diagnosed Chronic Myeloid Leukemia In Chronic Phase (CML- CP). Blood. 116(21). Abstract 207. Kantarjian H, Shah NP, Hochhaus A, et al. (2010): Dasatinib versus imatinib in newly diagnosed chronic- phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 362:2260-2270. Mahon FX, Rea D, Guilhot J, et al. (2010): Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncol. 11:1029-35 Marin D, Milojkovic D, Olavarria E, et al. (2008): European LeukemiaNet criteria for failure or suboptimal response reliably identify patients with CML in early chronic phase treated with imatinib whose eventual outcome is poor. Blood. 112:4437-4444. Müller MC, Cross NC, Erben P, et al. (2009): Harmonization of molecular monitoring of CML therapy in Europe. Leukemia. 23:1957-1963. Saglio G, Kim DW, Issaragrisil S, et al. (2010): Nilotinib versus imatinib for newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 362:2251-2259. Shah N, Kantarjian HM, Hochhaus A, et al. (2010): Dasatinib Versus Imatinib In Patients with Newly Diagnosed Chronic Myeloid Leukemia In Chronic Phase (CML- CP) In the DASISION Trial: 18- Month Follow- up. Blood. 116(21). Abstract 206. Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, et al. (2011): Bcr- Abl kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood. 2011 May 19. [Epub ahead of print] 7 (7)