Några mikrobiella provtagningstekniker På säker grund för hållbar utveckling Helena Branzén, Lennart Larsson På säker grund för hållbar utveckling
Erfarenheter från pågående projekt Presentationen baseras på pågående projekt: Pilottest av förstärkt självrening i Alingsås Samverkansprojekt med Tvätteriet Alingsås och SGU Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 2
Upplägg Vad är mikroorganismer Vad kan analys av mikroorganismer användas till Vilka tekniker finns att provta mikroorganismer Vatten BioTraps Mesocosmer Hur analyseras mikroorganismer? qpcr - DNA contra RNA Vad visar svaret? Exempel på analysresultat Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 3
Hur används mikroorganismer inom EBH? Mikroorganismer reducerar eller oxiderar molekyler för energi och celluppbyggnad - metabolism Mikroorganismer reducerar eller oxiderar molekyler utan energinyttjande och celluppbyggnad - co-metabolism Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 4
Hur används mikroorganismer inom EBH? Genom att bryta molekylstrukturer (katabolism) kan de låna elektroner och få energi (givarmolekylen oxideras) Elektronerna tas om hand av mikroorganismernas enzym som mjölkar dem på energi för att producera ATP Elektronerna förs till en mottagare (elektronacceptor) som reduceras (vilket är fallet vid reduktiv deklorering) Enskilda enzym (organismens verktyg) sänker aktiveringsenergin för reaktionerna Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 5
Exempel på ämnen/ämnesgrupper som kan brytas ned med hjälp av mikroorganismer Alkaner (kolväten utan dubbelbindningar) Bekämpningsmedel (DDT mm) Ftalater Nonylfenoler Organiska explosivämnen, DNT PAH PCB Petroleumkolväten (MTBE, BTEX, mm) Klorerade alifater Klorfenoler Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 6
Hur används mikroorganismer inom EBH? Det flesta finns på plats där föroreningen är (kan övervakas eller förstärkas/biostimuleras) Kan tillföras för ett snabbare saneringsförlopp (förstärkning/bioaugmentation) Tillämpas som putsningssteg på föroreningsplymer, evt också källområden på svåråtkomlig förorening Ett område under utveckling Ett möte mellan olika discipliner Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 7
Vad är mikroorganismer? Eukaryoter Växter, djur, svampar, alger och protozoer Äter organogent material. Vissa andas syre, andra koldioxid Prokaryoter saknar cellkärna Archaea och bakterier Prokaryoter kan även använda andra typer av näring och brett spektrum av elektronacceptorer Mikroorganismer i regel encellinga och bestående av de 4 makromolekylerna proteiner, nukleinsyror, lipider och polysackarider Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 8
Bild från föreläsningsmaterial, University of Vermont, annan originalkälla Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 9
Bild från föreläsningsmaterial, University of Vermont Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 10
Var finns mikroorganismerna i marken? Merparten av bakterierna sitter fästa till jordpartiklar Aeroba bakterier ca 50 70 % av totala mikrobiella populationen Anaeroba bakterier ca 10 % Plus övrigt Bakterier i jord: 10 6 10 8 kolonnienheter/gram TS (colony forming units cfu) men vanligt är: 10 4 till 10 7 cfu/g Microbial Enumeration and laboratory-scale microcosm studies in assessing enhanced bioremediation potential of petroleum, Schaffner, et. al. och referenser däri (Grunda, 1985, Turco et al., 1995; Hazen et al., 1991) Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 11
Mikroorganismer vill gärna fästa till något Celldelning på ett konstgjort material (sk Bio-Sep bead med aktivt kol) från Microbial Insights, Inc. Fotografi från informationsmaterial/ppt, Sublette et al. 2010 Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 12
Några metoder för att provta mikroorganismer Grundvatten Konstgjorda provtagare för att locka bakterier Jord Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 13
Grundvatten Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 14
Grundvatten Enkelt Konserveras och är lätt att transportera Billig fältprovtagning Ögonblickbild i punkten, men kanske representativt för ett större område Resande mikroorganismer Eftersom man även analyserar inaktiva och döda mikroorganismer kan man kanske säga att det ger mer än själva provtagningsögonblicket Låg detektionsgräns (lätt medium att analysera) men innehållet, jfrt med jord, är också lägre Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 15
Konstgjorda provtagningsmedium ex Bio-Trap Standard Bio-Trap från Microbial Insights, Inc Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 16
Konstgjorda provtagningsmedium ex Bio-Trap Patenterat innehåll av 3-4 mm kulor, huvudsakligen bestående av aktivt kol (s.k. Bio- Sep beads) Erbjuder en mycket stor och lockande yta för bakterier att fästa vid (se bilden) Upphettade till 300 C för att rensa från kontaminering Kan kombineras med olika sätt att stimulera bakterietillväxt eller för att tillföra bakterier, s.k. advanced Bio-Trap Vi har hittat dem hos Microbial Insights, Inc. i USA men de säljs också av Envirogene Ltd, Storbritannien Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 17
Bio-Trap Enkelt men är färskvara före uthängning Skall sitta ute mellan 30 och 90 dagar för att fullt ut acklimatisera sig Ganska billig fältprovtagning (två resor) Kan inte konserveras och transport är tidskritisk samt måste vara kyld Passiv provtagare som samlar information under längre tid Kolonniserande mikroorganismer Låg detektionsgräns (förhållandevis lätt medium att analysera) men innehållet, jfrt med jord, är också lägre Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 18
Avancerad Bio-Trap Avancerad Bio-Trap enhet, infomaterial från Microbial Insights, Inc. Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 19
Många möjligheter Avancerad Bio-Trap enhet, infomaterial från Microbial Insights, Inc. Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 20
Mesocosmer Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 21
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 22
Mesocosmer Under utveckling (vi har hittat dem hos Bioclear BV i Holland och Vito NV i Belgien) Ganska besvärlig installation, dyr Acklimatiseringstid trots att det är platsspecifik jord Konserveras, transport är enkel Passiv provtagare som samlar information under längre tid, speglar den verkliga miljö och innehåller all befintlig historisk mikrofauna Aktiva, inaktiva och döda mikroorganismer Hög detektionsgräns pga inhomogent medium med störningar Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 23
Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 24
Vad analyseras? Huvudsaklig metod: qpcr kvantitativ polymerasteknik quantitative polymerase chain reaction Analys av dubbelkedjor DNA, eller enkelkedjor RNA DNA mer stabil, RNA bryts ned snabbare RNA är kopia av DNA och visar på aktiv celltillväxt DNA kan vara död Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 25
Vad analyseras? Analys av bakteriegrupper, ex Dehalococcoides sp. eller spp. med liknande egenskaper Eller analys av arten Dehalococcoides ethenes, som kan bryta ned VC till eten Eller stammen med en enskild egenskap; Dehalococcoides ethenes strain 195 Analys av bakteriens verktyg som sänker aktiveringsenergi för enskilda reaktioner enzym (=funktionella gener, reductase) Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 26
Ex. reduktiv deklorering Vi analyserar i princip de grupper som ansvarar för de olika elektronacceptorernas omsättning, grovt sett Geobacter (iron reducing bacteria) Fe(III) -> Fe(II) Sulphate reduction genes, Desulfuromonas (SO 2-4 -> H 2 S) Methyl coenzyme M reductase (CO 2 -> CH 4 ) Dehalobacter (PCE, TCE) Dehalococcoides (DCE, VC) Trichloroethene reductive dehalogenase (TCE) Vinylchloride reductase (VC) Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 27
Ex. på resultat från Bio-Trap Resultat från Microbial Insights, Inc., OBS celler/kula Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 28
Potential för reduktiv deklorering Avser resultat från Microbial Insights, Inc. (CENSUS Dehalococcoides 16S rrna gene, qdhc), OBS celler/ml Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 29
Tack för mig! Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 30
Namn på mikroorganismer Namn på mikroorganismer brukar anges först med genusnamn och därefter med dess s.k. artepitet. Exempelvis, för mikroorganismen Dehalococcoides ethenes, som kan brytas ned VC till eten, är Dehalococcoides genusnamnet och ethenes artepitetet. Dessa två namn tillsammans motsvarar organismens artnamn (Vetbact, 2013). Det kan ibland vara svårt att fastställa/identifiera artepitetet. Om man funnit att en bakterie med förbestämt genusnamn har en specifik egenskap, t.ex. utför reduktiv deklorering av TCE, men dess artepitet inte klarlagts brukar man benämna denna Dehalococcoides sp. (sp. är en förkortning för species och Dehalococcoides sp. betecknar ospecificerat Dehalococcoides). Om flera olika Dehalococcoides, vars artepiteter inte är fastställda, har en gemensam egenskap, anges dessa med spp. (t.ex. Dehalococcoides spp.). Ibland anges att olika stammar av bakterier har vissa egenskaper. Stam är undergrupp i en art. Exempelvis kan stammen Dehalococcoides ethenes strain 195 bryta ned VC till eten (Maymo-Gatell et al., 1997). Renare Mark Teknikseminarium Malmö 2013 31