Kromatografi Tekniker för att Rena Ex. inför vidare studier, terapeutisk användning etc. Fraktionera Ex. inför vidare analys, Depletion av HAPs från plasma inför 2D-gel (max-kapacitet <100 µg protein / gel) Fraktionering av glykosylerade proteiner HAP high abundant protein Kromatografi Ingående material Mobilfas(er) Tvättbuffert resp. Elueringsbuffert Stationärfas Kolonnmatris Tillvägagångssätt Detta exempel: vid framrening av enstaka protein 1. Ladda Prov 2. Samla Flowthrough 3. Tvätta bort kontaminanter 4. Eluera och samla upp eluat 1
Kromatogram ur verkligheten Retentionsparametrar Retentionsfaktor: k= V R V 0-1 Retardationsfaktor: R F = V o V R V 0 volymen av mobilfasen N; antalet bottnar H; bottenhöjden N=5.55 t R eller V R ( t R ) 2 W1/2 W 1/2 W b hp 2 h p N=16 t ( R ) 2 H = L W b N N=6.28 t ( R ) 2 A p 2
Van Deemter-kurvan H Cu H = A B Cu u A u = Eluent flow rate B/u A Multiple paths, beror av matrisens geometri (strömvirvlar->breddning) B Longitudinal diffusion, beror av diffusionen C Equilibration time, beror av den hastighet som molekylerna distribueras med H Plate height, höjden hos kolonnens teoretiska bottnar Perfusionskromatografi: stora porer går genom hela partikeln, snabbare flöden möjliga ty transporten in i porerna blir ej diffusionsberoende vilket leder till att C blir lågt Upplösning R s = t R2 -t R1 1 (w b1 w b2 ) 2 R s är beroende av Selektiviteten Retentionen Antalet bottnar t R1 t R2 Rent praktiskt Matrisens egenskaper Kolonnens längd Flödeshastigheten Buffertsammansättning w b1 w b2 3
Adsorption [PS] bundet K= [PS] [P][S] [PS] [S]=Q: antalet tillgängliga platser Ofta behöver man även ta hänsyn till tävlande molekyler. [PS] [ES]=Q [P] i lösning Langmuirs adsorbtions isoterm: [PS]= Q K [P] 1 K[P] Interaktioner Negativa laddningar Hydrofoba ytor Positiva laddningar Yta med specifik affinitet 4
Olika typer av kromatografi Separationsprincip Storlek, form Nettoladdning/laddning pi Hydrofobicitet Biologisk funktion Antigenicitet Sockerinnehåll Svavelinnehåll (Cys) Kromatografimetod Gelfiltrering Jonbyte Kromatofokusering HIC/RPC Affinitet Immunoadsorbtion Lectin affinitet Kovalent kromatografi Isokratisk eluering Samma buffert hela tiden Gradienteluering Buffertens sammansättning förändras över tiden Eluering Kompetitiv eluering En tillsatt molekyl får tävla med målproteinet om platserna på matrisen Exempel: IMAC matris - eluering med Imidazol Histidine Imidazol 5
Konc (%) Eluering Volym (ml) Kromatogram vid gradienteluering: ökande koncentration Imidazol Eluering startar vid ca 150 mm Imidazol Stationärfasen (1) Separation sker genom en skillnad i fördelning av molekyler i en mobil fas och en stationär fas Stationärfasen utgör oftast mer än 90% av kolonnvolymen Vanligast med kulformade partiklar, d=2-100µm Xerogeler-sväller i vatten (ex. dextran, akrylamid) Aerogeler opåverkade (ex. glas, silika) Monodispers Tresyl-matris 6
Stationärfasen Vilka egenskaper är intressanta? TSKgel Tresyl-5PW Stationärfasen (2) Och vilka egenskaper är i regel önskvärda? - Hydrofil - Inert yta Ingen egen affinitet till proteiner - Derivatiserbar (funktionella grupper) med möjlighet att ge Hög kapacitet - Stabil i extrema kemiska förhållanden ph, temperatur, organiska lösningsmedel - Tåla höga flöden bra mekanisk stabilitet - Möjlig att producera med olika porositet & partikelstorlek Ni-NTA (Qiagen) 7
Stationärfasen (3) Oorganiska material Silika * Glas Hydroxyapatite Organiska polymerer Syntetiska Polyakrylamide* Polymetacrylate Polystyren* Polysackarider Cellulosa* Dextran* Agarose* Silicagel från Fuji Silysia (the worlds largest LC-producer) * De vanligast förekommande materialen på lab Microporous Korskopplad dextran, polyakrylamid Små porer Ideala för gelfiltrering Mjuka, tål endast låga flöden Stationärfasen (4) Macroporous Aggregerade och korskopplade polymerer (agarose, polyakrylamid, silika ) Större porer Lämpliga för adsorptionskromatografi Kompositgeler Bestående av macroµ 8
Stationärfasen (5) Införande av aktiva grupper Jonbytesgeler En enstegsprocess - Oftast halogenid med den laddade gruppen som reagerar med matrisen i basiska förhållanden Affinitetsmatriser Oftast trestegsprocess - Aktivering av matrisen - Koppling av liganden - Blockering av resterande aktiva grupper (ex TSKgel Tresyl-5PW från TOSOH, Sulfo-Link från Pierce) Ligand-protein-interaktioner 1) Jon-jon-interaktioner eller jon-dipolbindningar 2) Vätebindningar 3) Van der Waalskrafter 4) π-π interaktioner 5) Hydrofoba interaktioner 6) Kovalenta interaktioner (S-S) 9
Kapacitet Nominell kapacitet - Hur många (teoretiska) platser det finns på matrisen Dynamisk kapacitet - Hur mycket gelen binder upp i det tänkta fallet Beroende av Målprotein Sammansättningen i råextraktet Buffertsammansättning Flödeshastigheten Kapacitet anges ofta i vikt/volym (ex mg/ml) Gelfiltrering, innan du börjar Vilken buffert behöver matrisen tåla? De flesta matriserna tål ph 2-10 (finns även de som tål upp till ph 14) Silika tål ej höga phn < 8 Vilken upplösning behövs? avsaltning<preparativ rening<analytiska applikationer partikelstorlek 5-50 µm (mindre partiklar->bättre upplösning) Flera matriser kan blandas eller packas på varandra Hur mycket och vad fastnar på matrisen? Icke-specifika interaktioner Ändringar i mobilfasen kan påverka proteinet (15 ms/cm brukar vara bra) Provvolymen: 1-2% av bäddvolymen för 100 µm-partiklar, ännu mindre volym för mindre partiklar 10
Avsaltning / Buffertbyte Vid avsaltning är det stor skillnad i storlek på de substanser som ska separeras Större frihetsgrader - Höga flöden kan användas - Stora provvolymer kan laddas (>30% av bäddvolymen) Proteinfraktionering Bäst separation då kontaminanterna vandrar i voiden Mindre än 30% skillnad i storlek ger svårighet att separera Stor porvolym och hög selektivitet önskvärt Stor kolonnarea -> stor provvolym kan laddas För att öka processiviteten, nytt prov kan laddas vid Vt 11
Storleksuppskattning mha GF Beroende av molekylens form Kalibrering med molekyler som har samma form sfär K D ; distributionskoefficient logm stav K D = V R -V 0 V i V 0 ; voidvolym V R ; retentionsvolym porvolym; V i =V t -V 0 K D Kromatofokusering ph 7.3 ph 7.4 ph 7.5 ph 7.6 ph 7.7 -- - -- - - - -- - - - repelleras snabb förflyttning binder till matrisen 12
Kromatofokusering Hög upplösning ph-gradienten bildas mha en jvt-buffert (högt ph) som sedan ersätts av en kromatofokuseringsbuffert (anjonbyte), polyamfolyter Den stationära fasen måste ha laddade grupper som inte titreras i det tänkta ph-intervallet Precipitering - ett problem Kan undvikas genom att proteinerna har en nettoladdning då de binder till matrisen Ökad jonstyrka kräver högre laddning för inbindning, detta påverkar dock ph-gradienten. Om proteinet faller kan det lösas upp igen då pht stiger Urea eller detergenter kan inkluderas i bufferten 13