Datorbaserade modeller inom ADMET samt molekylär funktion av transportörer Pär Matsson, Inst f farmaci Biofarmaci 7.5p HT 2014
Vad gör en molekyl till ett läkemedel? Molekylen måste binda tillräckligt starkt till målet nå målet i tillräcklig mängd (koncentration) ha en acceptabel toxicitet Farmakologi & läkemedelskemi ADME T Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity
ADMET-egenskaper Barriärer för läkemedelsadministrering Toxicity Biological target Renal excretion
Datorbaserade modeller inom tidig läkemedelsutveckling Dockning Struktur-aktivitetssamband ADMET Virtual screening Strukturinformation - dockning Bioinformatik farmakologisk profil ADMET Bioinformatik Strukturbiologi Olika nivåer: Struktur-aktivitetssamband Fysiologiskt baserad farmakokinetisk modellering (PBPK) Effektmodeller PKPD / farmakometri
Vad används ADMET-modeller till? Tidig fas (lead discovery) Design av HTS-bibliotek (high throughput screening) Prioritering av hits från HTS Senare faser (lead optimization, candidate selection) Optimering av ADMET-egenskaper Modeller används för alla olika egenskaper där in vitro och/eller in vivo-modeller finns, tex: PhysChem: löslighet, upplösningshastighet, pka, lipofilicitet, kemisk stabilitet etc ADMET: permeabilitet, proteinbindning, metabol stabilitet, hämning/induktion av metabolism, transportproteiner, BBBpassage etc
Exempel på hur beräkningsmetoder används i ADMET-forskning: Transportproteiner molekylär funktion och prediktiva modeller
Hur används beräkningsmetoder för att undersöka transportproteiner? Tre angreppsvinklar: Transportörens aminosyrasekvens Transportörens proteinstruktur MDLEGDRNGGAKKKNFFKLN NKSEKDKKEKKPTVSVFSMF RYSNWLDKLYMVVGTLAAII Molekylära egenskaper hos liganden (t ex läkemedel)
1) Kemoinformatiska metoder: Funktion från ligandstruktur Används när proteinstrukturen är okänd eller som komplement till proteinbaserade metoder kan ge ytterligare information, t ex egenskaper hos liganderna som inte är direkt kopplat till bindningen (t ex hur mycket substans når bindningssitet?) Målet är att identifiera kemiska egenskaper hos liganderna som är av betydelse för bindning till proteinet
Funktion från ligandstruktur Statistisk modellering (deskriptorbaserade modeller)
Statistiska struktur-aktivitetssamband (Deskriptorbaserad modellering)
Utveckling av struktur-aktivitetssamband Experimental data Validation Data set Statistics Model Molecular descriptors Use
Funktion från ligandstruktur Statistisk modellering (deskriptorbaserade modeller) Andra metoder: Farmakoforer, 3D-QSAR, strukturella fingeravtryck A Pharmacophore model B Molecular interaction field C Molecular fingerprint O CH 3 S O N CH 3 N F N O CH 3 HO H 3 C OH OH 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0
Farmakoformodellering Farmakofor: minsta gemensamma nämnare hos substanser som binder till samma site Mål: Hitta kemiska funktioner som sitter på samma plats i alla (många) ligander dessa är antagligen viktiga för bindning
Farmakoformodellering Grundläggande steg: Identifiera funktionella grupper som kan vara inblandade i bindningen (t ex H-bindningsdonatorer/acceptorer, joniserbara grupper, aromatiska ringar) Hitta konformationer där liknande molekylegenskaper går att överlappa (skapa alignment) Utvärdera farmakoforen: - Passar alla liganderna? - Måste liganderna anta ofördelaktiga konformationer? - Korrelerar passformen med uppmätt bindningsstyrka?
Farmakoformodellering Farmakoforer fungerar ofta bäst för serier av liknande substanser Svårt att överlappa väldigt olika molekyler Ofta få farmakoforelement om diverst substansset Matsson et al. JPET 2007 (323) 19-30
Exempel: Hämning av Organic Cation Transporter 2 (SLC22A2 / OCT2)
Mätt inhibition för 910 substanser
Fördelning av molekylära egenskaper OCT2-inhibitorer är generellt - större - mer lipofila - mer positivt laddade än icke-inhibitorer
Exempel på modelleringsprocedur
Viktigaste molekyldeskriptorerna för OCT2-inhibition Charge - fraction anionic/cationic - n acidic ionizable atoms - Average net formal charge Size/shape - Randic shape index path/walk - Gravitational gyrus of rotation Lipophilicity - Octanol-water partition coeff. (log P)
2) Bioinformatiska metoder: funktion från aminosyrasekvens Likheter i aminosyrasekvens antyder liknande funktion Kan ge idéer om proteinstruktur, möjliga ligander osv Jämförelser mellan aminosyrasekvenser gör genom parvisa alignments:
Funktion från aminosyrasekvens Likheten bedöms utifrån (bl a): Hur pass lika är aminosyrorna i en viss position? T ex, har en positivt laddad aminosyra bytts mot en annan positiv? Eller mot en negativt laddad? Är proteinerna lika över långa sträckor (hela aminosyrasekvensen) eller bara i vissa delar? Måste man sträcka ut det ena proteinet för att de båda ska överlappa? (kan t ex bero på att delar av genen klippts bort/kommit till under evolutionen)
En karta över humana SLC-transportörer (ca 500 st) Visar på släktskap mellan SLC-transportörer: Kända underfamiljer grupperas tillsammans Vissa kluster innehåller flera familjer Finns det funktionella samband mellan transportörer som liknar varandra sekvensmässigt?
Färglagt efter substrattyp
Ett okänt släktskap: SLC2 SLC22
Hur går det till? Transportprotein överuttrycks i en lämplig värdcell t ex Escherichia coli eller Saccharomyces cerevisiae Proteinet renas 3) Strukturbiologiska fram och kristalliseras metoder: genom tillsats av olika blandningar Funktion av lösningsmedel från proteinstruktur och stabiliserande tillsatser Kristallen belyses med röntgen och diffraktionsmönster detekteras och analyseras
Funktion från proteinstruktur Svårigheter och begränsningar: Svårt att kristallisera membranbundna proteiner Kristallstrukturen inte nödvändigtvis relevant för funktion Ofta svårt att vara helt säker på strukturen Behövs energiminimering av proteinet för att hitta den optimala strukturen strukturen blir en modell av verkligheten Men: Ger en detaljerad bild av hur proteinet ser ut och hur samkristalliserade ligander binder
P-glycoprotein från Mus musculus Aller et al, Science 2209 (323) 1718-1722
Sav1866 Staphylococcus aureus ABC transportör Dawson and Locher, Nature 2006 (443) 180-185
Strukturer för SLC-transportörer Ännu inga humana strukturer som är relevanta för läkemedelstransport Information om transportmekanism har framför allt kommit från transportörer från olika bakterier Till exempel LeuT, en leucintransportör från Aquifex aeolicus
Strukturer för SLC-transportörer Bindning av ligander till substratsitet i LeuT Singh et al, Science 2008 (322) 1655-
SLC-transportörer: Transportmekanism för LeuT
Strukturer för SLC-transportörer Bindning av en ickekompetitiv hämmare till LeuT Bindning av clomipramine till LeuT, en bakteriell leucintransportör Singh et al, Nature 2007 (448) 952-
Komparativ modellering / homologimodellering När det inte finns en kristallstruktur för det protein man vill studera: Hitta ett liknande protein med bestämd struktur Beräkna likhet mellan sekvenserna skapa alignment Byt ut aminosyror och finjustera strukturen genom energiminimering Antagande: skillnaden i aminosyrasekvens är liten nog för att övergripande struktur ska vara samma
Beräkningsmodeller för ligand-proteininteraktioner: Dockning till proteinstrukturer Syfte: att beräkna hur (och eventuellt var) en substans binder Oftast undersöks nya molekyler för ett känt bindningssite Noradrenalin dockad till en homologimodell av NET (SLC6A2) Schlessinger et al, PNAS 2011 (108) 15810-15815
Dockning till proteinstrukturer Två varianter av metoder: 1. Shape complementarity Här beräknas först formen på liganden och på bindningssitet för att se om dessa passar ihop Fördel: snabba beräkningar, kan docka många substanser Nackdel: flexibilitet i molekylerna måste hanteras separat 2. Simulated binding Här simuleras bindningsprocessen i många små steg, där liganden kan flytta sig/rotera och ligand+protein kan anpassa form för att maximera bindningsinteraktion Fördel: mer verklighetstrogen Nackdel: långsammare
Dockning till proteinstrukturer Dockningen utvärderas genom olika sk scoring functions, där t ex bindnings- och konformationsenergier beräknas för att hitta de mest troliga bindningsposerna
Utvärdering av dockningsresultat (virtual screening) Undersök de bästa dockningarna (högst docknings-score) Sortera alla undersökta molekyler var hamnar substanser som man vet binder till proteinet ( known ligands i figuren):
Exempel 2: Hur lika är de kemiska egenskaperna som leder till inhibition av olika transportörer i levern? kan vi förutsäga risken att påverka flera transportörer?
Viktiga transport- och metabolismvägar i levern
Viktiga transport- och metabolismvägar i levern
Basolaterala upptagstransportörer
Metabolism
Kanalikulära och basolaterala effluxtransportörer
Inhibition av upptagstransportörer minskade intracellulära koncentrationer minskad metabolism
Inhibition av effluxtransportörer Ökade intracellulära koncentrationer toxicitet
Inhibition av hepatiska transportörer SLC transporters (basolateral uptake): Organic cation transporter 1 (OCT1 / SLC22A1) Ahlin et al., J Med Chem 2008 (51) 5932-42 Organic anion transporting polypeptides: Karlgren et al., J Med Chem 2012 (55) 4740-63 - OATP1B1 (SLCO1B1) Karlgren et al., Pharm Res 2012 (29) 411-26 - OATP1B3 (SLCO1B3) - - - OATP2B1 (SLCO2B1) - - SLC transporters (canalicular efflux): Multidrug and toxin extrusion 1 (MATE1 / SLC47A1) Kido et al., manuscript ABC transporters (basolateral efflux): Multidrug resistance-associated protein 3 (MRP3 / ABCC2) Brouwer et al., manuscript Multidrug resistance-associated protein 4 (MRP4 / ABCC2) Brouwer et al., manuscript ABC transporters (canalicular efflux): P-glycoprotein (MDR1 / P-gp / ABCB1) Matsson et al., Pharm Res 2009 (26) 1816-31 Bile salt export pump (BSEP / ABCB11) Pedersen et al., manuscript Warner et al., Drug Metab Dispos 2012 (online) Multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2 / ABCC2) Pedersen et al., J Med Chem 2008 (51) 3275-87 Matsson et al., Pharm Res 2009 (26) 1816-31 Breast cancer resistance protein (BCRP / ABCG2) Matsson et al., JPET 2007 (323) 19-30 Matsson et al., Pharm Res 2009 (26) 1816-31
Olika storlekar och sammansättning av substansdataset för olika transportörer
Experimentella metoder transportörinhibition Transfekterade cellinjer eller inverterade membranvesiklar Transport av fluorescerande eller radioaktivt märkt substrat Testsubstans tillsätts Förändring av substrattransport mäts Exempel - Effluxtransportör med fluorescerande substrat: Ej inhibition: fluorescent prob pumpas ut låg intracellulär koncentration Inhibition: fluorescent prob fastnar inne i cellen
Hur stort är överlappet i inhibitorer? Vilka substanser inhiberar flera transportörer? Parvisa jämförelser av de olika dataseten Transportör A: 4 inhibitorer Transportör B: 3 inhibitorer m gemensamma inhibitorer / totalt n inhibitorer = 2 / 5 = 40% identiska Upprepa för alla möjliga kombinationer av transportörer I genomsnitt 74 substanser som testats för två transportörer (29-222 gemensamma substanser)
Exempel på substanser med fullständiga profiler
Kemisk likhet mellan transportörligander Varför? Utnyttja alla tillgängliga data för varje transportör Utveckla struktur-aktivitetssamband för varje transportör Jämför transportörer med avseende på vilka molekylegenskaper som är viktiga i modellerna Detta ger en bild av hur lika transportörernas bindningssite är
Kemisk likhet mellan transportörligander
Avstånd mellan transportörmodellerna
Avstånd mellan transportörmodellerna Basolateral anion uptake transporters + MATE1 Canalicular efflux transporters
Slutsatser Transportörernas affinitet för läkemedel korrelerar med indelning i underfamiljer (dvs med likheter i aminosyrasekvens) Också med var i cellen transportören uttrycks (kanalikulära eller basolaterala membranen) Struktur-aktivitetssambanden är liknande för många transportörer stor risk för inhibition av flera transportvägar samtidigt