Historian bakom neomycin

Historian bakom neomycin Av: Suzan Mahdi Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsproduktion 7,5 hp, HT. 2010 Institution för läkemedelskemi, avdelning för farmakognosi vid Uppsala universitet Handledare: Christina Wedén 1

Innehållsförteckning Inledning ------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Historisk bakgrund ------------------------------------------------------------------------------- Biosyntes och isolering av neomycin ---------------------------------------------------------- Biologiska aktivitet -------------------------------------------------------------------------------- Läkemedelsutvecklingen ------------------------------------------------------------------------- Kliniska effekten ---------------------------------------------------------------------------------- Användningensområden ------------------------------------------------------------------------- Biverkningar --------------------------------------------------------------------------------------- Diskussion ----------------------------------------------------------------------------------------- Referenser ------------------------------------------------------------------------------------------ 2

Inledning Neomycin är en av de 18 olika antibiotika som upptäcktes under Dr Selman A. Waksman ledning. 1931hade Dr Waksman startar ett laboratorium för att systematiskt studera marina organismer vid oceanografi institution vid Rutgers University (Waksmanfoundation.org, 2010). Dr Selman Waksman hade vunnit nobelpriset 1952 i fysiologi och biomedicin för hans stora forsknings bidrag inom mikrobilogi och marin bakteriologi (Nobelprize.org, 2010). Bild 1: Dr Selman Abraham Waksman (Nobelprize.org, 2010) Med hjälp av den kanadensiska dåvarande student Dr Hubert A. Lechevailer upptäcktes neomycin. Det är ett vattenlösligt aminoglukosid antibiotikum med ett brett spektrum. Den är effektiv mot båda gram positiva och gram negativa bakterier. Den har även visat effekter mot aktinomyceter (Waksman och Lechevailer, 1949). Dr Waksman och Dr Leichver hade stor förhoppningar att neomycin är mer effektiv och med mindre biverkningar än streptomycin för behandling mot tuberkulos. Men med tiden upptäcktes dess biverkningar och toxokilogiska effekter. Det visade sig allt mer att neomycin blev en besvikelse i den fronten däremot har det hjälpt till under olika studier. Intresset för neomycin blev mycket stort vilket initierade flera studier för ökat förståelse av dess effekter (Lechevailer, 1975). I denna studie kommer neomycins historia och olika effekter samt användningsområde att presenteras för att ge en detaljerad bakgrund om neomycins inverkan på infektioner men även andra potentiella användningsområde. 3

Historisk bakgrund Upptäckten av det första antibiotikum upptäcktes av en slump, så var inte fallet med upptäckten av neomycin. Det var på ett laboratorium i USA som en kanadensisk student, den nuvarande Dr Hubert Lechevalier, som han hittade neomycin genom hårt arbete och långa arbetstider. Han hade velat utveckla sig ytterligare inom mikrobiologi därav har hans intresse lett honom till Dr Salmen Wakaman laboratorium, som var känd och respekterad forskare inom mikrobiologi och baketriologi världen, vid Rutgers University. Dr Lechevalier ville fördjupa sig och forska inom tuberkulos(lechevalier, 1975). Efter att Dr Lechevalier och Dr Wakasman kom överens om en projektplan, började han arbeta systematiskt och med ett tydligt mål. Hans uppgift var att isolera aktinomyceter från olika jordprover och jämföra de mot fyra snabbväxande mykobakterier. I två veckor isolarade han 172 prov av aktinomyceter från fem olika jordprov.ett av dessa prov har visat sig mycket intressant, den hade inhiberande effekt på fyra olika mykobakterier samt gram positiva och negativa bakterier (Lechevalier, 1975). 1949 publicerades en artikel av Dr Lechevalier och Dr Waksman om neomycin effekter Neomycin, a New Antibiotic Active against Streptomycin-Resistant Bacteria, including Tuberculosis Organisms där detta antibiotikum döptes till neomycin. Det förklarades att neomycin bland annat är basisk, vattenlöslig termostabil antibiotikum mot grampositiva och gramnegativa bakterier samt mykobakterier men hade ingen påverkan på svamp. Den visade sig vara effektiv även mot streptomycin-resistent M.tuberculosis. Från denna punkt började resan med neomycin. Allteftersom visade det sig att neomycin är mycket toxisk och därmed man hade ingen användning av den mot det original målet, nämligen behandling av tuberkulos (Lechevalier, 1975). Biosyntes och isolering av neomycin Neomycin bildas av Streptomyces frudiae i en glukosrik metrix. Streptomyces frudiae är en gram positiv bakterie funnen mest i jord. Den tillhör familjen aktiomyceter som utmärker sig med sina trådlika utskott som liknar svamp hyfer. Streptomyces används mycket inom forskningen av antimikrobiska komponenter (Waksman et al, 1949). Bildningen av neomycin fortsätter så länge det finns glukos, amino-socker och andra socker arter för bildningen av cellulära material (Lechevalier, 1975). Den första optimala matris för bildningen av neomycin var var 5 g pepton och 5 g köttextrakt, 5 g glukos, 5 g NaCl samt 1L kranvatten. Bildningen av mer neomycin förbättrades ytterligare genom att minska surheten med CaCO 4 samt öka peptonhalten. Vid ökad glukoshalt blev produktionen av neomycin långsammare med fördelen att mer neomycin bildades (Waksman et al, 1949). Ytterligare studier visade att produktionen av neomycin ökade vid närvaro av vissa aminosyror, speciellt glycin och serin. Dessa hjälpte till med att skapa intemediaterna neomycin B, neomycin C pyrofostfat och neomycin C dispyrofosfat. Intemediaterna hade låga antibiotika effekter, men vi klyvningen av fosfatgrupperna mha. alkalinfosfatas som producerades av S,fradiae kunde det leda till den effektiva atibiotikan nemycin B sulfat (Lechevalier, 1975). 4

För isolering och koncentrering av neomycin har olika metoder använts. Ytterligare studier visade att detta antibiotikum var olöslig i organiska lösningsmedel. För att extrahera det måste man använda sig av adsorption-elution metod som har använts tidigare för vattenlösliga och basiska antibiotika. (Lechevalier, 1975). Detta innebär att med hjälp av ett filter som är laddad samt med en specifik porösitet kan komponenten bindas till filtret för att sedan elueras (Goyal och Gerba, 1980). Däremot har utvecklingen inom analytisk kemi och biomedicin lett till att identifiering, assay och upprensning kan ske med hjälp av liquid chromatography (LC) metoden. I denna metod användes pulserande amperometrisk detetktion (PAD) där elektroden bestod av guld. Neomycin och dess föroreningar tillhör en grupp som kan oxideras och kan därmed upptäckas av amperometri. PAD kan detektera stort antal och låga halter av aminoglykosid antibiotika. Genom användningen av LC kunde man undvika därmed det intensiva och tidsödande analyser med mikrobiologiska analyser. Dessa krävde exempelvis att varje test skall förberedas 16-24 timmar av inkulumering (dvs. att introducera en infekterande agent i en organism). Detta krävde mycket tid samt noggrannheten var låg med avseende på mätningen av bara neomycin (Hanko och Rohrer, 2010). Hanko och Rohrer 2009 visade däremot att en annan metod for analysering och isolering av neomycin som gav bland annat bättre noggrannhet, linjäritet, robusthet och precision. De använde sig nämligen av High-performance anion-exchange chromatography (HPAE). Den kan separera aminoglykosid antibiotika och sina föroreningar med ännu högre precision och noggrannhet än LC. Däremot har denna metod inte jämförts med mikrobiologiska assay med avseende på pris och robusthet. Figur 1: Neomycin modersubstans och en scma på de olika grupper som neomycin B respektive neomycin C har. (wikipedia.com, 2010) 5

Biologisk aktivitet Neomycin tillhör gruppen aminoglykosid antibiotika. Man vet idag att aminoglykosider inhiberar proteinsyntes samt minskar translationen av mrna i ribosomen hos bakterier. Den binder till S30 ribosomala undereneheten och inhiberar därmed den bakteriella proteinsyntesen (Merck.com, 2010b). Men den exakta mekanismen för den snabba dödliga effekten av aminoglykosid antibiotika är ännu inte helt känd (Toxnet, 2010). Tidigt har neomycins antibiotika spektrum definierats av Dr Salmen Waksman i en bok han redigerade 1958, där stod det att neomycin hade ingen effekt mot fungi. Den hade svag effekt mot några urdjur men den är mycket effektiv mot gram positiva, gram negativa bakterier och aktinomyceter. Däremot har anaeroba bakterier visat sig vara resistenta mot neomycin (Lechevalier, 1975). Senare studier har visat att neomycin även förhindrar förflyttningen av angiogenim i endotelcellernas cellkärna. Detta leder till hämning av en cells förmåga att inducera angiogenes (nybildning av blodkärl). Denna upptäckt har lett till att neomycin kan användas mot cancerogena celler. (Toxnet, 2010). Andra studier har visat att neomycin hämmar intraluminal hydrolys av triglycerider med långa kedjor, förmodligen genom hämning av pankreaslipasens aktivitet samt ökar utsöndringen av gallsyror i avföringen vilket kan bero på att neomycin minskar återabsorption av gallsyror (Toxnet, 2010). Den kolesterol minskande effekt beror inte på dess antibiotiska egenskaper, då sänkt kolesterolhalt i serumet visades endast vid oralt intag av neomycin (Lechevalier, 1975). Alla dessa biologiska aktiviteter är under forskning då neomycins toxicitet är ett problem som är svårt att undvika (Toxnet, 2010). Läkemdelsutvecklingen Efter upptäckten av neomycin på laboratoriet och publicering av Dr Waksman och Dr Lechevailer artikel 1949 sände en läkare ett prov från en patient som hade urinvägsinfektion (UVI). Bakterien som orsakade UVI, Aerobacter aerogenes, var resistent mot penicillin, streptomycin, klortetracyclin och kloramfenikol. Det visade sig att neomycin kunde inhibera denna bakterie. Därav skickade Dr Waksman neomycin till läkare och patienten åkte hem efter en veckas behandling (Lechevalier, 1975). Härifrån började intresset öka för neomycin som blev känt av att vara ett mycket effektiv antibiotikum med brett spektrum och en ljus framtid. Men allteftersom upptäckte man att neomycin leder till ototoxicitet och nefrotoxicitet vilket ledde till att läkemedlet inte längre rekommenderas för oral behandling. Tillverkarna började istället lansera neomycin för lokala behandlingar istället (Lechevailer, 1975). Det är tydligt att forskarna hade hoppats mycket med neomycin för att flera läkemedel över hela världen lansera neomycin som ett revolutionerande antibiotikum. Redan efter 25 år från upptäckten har 6 länder i världen lanserat neomycin såsom Japan, Danmark, Frankrike och Italien (Lechevalier, 1975). 6

Kliniska effekten Neomycin har många kliniska effekter. Nedan nämns några av de kliniska effekter (Merck.com, 2010b): Inhibiterande effekt på infekterade eksem Den användes för behandling av diarré orsakad av E.coli tilläggsbehandling vid behandling av hepatisk encefalopati behandling mot urinvägsinfektioner ögoninfektioner Neomycin inhiberar många grampositiva bakterier, bland annat: S.aureus E.faecalis M.tuberculosis Exempel på vissa gram negativa bakterier som neomycin hämmar är bland annat: E.coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris De kliniska effekter som neomycin har i vetrinärmedicin är bland annat: Mot infektioner som liknar vibrio- och borrelia-lika infektioner hos svin Profylax mot misstänksamma sepsis hos nyfödda svin (Toxnet, 2010) Neomycin har visat att det kan ge positiva kliniska effekter. Som alla läkemedel måste man väga fördelarna mot nackdelarna och neomycin har visat sig ge mycket mer nackdelara och chansen att drabbas av biverkningar är större än vad som skulle kännas säkert där av kommer biverkningar och användningsområden av neomycin att diskuteras ytterligare nedan. 7

Biverkningar Ju mer neomycin användes desto mer biverkningar upptäcktes, förutom minskad absorbering av kolesterol och andra fettsyror vid oral användningen visade den andra biverkningar såsom ototoxicitet och neufrotoxicitet (Toxnet, 2010). Dessa är mycket tydliga vid oralt intag. En av de allvarligaste biverkningarna är neufrotoxicitet. Detta kan bero på att neomycin elimineras främst via njurarna och kan lätt ackumuleras. Detta leder till ototoxicitet vilket är en av de första symptomen till neomycin toxicitet (Toxnet, 2010). En biverkning av neomycin som uppstår vid lokala behandlingar är kontaktallergi. Bild 2 visar ett exempel på detta. Läkemedlet Neosporin kräm, som innehåller neomycin, gramicidin och polymyxin B, leder till denna allergiska reaktion. Det bildas mild ödem på ögonlocket, konjunktival injektion och skador i hornhinnan. Denna reaktion uppstår hos endast 5% av patienterna men andra antibiotika är lika effektiva utan dessa risker. Därav har neomycin användning för lokala behandlingar minskat ytterligare i senare år att det tillslut har slutat säljas i de flesta länder i Europa (Yolton, 2010; Genteknik.se 2010). Bild 2. Ett exempel på neomycin preparat som ger en kontaktallergi (Yolton 2010). 8

Användningensområden På grund av de olika biverkningar som neomycin orsakade, begränsades användning av neomycin till lokalbehandlingar. Det fanns i krämer, ögondroppar, örondroppar och rektal salvor. Oralt användes neomycin mot tarmfloran vid förberedelsen till ett kirurgiskt ingrepp eller för behandlingen av leverkoma. (Merck.com, 2010a). I Sverige användes neomycin i bland annat topikala krämer och emulsioner mot infekterade eksem. En av formuleringarna var Betnovat som innehöll båda neomycin och betametason. Denna slutade tillverkas pga låg försäljning i hela Europa (Janusinfo.se, 2010). Idag finns neomycin i endast ett preparat, Mekostest, som används för diagnos av allergisk kontaktdermatit (Fass.se, 2010). I ett antal EU-länder däremot är neomycin godkänd för användning för behandling av livsmedelsproducerande djur. I sverige för närvarande så finns det inga mediciner som är godkända för human- eller veterinärmedicin (Genteknik.se, 2010). Ett helt annat användningsområde för neomycin är isoleringen av andra mikroorganismer. Den används för att inhibera tillväxten av oönskade mikroorganismer såsom bakterier från marin algerskulturer. (Lechevalier, 1975). Andra användningsområde kan vara bland annat att kartlägga neuron verkningsmekanismen, det kan vara en reagens DNA analys, eller det kan användas i petroleumtankar för att inhibera tillväxten av slam (som är rest från reningsverk) (Lechevalier, 1975). Diskussion Neomycin har visat sig vara ett antibiotikum med mer nackdelar är fördelar för humanmedicin. Dess biverkningar förekommer ofta hos många patienter vilket ledde till att sjukvården valde att använda andra antibiotika för att undvika dessa besvär. Men även om den inte används så mycket inom medicin, båda humana och veterinära, har neomycin bidragit med mycket för forskning såsom forskning. 9

Referenser Genteknik.se {Internet}. (22 september 2010). Gentekniknämndens policy angående antibiotikaresistensgener i växtmaterial. URL: http://www.genteknik.se/bazment/360.aspx Goyal S.M. and Gerba C.P. (1980). Simple method for concentration of bacteria from large volumes of tap water. Appl Environ Microbiol.; 40: 912 916. Hanko V.P and Rohrer J.S. (2010). Suitability of a liquid chromatography assay of neomycin sulfate to replace the microbiological assay for neomycin in USP Monographs. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 51; 96 102 Janusinfo.se {Internet}. (22 september 2010). Betnovat med neomycin avregistreras. URL: http://epitest.janusinfo.se/notiser/betnovat-med-neomycin-avregistreras/ Lechevalier HA. (1975). The 25 Years of Neomycin. CRC Crit Rev Microbiol. ;3:359-97. Merck.com {Internet} 2010. a. Aminoglycosides; c 2009-2010 { 22 September 2010}. URL: http://www.merck.com/mmpe/sec14/ch170/ch170b.html?qt=neomycin&alt=sh b. Neomycin; c2009-2010 {citerad 22 september 2010}. URL: http://www.merck.com/mmpe/lexicomp/neomycin.html Nobelprize.org. (22 september 2010). The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1952: Selman A. Waksman. URL: http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1952/waksman-bio.html Toxnet {Internet}. Neomycin (22 September 2010). URL: http://toxnet.nlm.nih.gov/cgibin/sis/search/r?dbs+hsdb:@term+@rn+1404-04-2 Waksmanfoundation.com {Internet}. (22 September 2010). The Foundation and Its History. URL: http://www.waksmanfoundation.org/html/foundation_history.html Waksman S.A. Frankel J and Graessle O (1949). THE IN VIVO ACTIVITY OF NEOMYCIN. J Bacteriol. 58: 229 237. Waksman, S. A. and Lechevalier, H. A. (1949). Neomycin, a new antibiotic active against streptomycin-resistant bacteria, including tuberculosis organsims, Science. 109; 305-307. Yolton Diane {Internet}. ( 22 september 2010). Review of Antibacterial Drugs Used For Treatment of Ocular Infections. Continuing education program at Pacific University in Oregon. URL: http://www.pacificu.edu/optometry/ce/courses/13036/antibacterialpg4.cfm 10