Heparin. Jay McLean upptäckare av heparin. Saleh palanijafi. Handledare: Christina Wedèn

Heparin Jay McLean upptäckare av heparin Saleh palanijafi Handledare: Christina Wedèn Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling 7,5 hp. Avdelningen för Farmakognosi Institutionen för läkemedelskemi Uppsala universitet Ht-2011 1

Sammanfattning Naturen är en viktig resurs och kraftfulla källor för upptäckt och utveckling av nya läkemedelssubstanser och för cirka 95 år (1916) sedan upptäcktes heparin för första gången av Jay McLean, en 26 årig läkarstudent på andra årets studie vid Johns Hopkins universitet i USA. McLean började arbeta under ledning av professor William Henry Howell för att undersöka tromboplastiska egenskaper, så han lyckades istället att isolera ett fettlösligt fosfatide antikoagulanta i hund levervävnad, men den utvecklades senare av forskarna att framställa framgångsrikt en vattenlöslig antikoagulant läkemedel, vilket ledde till att deras försök gav tillfredställande resultat. McLean fick identifiera värdet på tromboplastisk substans i kroppen, hjärnans vävnad, och då upptäcktes slumpmässigt heparin vilket visade att blodet aldrig koagulerade och den framtagna läkemedelsubstansen har en stark antikoagulant effekt. Heparin är en sulfaterad polysackarid som tillhör glykosaminoglykan vilket bildas i mastceller och består av två grundläggande sackarider; en aminosyra socker och en uronisk syra som gör att läkemedlet har en stark sur egenskap. Metoder som används är Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), Flouresens Detector (FD), ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS), Mass Spectrometry (MS) och nuclear magnetic resonance NMR). De är effektiva för separation och strukturell karaktärisering av disackarider beredning från heparin. Upptäckten och utvecklingen av heparin ledde till att finna heparin derivat, ett lågmolekylärt heparin som är ett modifierat heparin form med en längre halveringstid i kroppen. Heparin används huvudsakligen vid behandling av djup venöstrombos och lungemboli i förebyggande syfte vid kirurgiskt ingrepp och som terapeutisk behandling vid dessa tillstånd. 2

Innehållsförteckningar Sammanfattning 2 Inledning 3 Historisk bakgrund..3 Jay McLean upptäckare av heparin...3 Willian Henry Howell.5 Charles Best 5 Erik Jorpes..5 Kemiska strukturen 6 Hur upptäcktes läkemedelssubstansen.6 Metodbeskrivning för extraktion och isolering av substansen.7 Läkemedelsutveckling 8 Heparin derivat..9 Klinisk effekt och användning 9 Antitrombin och verkningsmekanism av heparin..10 Referenser..11 3

Inledning: Detta delmoment av kursen biologiskt aktiva naturläkemedel i läkemedelsutveckling i mitt fall fokuserar på en läkemedelsubstans som är ursprungligen från djuren. Detta naturläkemedel har en intressant historisk bakgrund att utreda. Studien beskriver att historien om upptäckt och utvecklingen av läkemedel för behandling av trombotiska sjukdomar är rik på historiska lärdomar, fylld med fascinerande personligheter och framför allt är en lång odyssé av fantastiska medicinska framsteg och utveckling. Naturen innehåller mycket potentiella struktur som är kraftfulla källor för utveckling och tillverkning av läkemedelsubstanser. Så naturen är en viktig resurs när det gäller upptäck och framsteg för läkemedelsutveckling (Mueller R.L, Scheidt S, 1994). Historisk bakgrund Heparin är en av de äldsta naturläkemedelsprodukter som för närvarande är i utbredd klinisk användning som antikoagulant i hela världen (Wardrop, Keeling. 2008 och McLean, 1959). Studien konstaterade att endogen antikoagulant i levern släpptes efter experimentell injektion av pepton i hunden, senare forskarna identifierade den vattenlösliga substans som liknade dagens heparin. Studien visade också att en vattenlöslig vävnad extrakt som antikoagulantia år 1887, men kunde inte beskriva och karakterisera den ytterligare, samt många andra forskare har försökt att fixa fram en vattenlöslig antikoagulanta läkemedel heparin men deras försök gav inte tillfredställande resultat fram till år 1916 (Marcum, 2000). Jay Mclean upptäckare av heparin Enligt studien heparin för första gången upptäcktes av Jay McLean en 26 årig läkarstudent på andra årets studie vid Johns Hopkins universitet år 1916 när han arbetade under fysiologen William Henry Howell. Han började arbeta under ledning av professor William Henry Howell för att undersöka prokoagulant eller tromboplastiska egenskaper, så han lyckades isolera ett fettlösligt fosfatide antikoagulantia i hund levervävnad (McLean 1956, och Mueller, Scheidt, 1994). När han började jobba hos William Henry Howell så ville han ha ett komplicerat problematisk ärende som han ville lösa problemet själv. McLean fick ett problematiskt ärende genom att bestämma värdet på tromboplastisk substans i kroppen, hjärnans vävnad. Han arbetade med forskning fram till juni 1916 och lämnade ett förslag till professor Howell att det kan vara lönsamt att utvinna fosfatider från många olika organ, exempelvis från hjärta och lever heparfosfatider. Utifrån de sparade partierna av Courin och hepartrombofosfatid test, ledde till att kunna hitta heparin. Det var ett slumpartat beslut som gjordes och orsakade heparin framställning. Studien pekar på att McLean gick till Howell och meddelade honom om upptäckt antitrombin och lade fram provet på Howell laboratoriums bord och Howell var mycket skeptiskt och påvisades att blodet aldrig koagulerade och denna substans är en stark antikoagulant. Det tog tid att visa och övertyga Howell om att framtagna testbevis hämmar koagulering av blod och demonstrerade heparin intravenöst i vivo på en hund (Mclean 1959). Jay McLean arbetade 4

som kirurg läkare och avled vid 67 års ålder av ischemisk hjärtsjukdom. Flera forskare har försökt undersöka heparin vidare (Mueller, Scheidt, 1994). William Henry Howell Enligt studien William Howell arbetade som professor i fysiologi och blev överraskad när McLean kom fram och informerat att han har upptäckt antitrombin. Denna upptäckt var så överraskande att Howell förväntade sig att McLean skall isolera tromboplastin, en propp främjande ämne från djurvävnad. Howell myntade uttrycket heparin år 1918 (från hepar, grekiska för lever) för den befintliga typen av fettlösliga antikoagulant. Han skrev om isolering av heparin från lever i en artikel. Två år senare, början av 1920-talet isolerade Howell en vattenlöslig polysackarid antikoagulant, även om det skilde sig från fosfatide beredning som isolerades tidigare. Det var säkert att arbetet McLean förändrade fokus av Howell grupp för att vidare leta efter antikoagulanta substans, vilket så småningom ledde till polysackarid upptäckt (Messmore, et al, 2004). Howell avgick år 1931 från sin tjänst vid Johns Hopkins och avslutade att göra vidare forskning på heparin. Men däremot det fanns intressanta forskare i andra delar av världen började arbeta på ett sätt att bättre rena heparin och därigenom undvika dess biverkningar (Wardrop, Keeling, 2008). Charles Best Studien visade att läkaren och fysiolog Charles Best började år 1928 att sätta ihop ett team av biokemister, fysiologer och läkare för att jobba vidare med heparin. Han beslutade att utveckla heparin till någon användbart för forskning och klinisk ändamål samt kunna minska eller eliminera dess tidigare biverkningar. och att heparin har effekter att förebygga blodproppsbildning (Wardrop D, Keeling D, 2008). så Charles Best Team från Toronto gjorde heparin tillgänglig för kliniskt användning och mellan år 1929 och 1935 behandlade de sina första människliga patienter, lärde de sig att nötkött lunga var den mest tillförliga källan för heparin. De visade att med en fulländat teknik producera säkra och giftfria heparin som kan ges till patienter i en saltlösning. Då första försök börjades använda heparin på människa i maj 1935, och genom år 1937. Det stod klart att framtagna heparin var en säker, lätt tillgänglig och effektiv antikoagulant läkemedel (Messmore, et al, 2004). Erik Jorpes År 1929, Erik Jorpes, en svensk biokemist besökte Charles Best i Toronto för att följa produktionen av insulin som Charles har forskat fram. Jorpes visades runt laboratorium och introducerades arbetet med heparin och deltog i heparin forskning. Jorpes återvände därefter till Stockholm och började sitt eget försök att isolera och karakterisera heparin substansen. Han började utreda den kemiska strukturen av heparin. År 1935 låste han upp en del av hemligheten av heparin strukturen vilket hade en stor inverkan på andra som arbetade i detta område samt forskningen på strukturen av heparin gjorde det möjligt för det svenska företag Vitrum AB att lansera den första heparin produkten för intravenöst bruk under 1936 (Messmore, et al, 2004 ). 5

Kemisk struktur av heparin. Heparin är en heterogen grupp av kroppsegna substanser, vilket är starkt sur (www.ne.se/heparin). Karaktären av den aktiva gruppen är närvaron av svavelsyra radikaler som är mest framträdande i strukturen av heparin. Närvaron av tre svavelsyror radikaler gör det möjligt att antikoagulant aktivitet ligger i dem, men det är tidigt att göra definitiv uttalanden utan ytterligare bevis och studier. Efter en viss renhetsgrad gjordes, verkade ingen ytterligare rening vara möjligt. Proverna analyserades sedan och visade sig innehålla ca 17-19 % hexuroniska syror och en mängd av hexosamin och uronisk syra (Jorpes, 1935). Heparin är en sulfaterad polysackarid som tillhör glykosaminoglykan, vilket har en linjär polysackarid som bildas i mastceller, består av två grundläggande sackarider; en amino socker och en uronisk syra. Den aminosyra socker är typiskt antingen N-acetyl-D-glykosamin eller N-acetyl D-galaktosamin. Uronisk syra är antingen D-glukuronsyra eller L-iduroniska syra och några av hydroxi grupp i både glukosamin och i uronisk syra är sulfaterat i en annorlunda sätt (Galeotti, Volpi 2011. Samuelsson 2004. Lindahl, Lindahl 1984). Den relativa molekylsvikt av heparin polysackarider ligger mellan 5-25 kda, och det är sulfatgruppen och karboxylgruppen i den kemiska strukturen gör att heparin blir starkt surt. Det visades att heparin sekvensen består av 60-90 % av upprepade trisulfater, disckarid enheter såsom L-iduroniska syror och glukosamin som både har sulfater med sig, och resterande 10-40% av polymer består av övriga disackarider som består av D- glukuronisk sura och D-glukosamin sulfat, Se figuren 1. Heparin är kovalent bundna till glykoproteiner i mastceller av både däggdjur och människor och är framställt av nötkött från lunga eller svintarmar.(samuelsson, 2004, www.glycosan.com/ha science/what heparin.html ). Studien beskriver att Howell och Holt döpte heparfosfatid heparin år 1918, och bekräftade sin löslighet i organiskt lösningsmedel (Mueller, Scheidt, 1994). Figur 1. Kemiska strukturen av heparin. Bild från wikipdia.org Hur startades och upptäcktes läkemedelssubstansen. Jay McLean konstaterade att han ingen hade tanke på att framställa en antikoagulant substans som heparin, när han började forskningen vid Johns Hopkins medicinsk skolan(mclean, 1956). 6

Howell`s främsta intressen var att forska det ämne som styr blodets förmåga att levra, och han trodde att det finns en balans mellan en blodpropp hämmare(antitrombin) och en prokoagulerande (tromboplastin). McLean tilldelades av Howell att undersöka kemisk renhet av cefalin beredning och forska om hepartromboplastisk (Mclean 1959, Wardrop, Keeling 2008). Forskaren McLean var inte faktiskt ute efter en naturlig antikoagulanta substanser, i själva verket gav han sig ut att karakterisera naturliga prokoagulant eller tromboplastiska ämnen från hund lever. Hans forskning ledde slumpmässigt till upptäckten av antitrombin, en isolerad fettlösligt fosfatide antikoagulantia i hund levervävnad, vilket Howell var skeptisk när han blev informerat om detta av forskaren McLean. Studien påvisades att blodet aldrig koagulerade i testerna, och framtagna substans hade en starkt antikoagulerande effekt. Genom att övertyga Howell, placerade McLean en bägare på Howell`s laboratorium skrivbord och tillade heparfosfatide blodet aldrig koagulerade eller proppbildade. Howell kunde inte acceptera detta resonemang samt tänkte på alla antitrombin, måste vara ett protein, inte en fettlöslig eller lipid. Det var ett slumpartat beslut som gjordes och orsakade heparin framställning (Mueller, Scheidt 1994 och McLean, 1959). Heparin demonstrerades och testades intravenöst i vivo på en hund (McLean 1959)som var inte biverkningsfri och ledde till en massiv blödning hos försöksdjur. År 1918, två senare presenterade Howell en vattenlöslig extraktion för att isolera heparin, med en förbättring till protokolet och identifierade vattenlösliga kolhydrater molekyl som innehöll glukuronsyra. En inledande vidare forskning och upptäckt ledde till att Howell lyckades att tillverka vattenlösligt heparin från fettlösliga fosfatider (Wardrop, Keeling 2008). Metodbeskrivning för extraktion och isolering av substansen McLean var mer nöjd med ett extrakt av lever än extrakt av hjärtat, som hade en starkt antikoagulerande effekt. Heparin isolerades ursprungligen från hund leverceller (Mclean 1959). Charles Best och hans erfarna kollega David Scott isolerade ett råheparin från nöt lever, och hepatisk vävnad där heparin kunde identifierats. De kom fram till och drog slutsatsen att levern, musklar och lungvävnad var lämplig kandidat ställe som visade att heparin var mest förekommande i dem (Wardrop, Keeling 2008). Studien visade att metoderna såsom Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), Flouresens Detector (FD), ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) är effektiva för separation och strukturell karaktärisering av disackarider beredning från heparin. Denna metod har tillämplighet för snabb differentiering av heparin och det framställs genom olika depolymerization processer och för analysen av sammansättningen av små mängder av prover av biologiskt ursprung genom att använda den mycket känslig fluorescens detektor (Galeotti, Volpi. 2011). Förbättringar i metoder för separation av oligosackarid komponenter och karakterisering av mass spectrometry (MS) och nuclear magnetic resonance NMR) som är kraftiga verktyg för att få fram strukturella information och förväntades att snabbt accelererar biokemisk forskning inom detta område. Det finns många andra utvecklade metoder (exempelvis HPLC- MS) som är effektiva metoder för separation av polysackarider, disackarider, oligosackarider i heparin struktur (Korir och Larive. 2009). Metoder för heparin analys har utvecklats under åren och har använts för två syften. Den första var att standardisera styrkan av produkterna tillgängliga för kommersiella bruk, den andra var att fastställa heparin nivåer i prover i vivo blod. Testmetoden partial tromboplastik time (PTT) har utvecklats under 1960-talet och det är fortfarande ett vanligt kliniskt mått på graden av 7

antikoagulantia som korrelerar med effektiviteten. Isolering av ett trombinhämmare från normalt blod hade avgörande betydelse för slutlig förståelse av verkningsmekanismen för heparin i blod. Den hämmande effekten av antitrombin befanns, vara förbättrad 1000 gånger genom heparin. Det har visat att identifierade enzymer i koagulationskaskaden som hämmas, var antitrombin. Den serin protease enzym som är mest aktiva i bildandet av trombin befanns som vara faktor Xa. Det visades också att hämning av faktor Xa som antitrombin markant stärktes av heparin, var hämning av faktor Xa relativt mer hämmande på fibrinbildning än trombin hämning och mängden av faktor Xa behövs för att ge koagelbildning i vivo var relativt sett mindre än trombin. Studien påpekade att några utredare fattade beslut att utveckla låg molekylsvikt av heparin som en produkt (Messmore, et al, 2004). Läkemedelsutveckling Studien visade att McLean och Howell ursprungliga fosfatide heparin möjligen var en blandning av fosfolipider, inositol fosfatider och fosfatidylserin, vilket visade sig ha antikoagulerande aktivitet. Ytterligare rening av Howell och Holt mellan 1922 och 1928 avslöjade att den nya heparin inte var en lipid av något slag men i själv verket var ett sulfaterat kolhydrat (innehåller dess vattenlöslighet) som finns i pepton chock blod (Marcum, 2000 och Mueller, Scheidt 1994 ). Vattenlösligt heparin började tillverkas kommersiellt av ett lokalt läkemedelsbolag i Baltimore i USA, men utförts studier vid Mayo Clinic, Minnesota, Edward Mason visade att denna beredning orsakade biverkningar inklusive huvudvärk, feber och illamående. Howell blev bekymrad att höra dess toxiska bieffekter. (Wardrop, Keeling 2008). En annan studie konstaterade att många olika aktörer bestod av företag, akademiska institutioner, innovatörer, privatläkarmottagningar, forskare, kemister, farmakologer, läkare och fler till, från USA, Europa och Kanada började studera föreningar från enkla organiska syror och polycyliska föreningar till stora sulfaterat kolhydrat kedjor och till stora glykoproteiner. Berättelsen om heparin innebär att många vetenskapsmän på två kontinenter fick flera fynd chans att lycka med forskning och många fick förhinder att lycka med utvecklingen och framsteg (Mueller, Scheidt 1994). Forskargruppen i Toronto började undersöka självständigt på heparin under år 1929 och lyckades med att producera ren kristallin heparin år 1933 med deras nya teknik. Det påpekades att tillverkade heparin av Charles och Scott skilde sig från McLean`s fosfatide och Howell`s kolhydrat heparin men den var inte rent i kemisk strukturen vilket ledde till klagomål från företagsforskargruppen. Så med fortsättningen lyckades de under år 1937 att framställa en lösning av heparin i saltlösning som resulterade i en signifikant ökad koagulationstid utan inga toxiska biverkningar((marcum, 2000 och Wardrop, Keeling, 2008). Källan för isoleringen var annorlunda (nötkött lungor), troligen förklarar skillnaden i egenskaper från Howell hund lever heparin. Köpenhamns grupp Schmitz och Fischer även renat heparin i 1933 och stockholm gruppen 1935. Jorpes från Stockholm också renat heparin och löst dess kemiska struktur, vilket bekräftar att det är en mycket sulfaterad glykosaminoglykan. Jorpes renat heparin injicerades i frivilliga försökperson med framgångsrikt effekt utan skadeverkningar eller biverkningar 1935, som markerar början av den kliniska era av heparin. Slutligen visades att heparin hos människor var väl tolererad och effektiv hematologisk i antikoagulering blodet och effektiva för att förhindra trombos. Imponerande kliniska rapporter började växa fram mycket snabbt efter den fantastiska profylax data för heparin och framgångsrik behandling med heparin vid venöstrombos år 1938. Allt fler 8

rapporter tyder på att heparin har utvecklat framgångsrik med tillfredställande effekt. Användning av heparin för en mängd olika venös eller arteriell trombotisk sjukdom blev standard på 1940- talet, stora randomiserade och kontrollerade kliniska studier följdes senare och etablerade rollen för heparin i tromboemboliska sjukdomar. Nuvarande heparin är framställt från naturliga källor, nöt lungor eller fläskkött tarmen. För nuvarande 10 läkemedelsföretag producerar kalcium eller natrium heparin i USA. År 1968 identifierades antitrombin III (ATIII) som heparin kofaktor protein och på 1970 talet beskrev andra grupper de exakta molekylära mekanismerna av heparin, är aktivering av ATIII och dess resulterande hämning av trombin och andra protein koagulation (Mueller, Scheidt 1994). Frisättning eller frigörandet av heparin från mastceller sker i speciella situationer, inte nödvändigt i samband med blodkoagulering, exempelvis allergiska reaktioner eller andra inflammatoriska tillstånd. Ett nytt grepp av den funktionella rollen av heparin uppstod med nyligen upptäckt att koagulation enzymer producerades och utsöndrades av makrofager. (Lindahl, Lindahl. 1984). Heparin derivat Upptäckten och utvecklingen av heparin ledde till att finna heparin derivat, ett lågmolekylärt heparin som var ett modifierat heparin form med en längre halveringstid i kroppen. (www.wikipedia.org/wiki/heparin). För närvarande är lågmolekylärt fraktioner av heparin genomgår en snabb klinisk utveckling som växer framåt, stödjer deras överlägsenhet till standard heparin med avseende på blödning och antitrombolisk effekt. Förekomst av naturligt förekommande lågmolekylära började syntetiseras från fraktioner först i mitten av 1970-talet, då upptäcktes att lågmolekylära fraktioner hade en mycket högre andel av anti-faktor Xa- aktivitet för att antitrombinaktivitet än vad en standard heparin har. Kliniska prövningar för att förebygga och behandla venös tromboembolism följde på 1980-talet och fortsätter till med idag (Korir och Larive. 2009, Mueller, Scheidt 1994). Lågmolekylärt heparin har nu till stor del ersatt ofraktionerat heparin. Den viktigaste orsaken är att de producerar mycket mer förutsägbara antikoagulant. Studien pekar på att man väntar nu på resultaten av fas III-studie av direkt oral trombinhämmare och direkt oral anti-faktor Xahämmare. Dessa läkemedel kommer säkert att finnas tillgängliga inom de närmaste åren (Wardrop och Keeling 2008). Heparin utvecklades under tiden och har några modifierad form av heparin derivat (exoxaparin, dalteparin och tinaparin) som är effektiva att förebygga djup venöstrombos och lungemboli hos patienter som har risk för dessa tillstånd (läkemedelsboken, 2009-2010). Klinisk effekt och användning Heparin är en tillfredställande läkemedel som används huvudsakligen vid behandling av trombos och lungemboli i förebyggande syfte vid kirurgiskt ingrepp och som terapeutisk behandling vid dessa tillstånd (fass.se). Heparin fungerar som en antikoagulant läkemedel, förekommer från naturliga djurriket och förhindrar blodpropp bildning i blodet. användning av låg dos heparin som profylax mot djup venöstrombos var då utökats till medicinska sjukdomar, såsom hjärtinfarkt, akut hjärtinfarkt, stroke och ryggmärgsskada (Messmore, et al. 2004). 9

Antitrombin och verkningsmekanismen av heparin Antitrombin är en viktig protein som produceras av levern och transporteras sedan till blodplasma och tillhör serin proteas hämmare vilket gör att inhibera koagulationsfaktorer och trombin.så heparin ökar snabbt hastigheten av antitrombin vilket hämmar trombin och miskar risken för koagulering av blodet. Det har visats att antitrombin är en av de viktigaste antikoagualanta faktorer i blodet och antitrombin`s effekt ökar när interagera med glykosaminoglykan, speciellt med heparin. Antitrombin hämmar koagulation proteaser genom att bilda stabila komplex med enzymer. Bildandet av dessa komplex innebär angrepp av enzymet i en specifik Arg-Ser bindning i karboxiterminal område av hämmaren. Komplexen så bildades är inte skiljas av denaturering lösningsmedel, vilket tyder på att en kovalent bindning som kan bidra till deras stabilitet. Denna bindning kan vara en acyl bindning mellan den aktiva platsen serin av enzymet och arginin i klyvad reaktiva bindning av hämmare. Men de nativa komplexer dissocieras långsamt vid nära neutralt ph till fritt enzym och en modifierad hämmare, kluvna som reaktiva bindning. Reaktionerna mellan antitrombin och protease koagulation är långsamma i samband med frånvaro av heparin. Men optimala mängder av heparin påskyndar dessa reaktioner upp till 2000 gånger, vilket effektivt förhindrar bildandet av fibrin i blod. Den accelererande effekt, och därmed antikoagulationsaktivitet visades att endast omkring en tredjedel av molekyler i alla heparin beredning förekommer, medan övriga molekyler substanserna är nästan inaktiva. Detta konformationella ändring följer en inledande, svag bindning av heparin till antitrombin och orsakar det täta samspelet mellan polysackarid och hämmare som en förutsättning för heparin som antikoagulant aktivitet. Heparin binder sig också till koagulation proteaser. Interaktioner mellan heparin och proteaser samt mellan polysackarider och antitrombin påskyndar hämning av enzymer. Heparin fungerar som en katalysator i antitrombin-proteas reaktion, dvs att det accelererar reaktionen i en icke stökiometriska mängder och inte förbrukas under reaktionen. Denna förmåga kan förklaras av heparin som släppts från antitrombin-proteas komplex för förnyade bindning till antitrombin, när komplexet har bildats (Lindahl, Lindahl. 1984). 10

Referens: B. Lindahl, U. Lindahl. Mechanism of the anticoagulant action of heparin. Molecular and cellular Biochemistry, 1984. 48, 161-182. Galeotti F., Volpi N. 2011. Online Reverse Phase-High-Performance Liquid Chromatography- Fluorescence Detection-Electrospray Ionization- Mass Spectrometry Separation and characterization of Heparin Sulphate, Heparin, and Low Molecular Weight-Heparin Disaccharides Derivatized with 2-Aminoacridone. American chemical society; 83: 6770-6777. Korir A.K., Larive C.K. 2009. Advances in the separation, sensitive detection, and characterization of heparin and heparan sulphate. Anal Bioanal Chem; 393:155-169. Wardrop D., Keeling D. 2008. The story of the discovery of heparin and warfarin. British Journal of haematology; 141: 757-763. Mueller R.L, Scheidt S. History of drugs for thrombotic disease. Discovery, development, and directions for the future. 1994. American Heart Association; vol 89: 432-449. Messmore H.L, Wehrmacher W.H, Coyne Erwin, and Fareed J. heparin to pentasaccharide and Beyond: The end is not in sight.2004. vol 30: 81-88 Marcum J.A. The origin of the dispute over the discovery of heparin. 2000. Journal of the History of medicine; vol 55: 37-66 Jorpes, E. 1935. The Chemstry of heparin. Chemstry department of the caroline Institute, Stockholm; and the insulin laboratory of the Vitrum company. Cragg, G. M. L., Kingston, D. and Newman, D. J. Anticancer agents from natural products; Taylor and Francis: USA 2005. Mclean J. The discovery of heparin.1959. American Heart Association. 19, 75-78 Läkemedelsboken, Apoteket AB, Stockholm. 2009-2010. Samuelsson G. drugs of natural origin. A textbook of pharmacognosy, 5th edition. Stockholm, 2004 www.fass.se Hämtat 2011.09.20. http://www.oralchelation.net/heartdisease/chaptereight/page8b.htm. Hämtat 2011.9.20 http://en.wikipedia.org/wiki/heparin 11