En genetisk studie av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 hos personer med kärlinflammationer och höga halter immunkomplex H E B A C H A R A N E K

En genetisk studie av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 hos personer med kärlinflammationer och höga halter immunkomplex H E B A C H A R A N E K Examensarbete Stockholm, Sverige 2006

En genetisk studie av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 hos personer med kärlinflammationer och höga halter immunkomplex H E B A C H A R A N E K Examensarbete i biomedicinsk teknik om 20 poäng vid Programmet för datateknik Kungliga Tekniska Högskolan år 2006 Handledare på CSC var Jeanette Hellgren Kotaleski Examinator var Anders Lansner TRITA-CSC-E 2006:101 ISRN-KTH/CSC/E--06/101--SE ISSN-1653-5715 Kungliga tekniska högskolan Skolan för datavetenskap och kommunikation KTH CSC 100 44 Stockholm URL: www.csc.kth.se

En genetisk studie av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4, hos personer med kärlinflammationer och höga halter immunkomplex. Sammanfattning Åderförkalkning och dess komplikationer är den dominerande orsaken till sjukdom, lidande och död i västvärlden. Det finns nu många indikationer på att inte bara traditionella riskfaktorer såsom rökning och fetma bidrar till utvecklingen av kärlinflammationer utan även immunologiska mekanismer spelar en stor roll för utvecklandet av kärlskadan. Cirkulerande immunkomplex (CIC) är en stark prediktor för att utveckla åderförkalkning. Då ett immunkomplex (IC) fäster vid kärlväggen interagerar immunsystemets celler med cellerna i kärlväggen och avger bl.a. proinflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta. Vissa genetiska varianter av cytokinerna medför högre sekretion av dessa. Vid åderförkalkning vet man att TNF-alfa och IL-1-beta har stor betydelse för att mediera inflammation i kärlväggen. Polymorfismen i cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta samt receptorn CTLA-4 har visat sig vara kopplat till vissa sjukdomar såsom t.ex. muskelsjukdomen Myastenia Gravis (MG). Syftet med denna rapport har varit att vidare undersöka om polymorfismen i cytokinerna samt receptorn har någon association till kärlinflammationer och förekomsten av IC. Undersökningen är gjord på genomiskt DNA av 72 patienter med kärlinflammationer och höga halter IC. Polymorfismen som studerats är IL-1-beta RFLP TaqI, TNF-alfa 308 och CTLA-4 318. Detta gjordes genom amplifiering av de aktuella DNA-sekvenserna med PCR (Polymeras Kedje Reaktion). PCR-fragmenten analyserades sedan med hjälp av gel elektrofores efter klyvning med restriktionsenzymer. Analyserna av A/G-polymorfismen hos TNF-alfa gav väntade resultat. Den ovanliga A-allelen hos friska personer som är förknippad med hög TNF-alfa sekretion förekom i ökad prevalens hos patientgruppen. Även analyser hos IL-1-beta gav väntade resultat där den ovanliga A2- allelen som är förknippad med hög IL-1-beta sekretion förekom i ökad prevalens hos patientgruppen. Det förekommer alltså polymorfier i TNF-alfa och IL-1-beta generna som bidrar till denna höga sekretion och därmed utvecklingen av kärlinflammationer. Från CTLA-4 analyserna däremot kunde jag inte se någon signifikant skillnad av allel/genotyp frekvenser hos sjuka och friska personer och kan således inte förknippa polymorfismen i denna gen med utvecklingen av kärlinflammationer och förekomsten av höga halter IC.

A genetic study of TNF-alfa, IL-1-beta and CTLA- 4, in people with vascular inflammations and high concentrations of immune complexes. Abstract Atherosclerosis and its complications is the dominant cause of diseases, suffering and death in the Westernized countries. There are now many indications that not only traditional risk factors as smoking and corpulence contribute to the development of vascular inflammations but also immune mechanisms play a big role for the development of the vascular lesion. Circulating immune complexes (CIC) is a big predictor of developing atherosclerosis. When an immune complex (IC) attaches the vessel wall the cells of the immune systems will interact with the cells in the vessel wall and proinflammatory cytokines will be released. Some genetic variants of the cytokines are associated with higher secretions of those. Its known that TNF-alfa and IL-1-beta plays a big role in mediating inflammation in the vessel wall. Polymorphisms in some cytokines, for instance TNF-alfa and IL-1-beta and also in the receptor CTLA-4, have been shown to be connected with diseases as for example myasthenia gravis (MG). The aim of this project was to further investigate whether the polymorphism of these cytokines and the receptor is associated with vascular inflammations and occurrences of IC. The investigation was performed on genomic DNA from 72 patients with vascular inflammation and high IC concentrations. The polymorphism studied was IL-1-beta RFLP TaqI, TNF-alfa 308 and CTLA-4 318. This was done by amplification of DNA-sequences with PCR (Polymerase Chain Reaction). The PCR-fragment were then analyzed using gel electrophoresis after digestion with restriction enzymes. The results of the analysis of the A/G polymorphism in TNF-alfa were as expected. The rare A- allele in healthy individuals, which is associated with high TNF-alfa secretion, appeared in higher prevalence in the patient group. Even analysis of IL-1-beta gave expected results where the rare A2-allele, which is associated with high IL-1-beta secretion, appeared in higher prevalence in the patient group. That indicates that there are polymorphisms in the TNF-alfa and IL-1-beta genes that contribute to those higher secretions and also the development of vascular inflammations. From the CTLA-4 analysis I couldn t see any significant difference of the allele/genotype frequencies between sick and healthy individuals. Therefore there is no correlation between the polymorphism of this gene and the development of vascular inflammations and high IC concentrations.

Förord Jag avslutade mina två sista år på KTH med att läsa kurser i biomedicinsk teknik. De flesta kurser gavs på Karolinska Institutet. I samband med medicin kurserna blev jag alltmer intresserad av hur människokroppen fungerar. Att göra examensarbetet på Karolinska sjukhuset gav mig möjligheten att fördjupa mina medicinkunskaper och därmed kombinera för mig två intressanta områden, datateknik och medicin. Efter att ha tagit kontakt med professor Ann Kari Lefvert som forskar om autoimmuna sjukdomar i centrum för Molekylär Medicin vid Karolinska sjukhuset, erbjöds jag att studera och skriva om huruvida polymorfismen hos TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 generna har någon inverkan på utvecklingen av kärlinflammationer och höga halter IC. Detta arbete har utgjort en del av flera tidigare undersökningar av samma gener men hos andra grupper av patienter. Jag vill rikta ett stort tack till professor Ann kari Lefvert som varit min uppdragsgivare för detta projekt och som under arbetets gång varit ett stort stöd samt bidragit med intressanta och lärogivande diskussioner. Jag vill även tacka forskarstuderande Xiaoyan Zhao för smarta råd under laborationsarbetet. Vidare vill jag tacka forskarstuderande Maria Kakoulidou för goda kommentarer under rapportskrivningen.

Innehållsförteckning 1 Introduktion... 1 2 Bakgrund... 3 2.1 Åderförkalkning och cirkulerande immunkomplex (CIC)... 3 2.2 Sjukdomar orsakade av immunkomplex... 3 3 Teori... 4 3.1 Immunsystemet... 4 3.1.1 Komplementsystemet... 4 3.1.2 Fagocytos... 4 3.1.3 Komplementsystemet och CIC... 5 3.1.4 Cytokiner... 5 3.1.5 IC och inflammation... 5 3.2 Genetik... 6 3.2.1 DNA-molekylen... 6 3.2.2 RFLP och SNP... 6 3.2.3 Genetiska begrepp... 6 3.2.4 Polymorfism... 7 3.2.5 Kromosomstrukturen... 7 3.2.6 MHC-gener och HLA-komplex... 8 4 Material och metoder... 9 4.1 PCR Polymeras Chain Reaction... 9 4.2 Gel Elektrofores... 11 4.3 Klyvning med restriktionsenzymer... 12 4.4 Utförande... 12 4.4.1 TNF-α 308 (G A)... 13 4.4.2 IL-1β RFLP TaqI... 13 4.4.3 CTLA-4 318 (C T)... 13 4.5 Statistiska analyser... 13 5 Resultat... 15 5.1 RFLP och SNP analyser... 15 5.1.1 TNF-α 308 (G A)... 15 5.1.2 IL-1β RFLP TaqI... 16 5.1.3 CTLA-4 318 (C T)... 18 6 Diskussion... 20 Referenser... 21

1 Introduktion Åderförkalkning, ateroskleros och dess komplikationer är den dominerande orsaken till sjukdom, lidande och död i västvärlden. Det finns nu många indikationer på att immunologiska mekanismer spelar en stor roll för utvecklandet av kärlskadan. En studie som gjorts visar att förekomsten av cirkulerande immunkomplex, CIC, är en stark prediktor för att utveckla åderförkalkning och dess komplikation hjärtinfarkt [9]. Vid åderförkalkning inflammeras artärernas väggar, kärlets celler prolifererar och så småningom inlagras kalk i kärlväggen. Artärväggarna minskar i diameter, vilket leder till ett reducerat blodflöde och därmed mindre syretillförsel. Vid minskad syretillförsel till hjärtmuskeln och hjärnan kan en hjärtattack respektive slaganfall inträffa. En aktiv immunreaktion med ökad förekomst av immunologiskt aktiva celler och antikroppar kan påvisas i den skadade kärlväggen vid ateroskleros. Orsaken till denna immunreaktion är inte fullständigt känd. Flera olika ämnen har föreslagits kunna ligga bakom. Ämnen som inflammatoriska cytokiner, TNF-alfa och IL-1-beta har stor betydelse[9]. Då ett IC fäster vid kärlväggen interagerar immunsystemets celler med cellerna i kärlväggen och avger bl.a. pro-inflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta. TNF-alfa och IL-1- beta är ämnen som är viktiga vid inflammationer och som aktiverar T-celler, som i sin tur aktiverar B-celler, vilka producerar antikroppar. Normalt råder balans mellan proinflammatoriska och anti-inflammatoriska cytokiner. Vissa genetiska varianter av proinflammatoriska cytokiner medför högre sekretion av dessa. Vid åderförkalkning vet man att TNF-alfa och IL-1-beta har stor betydelse för att mediera inflammation i kärlväggen [10]. Andra faktorer än cytokiner är viktiga för immunsystemet och ett sådant är den cytotoxiska T- lymfocyt associerade receptorn 4 (CTLA-4). Denna receptor uttrycks på aktiverade T-celler och är en hämmare av T-cellsaktivering. CTLA-4 fungerar nedreglerande på immunförsvaret, genom att T-cellernas aktivering hindras och även genom att färre antikroppar produceras. Ökad funktion av CTLA-4 fungerar antiinflammatoriskt [11]. Man har inga teorier om huruvida CTLA-4 bidrar till utvecklingen av kärlinflammationer och förekomsten av immunkomplex, IC. Det enda jag utgår ifrån vid undersökningen av denna receptor är att det i en studie gjord på Myastenia Gravis (en sjukdom som yttrar sig i svår muskelsvaghet där överföringen av nervimpulser till muskulaturen påverkas) patienter förekom genetiska varianter av CTLA-4 som minskar dess funktion, vilket innebär en bristande hämning av T-cellsaktiveringen och därmed ett mera aktivt immunsvar. Dessa varianter av CTLA-4 fungerar proinflammatoriskt [11]. Syftet med denna rapport är att undersöka om polymorfier i generna för TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 är associerade till kärlinflammationer och förekomsten av IC. Dessa polymorfier ger upphov till s.k. RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) hos IL-1-beta och SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) hos TNF-alfa och CTLA-4. Genom att använda PCR (Polymeras Chain Reaction) har jag analyserat dessa RFLPs och SNPs för att se om det förekommer specifika genetiska varianter av TNF-alfa och IL-1-beta hos personer med kärlinflammationer som kan vara den bakomliggande orsaken till den höga sekretionen. En förhoppning är att man på sikt ska kunna utveckla läkemedel som riktar sig till att normalisera mängden cytokiner och därmed minska inflammationen. Genom analys av den SNP som finns i CTLA-4 genen undersöker jag om det förekommer en övervikt av varianter för CTLA-4 som minskar dess funktion. Tidigare har studier av TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 gjorts för patienter med andra sjukdomar där immunmekanismer och cytokinerna spelar roll [2]. Exempel är sjukdomar som Myastenia Gravis och Reumatoid Artrit (en sjukdom som kännetecknas av kronisk ledinflammation). Här har man funnit genetiska varianter av cytokinerna som medför hög sekretion av dessa. Hos CTLA-4 har man funnit varianter som minskar dess funktion. 1

TNF-alfa genen innehåller en SNP på plats 308 i promotor regionen, som är associerad med hög eller låg sekretion av detta cytokin. Genen finns inom klass III-regionen hos MHC på kromosom 6. Denna SNP består av en A/G polymorfism där förekomsten av den ovanliga A- allelen istället för G-allelen, är associerad med högre sekretion av TNF-alfa. Detta har visats bl.a. hos patienter med Myastenia Gravis [2]. Jag kommer nu att undersöka om denna allel även förekommer i hög grad hos personer med kärlinflammationer och IC. Detta kommer sedan att jämföras med friska personer. Jag kommer även att studera genotypfrekvenserna och jämföra dessa med friska personer. IL-1-beta genen finns på kromosom 2. Hos IL-1-beta genen har man funnit många polymorfier som har associerats med högre sekretion av detta cytokin. En polymorfi i exon 5, en TaqI RFLP är av stort intresse. A2-allelen är associerad med högre produktion av IL-1-beta, vilket har visats i en studie som gjorts på Myastenia Gravis patienter [5]. På plats 318 i promotor regionen av CTLA-4 genen på kromosom 2 finns en SNP. Hos denna C/T polymorfism är förekomsten av T-allelen associerad med ökad transkription och därmed ökat uttryck av CTLA-4. C-allelen däremot har varit förknippad med minskad funktion av CTLA-4 [11]. 2

2 Bakgrund 2.1 Åderförkalkning och cirkulerande immunkomplex (CIC) Åderförkalkning är den vanliga orsaken till hjärtkärlsjukdomar som hjärtinfarkt och slaganfall (stroke). Dessa sjukdomar utgör den största gruppen dödliga sjukdomar i vårt land och svarar för bortåt hälften av alla dödsfall. Traditionella riskfaktorer är rökning och fetma. Immunsystemet spelar också stor roll vid utveckling av åderförkalkning. Skadan på kärlen kännetecknas av inflammation och av närvaro av immunsystemets celler. CIC har en kraftig kärlskadande effekt [12]. Normalt elimineras immunkomplex (IC) snabbt med hjälp av komplementsystemet. Konstant och hög förekomst av CIC är alltid patologiskt. IC som inte elimineras på normalt sätt kan bindas till kärlväggens endotelceller och aktivera komplement. Pro-inflammatoriska cytokiner TNF-alfa och IL-1-beta frisätts. Konsekvensen blir en inflammatorisk kärlskada [12]. 2.2 Sjukdomar orsakade av immunkomplex IC bildas normalt om kroppen utsätts för ett kroppsfrämmande antigen. Komplexet består av ett antal antigenmolekyler som bundits till en antikropp. Vissa antikroppar kan binda många antigenmolekyler, vilket kan leda till att komplexen kan bli mycket stora. Bildningen av IC underlättar fagocytos och är därmed ett sätt att oskadliggöra antigen. Konstant förekomst av CIC är dock patologiskt. Detta beror antingen på överproduktion av komplex eller på nedsatt nedbrytning. Nedsatt nedbrytning beror vanligen på ett defekt komplementsystem eller på ett för lågt antal komplementreceptorer. Dessa receptorer binder normalt komplementfaktorer plus komplex och transporterar detta till ställen i kroppen där komplexen förstörs genom fagocytos. IC som inte fagocyteras på normalt sätt binds till kärlväggarnas endotelceller där de aktiverar komplement. Pro-inflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta genereras [3]. 3

3 Teori Här behandlas bakomliggande teori om immunsystemet för att ge en förståelse av kopplingen mellan IC och proinflammatoriska cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta samt den del av genetiken som är intressant i detta projekt. 3.1 Immunsystemet Främmande ämnen, som bakterier och virus, försöker ständigt att tränga in i människans kropp. Kroppens immunförsvar hindrar sådana organismer från att etablera sig. Immunförsvarets celler finns i alla vävnader i kroppen och det tar därför aldrig lång tid innan ett främmande ämne möter immunsystemets celler. Antikroppar produceras av B-celler som aktiveras av T-celler. Då ett främmande ämne, s.k. antigen, interagerar med en antikropp bildas ett antigen-antikropp komplex, ett s.k. immunkomplex, IC. Bildandet av ett IC utgör en effektiv mekanism i immunförsvaret för att eliminera antigenet. 3.1.1 Komplementsystemet Främmande ämnen förintas av en grupp serumproteiner, kallade komplementfaktorer, som startar en kaskadreaktion då en komplementfaktor aktiverats. Det finns två olika reaktionskedjor som kan aktivera komplementsystemet. De kallas den klassiska respektive alternativa vägen. Bägge leder till att en komponent i komplementsystemet som heter C3b binder till ytan på det som aktiverat komplementsystemet. IC och bakterier som bundit C3b äts mycket lättare upp av olika fagocyter eftersom dessa har receptorer som kan binda till C3b. Den klassiska vägen för komplementaktivering startas framför allt av IC. Komplementfaktorn C1 binder normalt till en inhibitor C1i. Då IC dyker upp i närheten släpper C1 sin inhibitor och binder istället till Fc-delen av antikroppar i immunkomplexet. Proteaser aktiveras som börjar klyva varandra och så småningom aktiveras nästa komplementfaktor i kaskaden, nämligen C4. Då bildas C4a och C4b. C4b binder till nästa komplementfaktor, kallad C2. Proteasen C4b-C2 bildas, som klyver C3 i dels C3a och C3b. Om C3b binder till ett cellmembran kommer ytterligare en väg, den lytiska vägen, att aktiveras. Den börjar med att ytterligare en komponent, C5, binder till C3b på cellytan. C5 klyvs i C5a, som lämnar cellytan, och C5b som sitter kvar. Komplementsystemet fortsätter i att flera komplementproteiner (C6-C9) aktiveras och klyvs i olika fragment. Under dessa reaktioner har ett antal komplementproteiner, C4a, C3a och C5a frisatts. Dessa utgör signalämnen som sänder olika meddelanden till omgivningarna. Exempelvis signalerar C5a och C3a till neutrofiler och makrofager att växa samman med kärlendotelceller och vandra till ställen i vävnader där komplementaktivering förekommer (s.k. kemotaxis). Detta spelar en stor roll vid inflammationer[3]. 3.1.2 Fagocytos En grupp vita blodkroppar, fagocyter, bryter ned ett främmande ämne som bundit till antikroppar genom att först innesluta hela komplexet i sig själv. Processen kallas fagocytos. Till fagocyter räknas makrofager, monocyter, neotrofiler och eosinofiler. Fagocyter har dels Fcreceptorer på sin yta som känner igen konstanta delen av antikroppen IgG och dels komplementreceptorer som känner igen C3b-fragmenten på antigen. Komplementreceptorer märker in bakterier och andra antigen som aldrig bundits till antikroppar med C3b-fragment. Bakterier kommer på så sätt att brytas ned lättare av fagocyter eftersom dessa har receptorer som känner igen C3b[3]. 4

3.1.3 Komplementsystemet och CIC Att ett IC triggar komplementsystemet är nödvändigt för att hålla kroppsvätskorna fria från CIC. Fagocytosen underlättas genom att C3b-fragment binder till ytan av IC. Detta förhindrar IC att deponeras i vävnader och således förhindra att immunkomplexen binds till kärlväggarnas endotelceller för att så småningom orsaka inflammation. Immunkomplexmedierad aktivering av komplementsystemet kan dock vara skadligt. Under komplementsystemets kaskad av reaktioner bildas klyvningsprodukterna C3a, C4a och C5a, s.k. anaphylatoxiner, som kan agera som inflammatoriska mediatorer [3]. Den effektiva elimineringen av CIC är beroende av att den klassiska vägen i komplementsystemet fungerar intakt. Personer med totala eller partiella komplementdefekter är särskilt disponerade för immunkomplexbildning och immunkomplexmedierade sjukdomar p.g.a. att deras förmåga att eliminera IC är nedsatt [6]. 3.1.4 Cytokiner Cytokiner fungerar som budbärare mellan immunsystemets olika celler och signalerar till att sätta igång eller stoppa processer. Immunförsvaret bekämpar allt som uppfattas som främmande bland annat genom att utsöndra cytokiner. Vissa cytokiner är proinflammatoriska och kan ge upphov till kraftiga inflammationer som kan eliminera såväl bakterier som virus[3]. 3.1.5 IC och inflammation IC som inte fagocyteras på normalt sätt binds till kärlväggarnas endotelceller där de aktiverar komplementsystemet. Anaphylatoxinerna C3a, C4a och C5a genereras. C5a fungerar som kemotaxin genom att den får monocyter att vandra till det inflammerade området. Monocyterna stimuleras till att frisätta cytokinerna TNF-alfa och IL-1-beta. Dessa inducerar i sin tur frisättningen av adhesionsmolekyler, s.k. VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), som får monocyterna att fastna i endotelcellslagret. De ökar även invandringen av monocyter till det inflammerade området. Monocyterna penetrerar artärväggem och hamnar i intimat. Här omvandlas monocyterna till makrofager. Kolesterol inlagras i makrofagerna och man får skumceller. Skumcellerna kommer i sin tur frisätta ytterligare pro-inflammatoriska cytokiner som förstärker inflammationen genom ytterligare ackumulering av makrofager på inflammationssidan [10], se figur 1. Figur 1: Monocyternas väg till intimat. Här omvandlas monocyterna till makrofager och blir till skumceller som frisätter proinflammatoriska cytokiner[10]. 5

3.2 Genetik Alla levande organismer är uppbyggda av celler. Varje cell har en uppsättning arvsanlag. För att alla de komplicerade processer som sker i en levande varelse skall kunna utföras krävs ett stort antal olika proteiner med olika funktioner. För vart och ett av alla de proteiner som finns i en levande varelse finns en beskrivning som talar om hur proteinet ska se ut. Denna beskrivning anger sekvensen av aminosyror och kallas för våra arvsanlag. Dessa ligger lagrade i stora DNA-molekyler. 3.2.1 DNA-molekylen DNA-molekylen är uppbyggd av mindre byggstenar, deoxyribonukleotider, s.k. baser. Det finns fyra olika baser, adenin A, tymin T, guanin G och cytosin C. Det är sekvensen, ordningsföljden, av dessa baser som bestämmer den genetiska koden, som i sin tur styr bildandet av ett protein. A binder alltid till T medan G alltid binder till C. Denna bindning kallas basparning. DNAmolekylen är uppbyggd av två strängar i motsatt riktning (5 till 3 ) som är komplementära till varandra förutsatt att sekvensen av nukleotider är inverterad och reverserad i förhållande till varandra. Två komplementära DNA-strängar kan baspara: Exempelvis: 5 CATTCCGTC3 3 GTAAGGCAG5 Information i en sträng förutsäger information i den andra strängen. DNA-molekylen består av två kedjor hopvirade till en helixliknande struktur, där basparen ligger inne i helixens centrum[1], se figur 2. Figur 2: DNA-sträng [1]. 3.2.2 RFLP och SNP En SNP (Single Nucleotide Polymorphism) är en sekvensvariation i DNA-sekvensen som inträffar då endast en nukleotid (A, T, C eller G) i genomet alterneras. Vissa ärftliga sjukdomar förorsakas direkt av SNPs. De flesta SNPs utgör emellertid en normal variation mellan individer och är inte kopplade till någon speciell sjukdom. RFLP är en teknik som används till att analysera SNPs. Tekniken går ut på att man med Gel elektrofores analyserar restriktionsfragmenten som man fått vid klyvning av PCR-produkten med specifika restriktionsenzymer (För beskrivning av PCR och Gel elektrofores se kap 4.1 resp. 4.2). 3.2.3 Genetiska begrepp Varje egenskap hos en människa bestäms av ärftliga faktorer, s.k. gener. Gener är uppbyggda av DNA, deoxyribonukleinsyra. En bit av DNA-molekylen, som påverkar cellen genom att styra bildandet av ett protein, kallas en gen eller ett arvsanlag. I cellkärnan ligger generna på rad i 6

stavar, kromosomer. Varje kromosom består av en DNA-molekyl, formad som en dubbelspiral. Platsen på en kromosom där genen för ett visst protein finns kallas genens locus. När en gen i ett locus, som reglerar en egenskap, förekommer i olika varianter kallas dessa alleler. Hos varje individ kan det finnas två alleler av en gen, en från varje förälder. I ett allelpar med anlag för t.ex. svarta ögon, kan den ena allelen koda för svarta ögon och den andra för ickesvarta öga och man säger att individen är heterozygot för svarta ögon. En individ med två identiska alleler sägs vara homozygot. Att olika människor har olika ögonfärg beror på att de har olika beskrivningar av det protein som tillverkar ögonpigment. Att beskrivningen för ett och samma protein hos olika individer skiljer sig åt kallas polymorfism. Genotypen anger vilken kombination av alleler individen bär på. Ofta talar man om en individs genotyp med avseende på en viss gen [18]. 3.2.4 Polymorfism En polymorfi är nedärvd den kommer via mamman eller pappan, och förekommer ganska ofta i en population (i mer än 1 % av befolkningen). Någon gång för länge sen uppstod en mutation, och den har hängt kvar genom evolutionen. Antingen gör den ingen skillnad, förbättrar eller försämrar den för organismen. En polymorfi kan bidra till att organismen får en viss sjukdom om den förbättrar (man kan t ex tänka sig att ett överaktivt protein kan ge cancer) eller försämrar proteinets funktion väldigt mycket. Det är därför man tittar på polymorfier och ser om de är associerade till vissa sjukdomar. Många små ändringar i immunförsvaret kan leda till att personen får ett sämre immunförsvar och utvecklar då kanske åderförkalkning eller någon annan inflammatorisk sjukdom. 3.2.5 Kromosomstrukturen En kromosom är en lång tråd av DNA, i vilken hela eller delar av genomet finns. Människans genom innehåller ca 30 000 gener som är fördelade på 46 kromosomer. Kromosomerna hör ihop parvis, i 23 par, där man förenklat kan säga att ena hälften ärvts från modern och den andra från fadern. Varje kromosom består av specifika genuppsättningar med olika egenskaper. En specifik gen återfinns alltid på ett specifikt locus (plural loci) av en given kromosom. Så finns t.ex. TNFalfa genen på plats 308 i promotor regionen på kromosom 6. Man har två uppsättningar av en och samma gen, en ärvs från pappa och en från mamma. Detta beror på att vi har en diploid uppsättning av våra kromosomer. Detta gäller för alla celler utom spermier och ägg, där det bara finns en av varje kromosom. Alla individer bär i princip på samma uppsättning gener, men varje gen kan förekomma i flera varianter (alleler). Dessa varianter kan vara mer eller mindre funktionella och i vissa fall kan de ge upphov till sjukdom. En homozygot är en individ som har två identiska alleler och när allelerna skiljer sig åt är individen heterozygot [1], se figur 3. 7

Moder Fader Olika gener R r Alleler av samma gen A a B B Loci C c Heterozygota alleler d d Homozygota alleler Figur 3: Ett kromosompar med olika genuppsättningar. Varje genkopia utgör en allel. 3.2.6 MHC-gener och HLA-komplex En grupp av gener som är inblandade i immunförsvaret kallas MHC gener, Major Histocompatibility Complex genes. MHC proteinernas uppgift är att känna igen och binda främmande ämnen och aktivera vita blodkroppar som bekämpar dessa ämnen. MHC bestämmer delvis det immuna svaret till ett antigen och defekter i dessa gener spelar därmed en roll för utvecklingen av vissa sjukdomar. MHC är en samling gener ordnade i en lång rad i DNA:t på kromosom 6. MHC kallas även för Human Leucocyte Antigen (HLA). MHC molekylerna är organiserade i olika regioner som kodar för tre klasser av proteiner. Klass III MHC gener kodar för proteiner som har immuna funktioner, inkluderande komponenter från komplementsystemet (ex C4, C2) och molekyler som är involverade i inflammationer (TNFalfa) [7]. 8

4 Material och metoder Möjligheten att studera arvsmassan ökade drastiskt under slutet av 70-talet. Från att ha varit den svåraste cellulära molekylen att studera blev DNA nu den lättaste. Detta berodde på att nya molekylärbiologiska tekniker utvecklades i kombination med att datatekniken blev mer lättillgänglig för att hantera erhållna data. Man har med dessa tekniker uppskattat att den mänskliga arvsmassan består av ca 3 miljarder baspar och det humana genomet innehåller ca 30 000 gener. Den centrala dogman, DNA RNA PROTEIN, innebär att diagnostik på DNAnivå kan ge information om defekter på proteinnivå. De flesta nedärvda sjukdomar beror på en genetisk variant som ger upphov till en icke-funktionell genprodukt. För att studera polymorfier i generna används PCR och RFLP tekniker [15]. 4.1 PCR Polymeras Chain Reaction För att en speciell del av en DNA-molekyl ska bli analyserbar måste denna del mångfaldigas. Denna amplifiering av DNA-molekylen görs med en teknik kallad PCR, där DNA:t ökar exponentiellt. Polymeras kedjereaktion (PCR) är en metod som används till att isolera stora mängder av ett enda DNA-fragment. PCR uppfanns av Kary Mullins, 1998 [1]. Förutsatt att en sekvens av DNA-molekylen är känd kan man med PCR amplifiera denna molekyl. Antalet DNA-molekyler ökar exponentiellt dubbleras vid varje cykel detta leder till det faktum att en liten del av DNA ger en omfattande mängd DNA som ett resultat av PCR. Startmaterialet kan antingen utgöras av klonade DNA-fragment eller en blandning av DNAmolekyler till exempel i detta projekt har jag använt genomiskt DNA från mänskliga celler. Förutsatt att nukleotidsekvensen som omger det område man vill amplifiera är känd kan DNA:t amplifieras genom att DNA-primers designas så att DNA-syntesen startas vid önskad punkt. Primrarna som används utgörs ofta av kemiskt syntetiserade oligonukleotider som innehåller korta DNA strängar på 20-25 baspar, bp. Två primrar används, en från varje riktning. Dessa utgör startbitar i den DNA-sträng som amplifieras. PCR-reaktionen kan delas upp i tre steg: 1. Denaturering Här frigörs strängarna i DNA-molekylen från varandra i en temperatur på 94-95 C 2. Annealing Genom att sänka temperaturen till 54 58 C, kan primrarna fästa till var och en av de två DNA-strängarna. 3. Elongering DNA-syntes Två nya DNA-strängar syntetiseras vid en temperatur på 72 C genom att primrarna förlängs när nya nukleotider hakas på med hjälp av enzymet Taq polymeras. Nukleotiderna är komplementära mot mallsträngen, se figur 4. 9

Figur 4: Amplifiering av DNA med PCR[1]. Dessa tre steg motsvarar en cykel. Vid varje cykel syntetiseras två nya molekyler från en molekyl. De nya syntetiserade molekylerna utgör mallar för ytterligare DNA-syntes i nästa cykel. Därmed blir PCR en kedjereaktion. Det DNA-polymeras som används är ett enzym som är stabilt även vid höga temperaturer. Enzymet kommer från Thermus aquaticus (taq) bakterien. Om man vet hur sekvensen av en gen ser ut så att primrar kan bestämmas utgör PCR en kraftfull metod för att erhålla stora mängder DNA. Det amplifierade DNA:t synliggörs med hjälp av Gel elektrofores, se figur 5, för att sedan analyseras vidare med hjälp av RFLP teknik. 10

Figur 5: Amplifierade DNA-fragment av olika storlekar efter analysering med gel elektrofores[1]. 4.2 Gel Elektrofores Gel elektrofores är en metod som används för att separera DNA-molekylerna genom ett elektriskt fält. DNA-proverna laddas, i detta fall i en 3 % agaros gel som placerats i ett elektroforeskärl innehållande en elektrofores buffert. Efter att DNA pipetterats i små hål i gelen tillsammans med ett färgämne får en ström passera genom gelen. DNA som är negativt laddad rör sig mot den positiva polen, se figur 6. De små DNA-fragmenten rör sig snabbare genom gelen, till skillnad mot de större fragmenten. Figur 6: Gel elektroforeskärl [13]. För att kalibrera mätningen laddar man på en lämplig storleksmarkör ( stege ), i detta fall med band på mellan 100 och 200 baspar. Om DNA:t, efter visualisering med UV-ljus, framträder 11

som tydliga band, tyder detta på att PCR-reaktionen lyckats och DNA:t amplifierats, se figur 7. Då kan man gå vidare med klyvning av banden med specifika restriktionsenzymer. Figur 7: Exempel på DNA band efter lyckad PCR. 4.3 Klyvning med restriktionsenzymer Restriktionsenzymer (RE) är enzymer som känner igen och klyver specifika DNA-sekvenser. De kan renas fram från bakterier och olika enzymer känner igen olika sekvenser som är 4-8 bp långa. DNA:t delas upp i restriktionsfragment av olika storlekar, där antalet fragment beror på hur många gånger enzymet stöter på en sekvens den känner igen, för att sedan klyva. I detta projekt har jag använt RE för att studera varianter av en gen (alleler) vilka uttrycks som separerade DNA-fragment av olika storlekar hos olika individer (se resultatdelen). Att man får olika antal band av olika storlekar (genotyper) hos olika individer tyder på att generna hos TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4 skiljer sig åt från individ till individ, dvs. det förekommer polymorfier i dessa gener. Huruvida dessa genvarianter är kopplade till den sjukdom vi studerar analyseras sedan med hjälp av ett statistiskt program, Fisher s exact test (se 4.5). Antalet band, i vårat fall ett, två eller tre band, beror på om RE klipper eller inte och om individen är homozygot eller heterozygot. Ett band får man då RE aldrig hittar sin igenkänningssekvens och aldrig klipper. Individen i detta fall är homozygot. Två band får man då RE hittar sin igenkänningssekvens och klipper. Här är det också fråga om en individ som är homozygot. Tre band får man då individen är heterozygot och RE hittar sin igenkänningssekvens i endast ena uppsättningen (man har två uppsättningar av en och samma gen, se 3.2.5), vilket skapar två band. I den andra uppsättningen hittar RE aldrig sin sekvens och ursprungsbandet förblir intakt. Detta ger ytterligare ett band och totalt tre band. 4.4 Utförande Polymorfismerna som studerats var TNF-α 308, IL-1β RFLP TaqI och CTLA-4 318. Detta gjordes med hjälp av gel elektrofores efter klyvning av PCR-produkterna med specifika restriktionsenzymer. I undersökningen har jag använt genomiskt DNA, som jag extraherat från EDTA-blod (EDTA, Ethylene Diamine Tetra Acetic acid, är en kemikalie som är tillsatt till röret innan man tar blod i det, för att förhindra blodet att koagulera.) som tillhör 72 patienter med kärlinflammationer och höga halter IC. Extraktionen gjordes med Salting Out-metoden som är en metod där man isolerar DNA:t från blodceller. Man börjar med att lysera cellerna genom att tillsätta en buffert som får cellerna att spricka så att kärnorna klumpas ihop (DNA finns i cellkärnan). Med hjälp 12

av proteinas K bryter man ned och eliminerar proteiner. Efter borttagandet av proteinerna fäller man ut DNA:t med etanol och löser upp det igen i en buffert [16]. För alla tre generna valde jag ut lämpliga primrar som skulle ge mig lagom stora fragment att jobba med. Från TNF-α genen amplifierade jag en bit av promotorregionen på 107 bp. Från IL- 1β och CTLA-4 genen amplifierade jag bitar på 249 respektive 247 bp. Dessa delar innehåller de polymorfier som ska undersökas. Amplifieringen gjordes med PCR för att sedan klyvas med specifika restriktionsenzymer. Som slutresultat fås DNA-fragment av olika storlekar (genotyper) som framträder i form av ett eller flera band beroende på vilken variant de innehåller (se 4.3). 4.4.1 TNF-α 308 (G A) Oligonukleotiderna 5 AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT3 och 5 TCCTCCCTGCTCCGATTCCG3 (från Eurogentech) användes som primrar för amplifiering av promotorregionen som innehåller en SNP, en A/G polymorfism på plats 308. Amplifieringen startades med en denatureringstemperatur på 94 C under 10 minuter följt av 40 cykler, där varje cykel bestod av en denaturering på 94 C under 45 sek, annealing på 58 C under 45 sek, elongering på 72 C under 45 sek följt av en slutlig elongering på 72 C under 10 minuter. Klyvning av de amplifierade produkterna utfördes med restriktionsenzymet NcoI vid en inkubationstemperatur på 37 C under 2 timmar. De klyvda PCR-produkterna på 107 bp gav två fragment på 87 och 20 bp (G) eller förblev intakta (A) efter att ha laddats i en 3 % agaros gel (se resultatdelen). 4.4.2 IL-1β RFLP TaqI Oligonukleotiderna 5 GTTGTCATCAGACTTTGACC3 och 5 TTCAGTTCATATGGACCAGA3 användes som primrar för amplifiering av den del av IL- 1β som innehåller en TaqI polymorfism i exon 5. Amplifieringen startades med en denaturering på 94 C under 90 sek, annealing på 54 C under 90 sek samt en elongering på 72 C under 60 sek i tre cykler. Programmet gick sedan över i en 35 cykel period bestående av en denaturering på 97 C under 30 sek, annealing på 54 C under 30 sek samt en elongering på 72 C under 30 sek. Programmet avslutades med en elongering på 72 C under 10 minuter. Klyvning av de amplifierade produkterna utfördes med restriktionsenzymet TaqI vid en inkubationstemperatur på 65 C under 2 timmar. De klyvda PCR-produkterna på 249 bp gav två fragment på 135 och 114 bp (A1) eller förblev intakta (A2) efter att ha laddats i en 3 % agaros gel (se resultatdelen). 4.4.3 CTLA-4 318 (C T) Oligonukleotiderna 5 AAATGAATTGGACTGGATGGT3 och 5 AATGCTCTTTCCTTCGGCAC3 användes som primrar för amplifiering av promotorregionen som innehåller en SNP, en C/T polymorfism på plats -318. Amplifieringen startades med en denatureringstemperatur på 94 C under 10 minuter följt av 44 cykler, där varje cykel bestod av en denaturering på 94 C under 36 sek, annealing på 55 C under 36 sek, elongering på 72 C under 36 sek följt av en slutlig elongering på 72 C under 10 minuter. Klyvning av de amplifierade produkterna utfördes med restriktionsenzymet MseI vid en inkubationstemperatur på 37 C under 2 timmar. De klyvda PCR-produkterna på 247 bp gav två fragment på 21 och 226 bp (C) eller 21, 107 och 119 bp (T) efter att ha laddats i en 3 % agaros gel (se resultatdelen). 4.5 Statistiska analyser Jag har jämfört allel och genotyp frekvenser av de tre generna mellan patienter och friska personer. Detta gjordes med Fisher s exact test, som är ett statistiskt program där man använder 13

data ur en 2x2 tabell, dvs. en tabell med två rader, som motsvarar två olika grupper i mitt fall den sjuka (IC) och den friska gruppen (HC) och två kolumner som motsvarar de två olika allelerna/genotyperna. Allel/genotyp 1 är den allel/genotyp man antar är förknippad med sjukdomen och allel/genotyp 2 är den allel/genotyp man inte förknippar med sjukdomen, se figur 8. Grupp 1 (IC) Grupp 2 (HC) Allel/gen otyp 1 A C Allel/geno typ 2 B D Figur 8. Exempel på en 2x2 tabell. Fisher s exact test ger bl.a. ut parametrar som Odds Ratio, OR och P-värden. P-värdet anger signifikantgraden, dvs. hur signifikant resultatet är. Om man antar att det inte finns någon skillnad alls mellan patientgruppen (IC) och den friska gruppen (HC) av allel/genotyp frekvens skulle man få ett P-värde på 1.0. Ju större skillnad det är mellan grupperna desto lägre P-värde. Om P<0.05 är resultatet signifikant. Ju lägre P-värdet är desto mer signifikant. OR är en faktor som beskriver hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen jämfört med genomsnittspersonen förutsatt att resultatet är signifikant. Den räknas ut med följande formel: OR=(A/B)/(C/D). Då OR=1 finns det ingen skillnad mellan grupperna vad gäller risken att utveckla sjukdomen med viss allel/genotyp. Om OR däremot har ett värde nära 0 eller oändligheten finns det minskad respektive ökad risk att utveckla sjukdomen. Då OR>1, har grupp 1 en större andel av allel/genotyp 1 än grupp 2, där grupp 1 motsvarar den sjuka gruppen som är bärare av allel/genotyp 1 och grupp 2 den friska gruppen som är bärare av samma allel/genotyp. Ju större OR är desto större är risken att man utvecklar sjukdomen. Om däremot grupp 2 har den största andelen av allel/genotyp 1 är OR<1. I figur 9 visas ett exempel på en uträkning av OR. A G IC 54 90 HC 26 174 Figur 9. Exempel på en uträkning. Detta ger en OR på 4,015. Eftersom OR>1 kan vi dra slutsatsen att grupp 1, dvs. den sjuka gruppen (IC) med A allel har större andel av denna allel (54) och utgör därmed den riskdrabbade gruppen. Eftersom man har ett 95 % konfidensintervall på OR så vet man att det är sannolikare att få sjukdomen, men man vet inte om det är just 4,015 ggr så stor risk egentligen. Personer som är bärare av A allelen har alltså ca 4 ggr så stor risk (med 95 % säkerhet) att utveckla sjukdomen jämfört med den sjuka gruppen som inte är bärare av denna allel. 14

5 Resultat 5.1 RFLP och SNP analyser PCR-amplifiering användes på DNA från totalt 72 patienter med kärlinflammationer och IC förekomst. RFLP analyser av IL-1-beta genen samt SNP analyser av TNF-alfa och CTLA-4 generna genomfördes genom att köra klyvningsprodukterna på gel elektrofores. 5.1.1 TNF-α 308 (G A) Gel elektrofores kördes efter klyvning med NcoI av PCR fragment som innehöll en SNP 308. Klyvningen med NcoI (som endast känner igen GC-sekvensen) gav antingen två fragment på 87 och 20 bp (GG), tre fragment på 107, 87 och 20 bp (AG) eller förblev intakta (AA), 107 bp, se figur 10. M 1 2 3 4 5 Figur 10. Exempel på genotyper efter SNP analyser av TNF-alfa hos 5 patienter. M visar en stege på 100 bp. Kolumn 1, 3 och 4 visar prover homozygota för G (GG) som syns som två band på 87 och 20 bp (bandet på 20 bp syns inte). Kolumn 2 visar ett prov homozygot för A (AA) som syns som 1 band på 107 bp. Kolumn 5 visar ett heterozygot prov AG, där alla tre band är synliga. Det nedersta bandet är på 107 bp och det övre på 87 bp. Det minsta bandet på 20 bp är för litet att se. Nedan visas resultaten av SNP analyserna av TNF-alfa för alla 72 patienter sammanställda i en tabell efter statistiska analyser, se tabell 1. 15

Tabell 1.Genotyp fördelningar och allel frekvenser för TNFα 308 hos patienter (IC) och friska personer(hc). Genotyp IC n=72 HC n=100 OR P-värde GG 27 (38 %) 76 (76 %) 0,1895 <0,0001 AG 36 (50 %) 22 (22 %) 3,5455 0,0002 AA 9 (12 %) 2 (2 %) 7,0000 0,0088 Allel G 90 (63 %) 174 (87 %) 0,2241 <0,0001 A 54 (37 %) 26 (13 %) 4,015 <0,0001 OR= hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen. P-värdet anger signifikantgraden. De låga P-värdena indikerar att resultatet är signifikant. Av tabellen framgår att den vanliga GG-genotypen hos den friska gruppen (HC) förekommer i minskad grad hos den sjuka gruppen (IC). I en studie gjord på MG patienter fanns även här en mindre förekomst av GG-genotyp hos den sjuka gruppen. Av OR kan vi se att risken att man med denna genotyp utvecklar sjukdomen är liten (OR=0,1895). Vidare visas att AA- samt AG-genotyper är vanligare bland patientgruppen än bland friska. De höga OR värdena för dessa två genotyper visar att risken att man med dessa genotyper utvecklar sjukdomen är stor. Den vanliga G-allelen hos friska personer är mera ovanligt förekommande hos patientgruppen. Detta har även visats i en tidigare studie som gjorts på RA patienter[8]. Tabellen visar även att den ovanliga A-allelen är mindre förekommande hos friska personer, medan den förekommer i högre prevalens hos IC gruppen. Även i MG studien uppvisades en ökad frekvens av A-allelen bland sjuka [2]. Av OR kan vi se att personer med A-allelen utgör den riskdrabbade gruppen. 5.1.2 IL-1β RFLP TaqI Gel elektrofores kördes efter klyvning med TaqI av PCR-fragmenten. Klyvningen av det 249 bp långa fragmentet gav antingen tre fragment på 114, 135 och 249 bp (A1A2), två fragment på 114 och 135 bp (A1A1) eller förblev intakta (A2A2), 249 bp, se figur 11. 16

M 1 2 3 4 5 6 7 Figur 11. Exempel på genotyper efter RFLP analyser av IL-1-beta hos 7 patienter. M visar en stege på 100 bp. Kolumn 1 visar ett prov homozygot för A2 (A2A2) som syns som ett band på 249 bp. Kolumn 2-6 visar heterozygota prover (A1A2) där alla tre band är synliga. Kolumn 7 visar ett prov homozygot för A1 (A1A1) som framträder som två band på 114 och 135 bp. Det nedersta bandet är på 249 bp, mellersta på 135 bp och det övre på 114 bp. Nedan visas resultaten av RFLP analyserna av IL-1-beta för alla 72 patienter sammanställda i en tabell efter statistiska analyser, se tabell 2. Tabell 2. Genotyp fördelningar och allel frekvenser för IL-1β RFLP TaqI hos patienter (IC) och friska personer(hc). Genotyp IC n=72 HC n=100 OR P-värde A1A1 8 (11 %) 65 (65 %) 0,0673 <0,0001 A2A1 49 (68 %) 32 (32 %) 4,5272 <0,0001 A2A2 15 (21 %) 3 (3 %) 8,5088 0,0002 Allel A1 65 (45 %) 162 (81 %) 0,1930 <0,0001 A2 79 (55 %) 38 (19 %) 5,181 <0,0001 OR= hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen. P-värdet anger signifikantgraden. Även här har jag fått mycket signifikanta resultat (låga P-värden). Den vanliga A1A1-genotypen hos friska personer förekommer i mycket låg grad hos patienterna (65 respektive 11 %), medan A2A1- samt A2A2-genotyper förekommer i större grad bland sjuka. Vidare kan vi se av OR att patienter med A2A1- och A2A2-genotyper har betydligt större risk att drabbas av sjukdomen än patienter med A1A1-genotyp (OR=4,5272 och 8,5088 respektive 0,0673). Även allel frekvensen visar att A2-allelen är vanligare hos sjuka än hos friska. Av OR kan vi se att personer med A2-allel utgör den riskdrabbade gruppen. 17

5.1.3 CTLA-4 318 (C T) Gel elektrofores kördes efter klyvning med MseI av PCR-fragmenten. Klyvningen med MseI (som endast känner igen AT-sekvensen) gav tre fragment på 107, 119 och 226 bp (CT), två fragment på 119 och 226 bp (TT) eller förblev intakt (CC), 226 bp, se figur 12. M 1 2 3 M 4 5 6 Figur 12. Exempel på genotyper efter SNP analyser av CTLA-4 hos 6 patienter. Båda M:en visar stegar på 100 bp. Kolumn 1,3,4 och 5 visar prover homozygota för C (CC) som syns som ett band på 226 bp. Kolumn 2 visar ett heterozygot prov (CT) där alla tre band är synliga. Kolumn 6 visar ett prov homozygot för T (TT) där två band på 107 och 119 bp är synliga. Det nedersta bandet är på 226 bp, det mellersta på 119 bp och det övre på 107 bp. Nedan visas resultaten av SNP analyserna av CTLA-4 för alla 72 patienter sammanställda i en tabell efter statistiska analyser, se tabell 3. Tabell 3. Genotyp fördelningar och allel frekvenser för CTLA-4 318 (C T) hos patienter (IC) och friska personer(hc). Genotyp IC n=72 HC n=100 OR P-värde CC 58 (80 %) 86 (86 %) 0,6744 0,4040 CT 12 (17 %) 14 (14 %) 1,2286 0,6698 TT 2 (3 %) 0 (0 %) 7,1277 0,1738 Allel C 128 (89%) 186 (93 %) 0,6022 0.2447 T 16 (11 %) 14 (7 %) 1,6610 0.2447 OR= hur många ggr större/mindre chansen är att man råkar ut för sjukdomen. P-värdet anger signifikantgraden. Här har jag inte fått några signifikanta resultat alls, vilket vi kan se av våra höga P-värden. Exempelvis kan vi se att OR för TT-genotyp är så hög som 7,1277 trots att denna genotyp inte är förknippad med sjukdomen. Detta kan förklaras med att för TT genotyp har vi haft alldeles 18

för få personer att föra statistik på, 2 respektive 0 personer. För T-allel är det nästan lika många i den sjuka gruppen som i den friska (16 respektive 14). Det är alltså inte så stor skillnad mellan grupperna, därmed mina höga P-värden och osignifikanta resultat. Det förekommer alltså inte någon signifikant association mellan någon genotyp/allel i CTLA-4 genen och sjukdomen. Polymorfismen i CTLA-4 påverkar således inte utvecklingen av kärlinflammationer med IC förekomst. 19

6 Diskussion Balansen mellan pro-inflammatoriska och anti-inflammatoriska cytokiner är viktiga för utvecklingen av kärlinflammationer. Högre koncentration av pro-inflammatoriska cytokiner, såsom IL-1-beta och TNF-alfa skadar blodkärlen och omgivande vävnad [5]. Cytokiner från lymfocyter som sätter sig fast på inflammationssidan orsakar ytterligare skada. Individer som har genetiska varianter som orsakar hög sekretion av pro-inflammatoriska cytokiner har alltså en ökad risk att utveckla inflammationer. Syftet med detta projekt har varit att analysera detta vidare hos en ny grupp av patienter. Jag har gjort RFLP och SNP analyser på DNA från totalt 72 patienter med kärlinflammationer och höga halter IC. Jag har undersökt intressanta polymorfier i generna för TNF-alfa, IL-1-beta och CTLA-4. Det har visat sig att produktionen av TNF-alfa bl.a. är beroende av A/G polymorfismen på promotor region 308, samt att den ovanliga A-allelen är förknippad med en ökad sekretion [5]. Från TNF-alfa analyserna kan vi se att den ovanliga A-allelen förekommer i ökad grad hos IC patienter, se tabell 1. Dessa har alltså en ökad TNF- α sekretion och därmed större risk att utveckla kärlinflammation. Av detta kan vi dra slutsatsen att polymorfismen hos TNF-alfa generna bidrar till en annorlunda allel och genotyp förekomst hos våra patienter till skillnad från friska personer. Det förekommer alltså en variant i TNF-alfa genen som bidrar till denna höga sekretion. Från IL-1-beta analyserna kan vi se att den ovanliga A2-allelen förekommer i ökad grad hos IC patienter, se tabell 2. Då A2-allelen är associerad med högre IL-1-beta sekretion [5] kan vi dra slutsatsen att patienter med A2 alleler har en hög IL-1-beta sekretion och därmed större risk att utveckla inflammation. TNF-alfa och IL-1-beta är båda pro-inflammatoriska och således negativa då de förekommer i ökad mängd. På samma sätt kan vi säga att det är positivt med ökat uttryck av CTLA-4 eftersom det fungerar antiinflammatoriskt. I andra studier har den ovanliga T-allelen varit förknippad med ökad transkription och därmed ökat uttryck av CTLA-4 [11]. C-allelen däremot har varit förknippad med minskad funktion av CTLA-4 vilket innebär en bristande hämning av T-cells aktivering. Denna genetiska variant av CTLA-4 fungerar proinflammatoriskt. I min undersökning hade vi således väntat oss en ökad prevalens av C-allelen. Jag fick det jag förväntade mig men då denna allel även förekommer i ökad prevalens hos den friska gruppen kan jag inte förknippa C-allelen med kärlinflammationer och IC förekomst.från CTLA-4 analyserna kunde jag alltså inte se någon större skillnad av allel/genotyp frekvenser hos sjuka och friska personer. I denna undersökning visar sig C-allelen vara nästan lika vanlig hos våra patienter som hos friska, se tabell 3. Således kan vi inte förknippa förekomsten av C-allelen till personer med kärlinflammationer. Ingen signifikant association mellan C/T polymorfismen och kärlinflammationer med IC förekomst upptäcktes i denna undersökning. Det är inte en enda SNP som ger upphov till en sjukdom, utan det är oftast kombinationer av polymorfier samt fler gener som samverkar. I CTLA-4 genen skulle man således vilja titta på fler polymorfier för att se om det finns någon koppling mellan andra polymorfier som tillsammans kan ge upphov till utvecklingen av kärlinflammationer med höga halter immunkomplex. 20

Referenser [1] Geoffrey M. Cooper: The Cell. ASM Press, 2000 [2] Huang D., Pirskanen R., Matell G., Lefvert AK. 1999. Tumour necrosis factor-α polymorphism and secretion in myasthenia gravis. Journal of neuroimmunology 94:165-171 [3] Henrik Brändén och Jan Andersson: Grundläggande Immunologi. Studentlitteratur 1998 andra upplagan [4] Gel Electrophoresis, http://www.bergen.org/aast/projects/gel/elecnucleics.htm. Senast besökt, februari 2005 [5] Jasmina Cvetkovic 2002. Immune mechanisms in atherosclerotic disease [6] Awder Mustafa 2001. Circulating immune complexes in atherosclerotic vascular disease [7] Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne, Janis Kuby: Immunology. 2002 fifth edition [8] Cvetkovic JT, Wallberg-Jonsson S, Stegmayr B, Rantapaa-Dahlqvist S, Lefvert AK. 2002. Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with polymorphisms of the TNF-alpha, IL-1-beta and IL-1Ra genes. Journal of rheumatology. Feb 2002; 29(2):212-9 [9] Nityanand S., Truedsson L., Mustafa A., Bergmark C., Lefvert AK.1999. Circulating immune complexes and complement C4 null alleles in patients operated on for premature atherosclerotic peripheral vascular disease. Journal of clinical immunology.1999;19(6): 406-13. [10] Libby P.2002. Inflammation in atherosclerosis. Nature, Vol 420, Dec 2002;19(26): 868-874. [11] Wang XB., Kakoulidou M., Qiu Q., Giscombe R., Huang D., Pirskanen R., Lefvert AK.2002. Cds1 and promoter single nucleotide polymorphisms of the CTLA-4 gene in human myasthenia gravis. Genes and immunity 3: 46-49. [12] Lefvert AK.1997. Intensiv diagnostik av svårtolkade symptom. Läkartidningen, Vol 94, nr 9. 719. [13] http://home.swipnet.se/biokomp/dna/pcrlambda.htm. Senast besökt, mars 2005 [14] http://www.reumatiker.se/bilagor/eular02/02bil248.pdf. Senast besökt, okt 2005 [15] http://t1.physician.ki.se/csof/csof2/laboration/dnalabht04_csof2.pdf. Senast besökt, nov 2005 [16] DNA isolation methods, http://www1.qiagen.com/literature/brochures/gen_dna_pur/1019469_bros_dnyti_p10_13. pdf. Senast besökt, jan 2006 [17] Harvey Motulsky: Prism 4 Statistics Guide. 2003. Version 4.0 [18] http://www.math.chalmers.se/~staffan/lektion1.pdf. Senast besökt, mars 2005 21