Monolisa Anti-HBc PLUS 1 platta 96 tester 72315 5 plattor 480 tester 72316

Monolisa Anti-HBc PLUS 1 platta 96 tester 72315 5 plattor 480 tester 72316 TEST FÖR DETEKTION AV ANTIKROPPAR MOT NUKLEOKAPSIDANTIGEN (KÄRNANTIGEN) FÖR HEPATIT B-VIRUS I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS IVD Tillverkarens kvalitetskontroll Alla reagenser tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med acceptanskriterierna. Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt företag.

INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1 - KLINISK BETYDELSE 2 - TESTPRINCIP 3 - TESTETS BESTÅNDSDELAR 4 - MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ BIFOGAS 5 - HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR 6 - FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 7 - PROVER 8 - REKONSTITUERING AV REAGENSERNA - HÅLLBARHET - FÖRVARING 9 - METOD 10 - BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 11 - SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING 12 - TESTRESULTAT 13 - TESTETS BEGRÄNSNINGAR 14 - LITTERATUR 50

1 - KLINISK BETYDELSE De första antikroppar som uppträder efter HBs- och HBe-antigen under primär infektion med hepatit B-virus är antikroppar mot HBc. IgM-antikroppar är den första reaktionen på en infektion och förblir detekterbara under flera veckor. De försvinner under konvalescensen. IgG-antikroppar, som produceras senare, finns kvar många år efter tillfrisknandet. Detektionen av antikroppar mot hepatit B-nukleokapsid- eller kärnantigen är en viktig markör för förekomsten av en tidigare (anti-hbc totalt) eller nyligen förvärvad (anti-hbc IgM) infektion med hepatit B-virus. Patienter med kronisk hepatit B-virusinfektion uppvisar som regel höga nivåer av anti-hbc. Antikroppar mot HBc kan bestå under lång tid och observeras i åtminstone tre kliniska situationer: tillsammans med HBsAg, tillsammans med anti-hbs antikroppar och, i vissa fall, ensamma. Kontroll av blod från blodgivare och blodprodukter med avseende på antikroppar mot anti-hbc är ett lämpligt verktyg för att förhindra överföring av hepatit B-virus. 2 - TESTPRINCIP Monolisa Anti-HBc PLUS är en immunologisk enzymanalys (indirekt ELISA) för samtidig detektion av total mängd antikroppar mot hepatit B-virus kärnantigen (anti-hbc) i humant serum eller plasma. Monolisa Anti-HBc PLUS baseras på användning av en fast fas preparerad med rekombinant HBcantigen. Hanteringssteg : 1. De serum som ska testas och kontrollserumen fördelas i brunnarna. Om det finns antikroppar mot HBc kommer de att bindas till de antigen som sitter fast på den fasta fasen. 2. Peroxidasmärkta antikroppar mot humant IgG och IgM tillsätts efter ett tvättsteg. De binds i sin tur till de specifika antikroppar som har fångats in på den fasta fasen. 3. Efter att obundet enzymkonjugat har tvättats bort påvisas antigen-antikroppkomplexet genom tillsats av substrat. 4. När reaktionen har stoppats avläses absorbansvärden med hjälp av en spektrofotometer vid 450/620-700 nm. Med hjälp av uppmätt absorbans för ett prov kan man bestämma om antikroppar mot HBc finns eller ej. Färgintensiteten är proportionell till mängden anti-hbc antikroppar bundna till den fasta fasen. 51

3 - TESTETS BESTÅNDSDELAR MÄRKNING REAGENSTYP UTFÖRANDE 72315 72316 R1 MIKROPLATTA : 12 remsor med 8 brunnar coatade 1 5 med renat rekombinant antigen (uttryckt i E. Coli) mikroplatta mikroplattor R2 KONCENTRERAD TVÄTTLÖSNING (20X) 1 flaska 1 flaska Tris-NaCl-buffert, ph 7,4 70 ml 235 ml Konserveringsmedel : ProClin TM 300 (0.04%) R3 NEGATIVT KONTROLLSERUM 1 flaska 1 flaska Humant serum, negativt för antikroppar mot anti-hbc 1.5 ml 3 ml Konserveringsmedel : Natriumazid (0,1 %) R4 POSITIVT KONTROLLSERUM 1 flaska 1 flaska Humant serum innehållande antikroppar mot 1.5 ml 3 ml anti-hbc. Fotokemiskt inaktiverat. Konserveringsmedel : Natriumazid (0,1 %) R6 SPÄDNINGSVÄTSKA 1 flaska 2 flaskor PBS-buffertlösning med färgkontroll för indikation av 30 ml 2 x 60 ml provtillsats (lila). Konserveringsmedel : ProClin (0,1 %) och Ciprofloxacin 10 µg/ml. R7 KONJUGAT 1 flaska 2 flaskor Peroxidasmärkt antikropp (get) riktad mot 30 ml 2 x 60 ml humant IgG och IgM (grön) Konserveringsmedel : ProClin (0,1 %) och Ciprofloxacin 10 µg/ml. R8 PEROXIDASSUBSTRATBUFFERT 1 flaska 2 flaskor Citronsyra och natriumacetatlösning 60 ml 2 x 60 ml ph 4,0 innehållande H2O2 (0,015 %) och DMSO (4 %) R9 KROMOGEN 1 flaska 2 flaskor Lösning som innehåller tetrametylbensidin (TMB). 5 ml 2 x 5 ml R10 STOPPLÖSNING 1 flaska 3 flaskor 1 N svavelsyrelösning 28 ml 3 x 28 ml 4 - MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ BIFOGAS Destillerat eller avjoniserat vatten. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. Absorberande papper. Engångshandskar. Skyddsglasögon. Engångsrör. Automatiska eller halvautomatiska inställbara eller fast inställda pipetter, för 20 µl, 100 µl, 200 µl och 1 ml. Mätcylindrar för volymerna 10 ml, 200 ml och 1000 ml. Vortexblandare. Automatiskt*, halvautomatiskt* eller manuellt tvättsystem för mikroplattor. Vattenbad eller torr inkubator*, termostat inställd på 37 C ± 1 C eller 40 C ± 1 C. Behållare för smittfarligt avfall. Avläsningsutrustning för mikroplattor* (utrustad med 450/620-700 nm-filter). (*) Kontakta vår avdelning för teknisk service för vidare information om utrustning som är validerad av avdelningen 52

5 - HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR Alla reagenser som ingår i testet är avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk. Namnet på testet och testets specifika ID-nummer är skrivna på ramen för varje mikrotiterplatta. Det specifika ID-numret anges också på varje remsa. Monolisa Anti-HBc PLUS : Specifikt ID-nummer = 14 Kontrollera det specifika ID-numret före användning. Om ID-numret saknas eller om det skiljer sig från det angivna numret ovan ska remsan inte användas Använd engångshandskar när du hanterar reagenser och prover. Tvätta händerna noggrant efter hantering. Munpipettera ej. Material av humant ursprung som använts vid beredningen av den negativa kontrollen (R3) har kontrollerats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), anti-hbc antikroppar och hepatit C-virus (HCV) samt humant immunbristvirus (HIV 1 och HIV 2). Material av humant ursprung som använts vid beredningen av den positiva kontrollen (R4) har kontrollerats och befunnits reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg) och antikroppar mot anti-hbc och icke-reaktivt för antikroppar mot hepatit C-virus (HCV) och humant immunbristvirus (HIV 1 och HIV 2). Det har inaktiverats fotokemiskt. Det finns ingen metod med vilken man absolut kan garantera frånvaron av HIV-, HBV-, HCV-virus eller andra patogener. Betrakta dessa reagenser, liksom patientproverna, som potentiellt smittfarliga och hantera dem i enlighet med normala försiktighetsåtgärder. Betrakta allt material som har varit i direkt kontakt med prover och reagenser av humant ursprung, liksom tvättlösningar, som smittfarligt material. Undvik spill. Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10 %. Om den smittfarliga lösningen är en syra måste spill först neutraliseras med natriumbikarbonat därefter desinfekteras med blekmedel och torkas upp med absorberande papper. Material som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover, reagenser av humant ursprung, liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter måste omhändertas efter saneringen enligt följande : - antingen sänkas ned i blekmedel vid en slutkoncentration på 5 % natriumhypoklorit (1 del blekmedel till 10 delar smittfarlig vätska eller smittfarligt vatten) i 30 minuter, eller - autoklaveras vid 121 C i minst 2 timmar. VARNING : Ställ inte in lösningar som innehåller natriumhypoklorit i autoklaven. Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen eller stopplösning. Glöm inte att neutralisera och/eller autoklavera lösningar eller tvättavfall eller någon vätska som innehåller biologiska prover innan de hälls ut i vasken. Vissa reagenser innehåller natriumazid. Denna förening kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. För att undvika ansamling av sådana azider i rören, då dessa reagenser hälls i vasken, ska de först neutraliseras. Skölj därefter vasken med rikliga mängder vatten. Vissa reagenser innehåller ProClin 300 (0.04%, 0.1 % och/eller 0,5%) Xi Irriterande R43 : kan förorsaka överkänslighet vid hudkontakt S28/37 : Vid kontakt med huden, tvätta genast med mycket tvål och vatten. Använd lämpliga skyddshandskar. 6 - FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Resultatens kvalitet är beroende av att kraven för god laboratoriesed (GLP) uppfylls : Använd ej reagenser efter bäst _före _datum har passerats. Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd testkörning. KOMMENTAR : För tvättlösningen (R2, etikettmärkning : 20X grönfärgad), peroxidassubstratbufferten (R8, märknings-id : TMB buf., blåfärgad), kromogenen (R9, märknings-id : TMB 11 x, lilafärgad) och stopplösningen (R10, märknings-id : 1N rödfärgad) kan du använda andra partier än de som ingår i testet om samma parti används inom en bestämd testkörning. Dessa reagenser kan användas 53

tillsammans med vissa andra produkter från vårt företag. Dessutom kan tvättlösningen (R2, etikett-märkning: 20X grönfärgad) blandas med de 2 andra tvättlösningarna som ingår i olika Bio-Rad-reagens-satser (R2, etikettmärkningar: 10X blå- eller 10X orangefärgad) vid korrekt blandning, förutsatt att endast en blandning används vid en given testkörning. Kontakta vår avdelning för teknisk service om du vill ha mer information. Alla reagens skall uppnå rumstemperatur innan användning (30 minuter). Rekonstituera noggrannt reagenserna och undvik all förorening. Utför inte testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrannt har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre, engångsmateriel. Se till att mikroplattan inte torkar mellan tvättprocedur och reagenstillsats. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika lösningarna som innehåller konjugat- eller substratlösning. Framkallningslösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara rosafärgad. Om den rosa färgen förändras några minuter efter rekonstitueringen är detta en indikation på att reagenset inte kan användas och måste ersättas. Framkallningslösningen kan beredas i rena engångstråg av plast eller i glasbehållare som först har förtvättats med 1N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Detta reagens måste förvaras i mörker. Använd en ny pipettspets för varje serum. Tvättning av brunnar är ett kritiskt steg i detta förfarande. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat. Använd aldrig samma behållare för att fördela konjugatet och framkallningslösningen. Kontrollera noggrannhet och korrekt funktion för pipetter och annan utrustning. Ändra inte testförfarandet. 7 - PROVER Ta blodprov enligt normala rutiner. Testet ska utföras på serum eller plasma (insamlat i EDTA-, heparin-, citrat-, ACD-, CPD- och CPDAbaserade medel som förhindrar koagulering). Extrahera det så fort som möjligt för att undvika hemolys. Svår hemolys kan förändra testresultatet. Prover som innehåller aggregat måste klaras genom centrifugering innan testet utförs. Suspenderade fibrinaggregat eller fibrinpartiklar kan ge falskt positiva resultat. Proverna bör förvaras vid +2-8 C om screeningen utförs inom 7 dagar, eller djupfrysas vid -20 C. Undvik upprepad nedfrysning/upptining. Om proverna ska skickas bör de förpackas i enlighet med föreskrifterna om transport av etiologiska agenser. Transportera dem helst frusna. ANVÄND INTE KONTAMINERADE, HYPERLIPEMISKA ELLER HYPERHEMOLYSERADE SERUM. KOMMENTAR : Prover som innehåller upp till 30 g/l albumin, 200 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 36 g/l triolein, och hemolyserade prover som innehåller upp till 5 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. 8 - REKONSTITUERING AV REAGENSER HÅLLBARHET FÖRVARING Innan reagenserna i Monolisa Anti-HBc PLUS-testet används ska de stabiliseras vid rumstemperatur (18-30 C) i 30 minuter. 1) Färdiga reagenser HBcAg-mikroplatta (R1) Varje stödram innehåller 12 remsor och är förrpackad i en försluten påse. Klipp upp påsen med en sax eller skär upp den med en skalpell 0,5-1 cm ovanför förslutningen. Öppna påsen och ta ut ramen. Lägg tillbaka oanvända remsor i påsen. Stäng påsen noggrant och förvara den i +2-8 C. Negativt kontrollserum (R3) Positivt kontrollserum (R4) Spädningsvätska (R6) Vänd varsamt upp och ned för att homogenisera innan användning. 54

Konjugat (R7) Vänd varsamt upp och ned för att homogenisera innan användning. 2) Reagenser som ska rekonstitueras Koncentrerad Tvättlösning 20X : R2 Späd 1:20 med destillerat vatten för att få en färdig tvättlösning. Bered 800 ml för en platta med 12 remsor. Utspädd substratarbetslösning (R8 + R9) Späd reagenset (R9) 1 :11 med reagens (R8), exempel : 1 ml av reagens (R9) i 10 ml av reagens (R8). 10 ml krävs och är tillräckligt för 1 till 12 remsor. 3) Hållbarhet Testet ska förvaras i +2 8 C. Om det förvaras i rätt temperatur kan alla reagenser som ingår användas till det sista förbrukningsdatum som anges påförpackningen (om inga specialinstruktioner anges). R1 : När den vakuumförslutna förpackningen har öppnats kan remsorna användas i upp till 1 månad förutsatt att de förvaras vid +2-8 C i samma väl förslutna förpackning. R2 : Den utspädda tvättlösningen kan förvaras vid rumstemperatur (2-30 C) i 2 veckor. Den koncentrerade tvättlösningen (R2) kan förvaras vid +2-30 C. R8 + R9 : Efter rekonstitutionen kan reagensen förvarad i mörker användas i 6 timmar vid rumstemperatur (18-30 C). 9 - METOD Följ beskrivningen noggrant. Använd negativa och positiva kontrollserum för varje test för att validera testkvaliteten. Tillämpa god laboratoriesed. Det finns två metoder för Monolisa Anti-HBc PLUS : METOD 1 METOD 2 Provinkubering 37 ± 1 C 40 ±1 C 30 ± 5 min vattenbad/torrinkubator Konjugatinkubering 37 ± 1 C 40 ± 1 C 60 ± 5 min vattenbad/torrinkubator Enzymatisk påvisning 30 ± 5 min rumstemperatur 18 30 C (i mörker) 1. Konstruera ett pipetterings/arbetsprotokoll för kontroller och patientprover. 2. Bered tvättlösning till arbetskoncentration. 3. Ta ut mikroplattans ram och de färdiga remsorna (R1) ur skyddsförpackningen. 4. Tillsätt snabbt, direkt och i ordningsföljd följande: 4.1 200 µl spädningsvätska (R6) i varje brunn 4.2 20 µl negativt kontrollserum (R3) i A1, B1 20 µl positivt kontrollserum (R4) i C1, D1, E1 20 µl av det första provet i F1 om denna brunn inte används som reagenskontroll för provtillsatsövervakningen 20 µl av det andra provet i G1, etc... Beroende på systemet som används kan man ändra kontrollernas position. Homogenisera reaktionsblandningen genom minst 3 uppdragningar med 20 µl-pipetten eller genom att skaka mikroplattan efter pipetteringssteget. Du kan också fördela 220 µl av ett prov som tidigare har spätts 1:11. Om fördelningen av proverna tar mer än 10 minuter rekommenderar vi att du fördelar de negativa och positiva kontrollerna efter proverna som ska testas. 55

56 OBSERVERA : Efter att proven har fördelats kommer den lila spädningsvätskan att bli blå. Det är möjligt att kontrollera provtillsats i brunnarna genom spektrofotometrisk avläsning vid 620 nm (se avsnitt 11 SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING). 5. Täck brunnarna med självhäftande film genom att trycka över hela ytan. Se till att det blir tätt. 6. Inkubera mikroplattan i ett termostatstyrt vattenbad eller i en torr inkubator för mikroplattor enligt följande: Metod 1 : 30 min ± 5 min vid 37 C ± 1 C Metod 2 : 30 min ± 5 min vid 40 C ± 1 C 7. Ta bort den självhäftande filmen. Sug upp innehållet i alla brunnarna i en behållare för vätskeformigt avfall och tillsätt minst 0,370 ml tvättlösning i varje brunn. Sug upp igen. Upprepa tvättsteget 3 gånger (4 tvättningar). Den återstående volymen måste vara mindre än 10 µl. (Om det behövs kan du torka mikroplattan genom att vända den upp och ned på ett absorberande papper). Om du använder en automatisk tvättanordning följer du samma arbetssätt. 8. Fördela snabbt 200 µl av konjugatlösningen i alla brunnar. Konjugatet måste skakas varsamt innan användning. OBSERVERA : Konjugatet är grönfärgat. Det är möjligt att verifiera förekomsten av konjugatet i brunnarna genom en spektrometrisk avläsning vid 450 nm. (Se avsnitt 11 SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING.) 9. Täck med ny självhäftande folie och inkubera enligt följande : Metod 1 : 60 min ± 5 min vid 37 C ± 1 C Metod 2 : 60 min ± 5 min vid 40 C ± 1 C 10. Ta bort den självhäftande folien, töm alla brunnar genom att suga upp vätskan och tvätta 4 gånger enligt tidigare beskrivning. Den återstående volymen måste vara mindre än 10 µl. (Om det behövs kan du torka mikroplattan genom att vända den upp och ned på ett absorberande papper.) 11. Bered substratlösningen (se avsnitt 8, reagens R8 + R9). 12. Fördela snabbt i varje brunn 100 µl av framkallningslösningen (R8+R9) som beretts strax före användningen. Låt reaktionen fortgå i mörker i 30 ± 5 minuter vid rumstemperatur (18-30 C). Använd ingen självhäftande folie under denna inkubering. OBS! Fördelningen av framkallningslösningen, som är rosafärgad, kan kontrolleras visuellt i denna fas av hanteringen. Det finns en klar färgskillnad mellan tomma brunnar och brunnar med den rosafärgade substratlösningen. (Se avsnitt 11 om automatisk verifiering : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH KONJUGATPIPETTERING.) 13. Tillsätt 100 µl av stopplösningen (R10). Använd samma ordningsföljd och fördelning shastighet som för substratlösningen. Homogenisera reaktionsblandningen. OBS! Fördelningen av stopplösningen, som är färglös, kan kontrolleras visuellt i denna fas av hanteringen. Efter tillsats av stopplösningen försvinner substratets rosa färg (för negativa prover) eller ändrar färg från blått till gult (för positiva prover). 14. Torka noggrant av mikroplattans botten. Vänta minst 4 minuter efter tillsatsen av stopplösningen innan avläsning görs. Avläs den optiska densiteten vid 450/620-700 nm med hjälp av mikroplattans avläsare inom 30 minuter efter att reaktionen har avbrutits. 15. Kontrollera korrelationen mellan avläsningen och pipetterings/arbetsprotokollet för mikroplattan och proven innan resultaten registreras.

10 - BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT Förekomsten eller frånvaron av antikroppar mot anti-hbc bestäms genom att för varje prov jämföra den registrerade absorbansen med det beräknade gränsvärdet. 1. Beräkna det genomsnittliga absorbansvärdet för det positiva kontrollserumet (OD R4) Exempel : Positiv kontroll R4 Brunn med positivt kontrollserum Optisk densitet C1 1.796 D1 1.802 E1 1.852 Total 5.450 Total optisk densitet 5.450 Medelvärde för OD R4 = ------------------------- = ----------- = 1.817 3 3 2. Beräkning av gränsvärdet (Vs) Medelvärde för OD R4 Vs = ---------------------------- 5 Exempel : Medelvärde för OD R4 = 1,817 1.817 Vs = --------- = 0.363 5 Valideringskriterierna är enligt följande a) För negativ kontroll : Varje enskilt uppmätt absorbansvärde måste vara lägre än 0,100. b) För positiv kontroll - Varje absorbansvärde måste vara större än eller lika med 1,000 och mindre än eller lika med 2,900. - Om ett av värdena för de positiva kontrollerna ligger utanför dessa normer eller skiljer sig mer än 30 % från medelvärdet gör du om beräkningen igen med de två återstående värdena för de positiva kontrollerna. Upprepa testet om fler än ett positivt kontrollvärde ligger utanför de ovan angivna gränserna. Utvärdering av resultaten Prov med en optisk densitet mindre än gränsvärdet anses negativa med Monolisa Anti-HBc PLUStestet. Prover med en optisk densitet som är högre än eller lika med gränsvärdet betraktas som initialt positiva med Monolisa Anti-HBc PLUS-testet och måste testas på nytt med dubbelprover innan en slutgiltig utvärdering görs. Resultat som ligger precis under gränsvärdet Vs 10 % < OD bör utvärderas med försiktighet. (Vi rekommenderar att motsvarande prover testas på nytt med dubbelprover om de använda systemen och laboratorierutinerna tillåter detta). För initialt reaktiva eller tveksamma (0,9<kvot<1), efter omtest anses provet positivt med Monolisa Anti-HBc PLUS-testet om minst en av de båda mätningarna är positiv, dvs. högre än eller lika med gränsvärdet. Provet anses negativt med Monolisa Anti-HBc PLUS-testet om båda värdena är mindre än gränsvärdet. 11 - SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING (TILLVAL) VERIFIERING AV PROVPIPETTERING Efter att proven har fördelats kommer den lila spädningsvätskan bli blå. Metod 1 : utan användning av ett kontrollreagens Förekomsten av prov i brunnen kan verifieras med automatisk avläsning vid 620 nm: Jämför de uppmätta optiska densiteterna för varje brunn efter tillsats av spädningsvätska (R6) och efter provpipettering : OD-värdet för brunnarna som endast innehåller spädningsvätska (R6) måste vara över 0,500. Varje brunn som innehåller prov måste ha en OD-avvikelse som är större än 0,200 (en ODavvikelse som i strikt mening är lägre än 0,200 är en indikation på dålig fördelning av provet). 57

Metod 2 : med användning av kontrollreagens Förekomsten av prov i brunnarna kan verifieras med automatisk avläsning vid 620 nm med hjälp av en kontrollbrunn som endast innehåller spädningsvätska (R6) : Avläs plattan och jämför OD-värdet för varje prov med OD-värdet för kontrollbrunnen : OD-värdet för kontrollbrunn som endast innehåller spädningsvätska (R6) måste vara över 0,500. OD-avvikelsen mellan brunnen med prov och kontrollbrunnen måste vara större än 0,200 (en ODavvikelse som i strikt mening är lägre än 0,200 är en indikation på dålig fördelning av provet). VERIFIERING AV KONJUGATTILLSATS Konjugatet (R7) är grönfärgat. Förekomst av konjugat (R7) i brunnarna kan verifieras med automatisk avläsning vid 450 nm : OD-värdet för varje brunn måste vara större än 0,300 (ett värde som är lägre än denna norm är en indikation på dålig fördelning av konjugatet). VERIFIERING AV PIPETTERING AV FRAMKALLNINGSLÖSNING Det är möjligt att verifiera förekomsten av rosa framkallningslösning i brunnarna genom en automatisk avläsning vid 490 nm. En brunn med framkallningslösning måste ha en optisk densitet som är större än 0,100 (lägre OD tyder på dålig fördelning av framkallningslösningen). 12 - TESTRESULTAT INLEDANDE KOMMENTAR : Mot bakgrund av att det saknas konfirmerande test för anti-hbc antikroppar är det svårt att klart bestämma verklig status för resultat som erhålls med screeningtester. Följaktligen bestäms de följande procenttalen genom jämförelse med referenstester. Känslighetsstudier med Monolisa Anti-HBc PLUS-test har utförts för 430 positiva prover från uppföljning av patienter med hepatit B och för 2 känslighetspaneler med dokumenterade prover från patienter som nyligen infekterats med hepatit B-virus. Den diagnostiska känsligheten, baserad på 430 positiva prover med EIA-referenstest, var 99, 53 % (428/430). Tre prover befanns negativa. Bland dessa tre prover har ett prov inte bekräftats med det andra referenstestet. De två andra proverna, nära gränsvärdet (kvot 1,08 och 1,04) med det andra referenstestet motsvarar endast en patient. När utvärderingen utfördes uppskattades känsligheten med hjälp av IgG- och IgM-standarder från Paul Ehrlich Institute. Detektionsgränsen uppskattades till 0,5 U PEI/ml och 8 U PEI/ml för IgG respektive IgM. Specificiteten för testet för icke utvalda blodgivare var 99,9 % för 5 071 testade prover. Specificiteten för testet som utvärderades för 439 sjukhus- patienter var 99,5 %. Av 220 patienter med sjukdomar eller tillstånd icke relaterade till hepatit B-virus (gravida kvinnor, reumafaktor, antinukleärt Ig eller andra virusinfektioner) var var 16 prover positiva upprepat reaktiva med Monolisa Anti-HBc PLUS-testet. Bland dessa 16 prover var 15 också positiva med ett eller två andra test och ett prov (HAV IgM-positivt) befanns negativt med ett referenstest, då volymen var otillräcklig för att kunna bekräfta med en annan teknik. Noggrannheten för Monolisa Anti-HBc PLUS-testet har bestämts genom analys av 4 prover: 1 negativt prov (prov 1), 2 låg-anti-hbc-positiva prover (prov 2 och 3) och 1 hög-anti-hbc-positivt prov (prov 4). Reproducerbarheten inom testet har uppskattats genom testning av dessa 4 prover 30 gånger under samma körning. Reproducerbarheten mellan testerna har uppskattats genom testning av dessa 4 prover 3 gånger på 2 mikroplattor som utfördes vid 2 oberoende körningar varje dag under 5 dagar. Resultaten visas i följande tabeller : Tabell 1 : Reproducerbarhet inom testet n = 30 prov 1 prov 2 prov 3 prov 4 medelvärde av kvoterna 0.20 2.09 2.71 6.44 standardavvikelse 0.02 0.08 0.18 0.27 variationskoefficient (%) 7.77 % 3.72 % 6.82 % 4.15 % kvoter 58

Tabell 2 : Reproducerbarhet mellan tester n = 30 prov 1 prov 2 prov 3 prov 4 medelvärde av kvoterna 0.22 2.18 2.69 6.41 standardavvikelse 0.05 0.28 0.10 0.20 variationskoefficient (%) 23.42 % 12.78 % 3.53 % 3.17 % kvoter 13 - TESTETS BEGRÄNSNINGAR Ett negativt resultat indikerar att det testade provet inte innehåller anti-hbc-antikroppar som kan detekteras med Monolisa Anti-HBc PLUS. Ett sådant resultat gör det dock inte möjligt att utesluta möjligheten av exponering för en hepatit B-virusinfektion. Den kolorimetriska metoden för verifiering av prover, konjugat och framkallningslösning medger inte verifiering av noggrannheten av de fördelade volymerna. Denna metod visar bara förekomsten av prov, konjugat och framkallningslösning i brunnarna. Graden av felsvar med denna metod är nära förbunden med noggrannheten för det använda systemet (kumulerad variationskoefficient för fördelning och avläsning över 10 % minskar signifikant verifieringens kvalitet). Vid mycket dålig tvätteffekt efter konjugatinkuberingen, kan den automatiska verifieringen av pipetteringen av framkallningslösning (genom avläsning av OD i brunnarna vid 490 nm) ge felaktiga resultat, med OD över 0,100 i frånvaro av framkallningslösning. Detta fenomen har dock inte observerats under utvärderingen av 939 testade prover. 14 - LITTERATUR 1. HOOFNAGLE J.H., GERETY R.J., BARKER L.F. Antibody To Hepatitis-B-Virus Core in Man. Lancet (1973) 2 : 869-873 2. SZMUNESS W., HOFFNAGLE J.H., STEVENS C.E., PRINCE A.M. Antibody Against The Hepatitis Type B Core Antigen Am. J. of Epidemiology (1976) 104 (3) : 256-262 3. MUSHAHWAR I.K., DIENSTAG J.L., POLESKY H.F., Mc GRATH L.C., DECKER R.H., OVERBY L.R. Interpretation of Various Serological profiles of Hepatitis B Virus Infection Am. J. Clin. Pathol. (1981) 76 : 773-777 4. SLADE B.A., VROON D.H. Anti-HBc To Screen For Susceptibility To Hepatitis B. Lancet (1984) 1 : 1246-1247 5. TIOLLAIS P., POURCEL C., DEJEAN A. The Hepatitis B Virus. Nature (1985) 317 : 489-495 6. H.H. DRMEYER, W. ARNOLD, H. SHONBORN, J. KNOLLE, K.H. MEYER ZUM BUSCHENFELDE. Follow-up of anti-hbc titers in healthy HBs Ag carriers and patients with chronic inflammatory liver diseases. Digestion, (1981), 22, 289-293 7. GERLICH W.L. : LOER W and THOMSSEN R. Diagnosis of acute and inapparent Hepatitis B virus infections by measurement of IgM antibody to Hepatitis B core antigen - J. Infect. Dis. (1980) 142 (1) : 95-101 8. LEMON S.M. ; GATES N.L. ; SIMMS T.E. and BANCROFT W.H. (1981) - IgM antibody to Hepatitis B core antigen as a diagnostic parameter of acute infection with Hepatitis B virus - J. Infect. Dis. 143 (6) : 803-809 9. GERLICH W.H. : UY A.; LAMBRETCH F. and THOMSSEN R. Cutoff levels of immunoglobulin M antibody against viral core antigen for differentiation of acute, chronic and past Hepatitis B virus infections. - J. of Clin. Microbiol. (1986) 24 : 288-293 10. NAKAJIMA E. ; TSUJI T. ; KACHI K. ; KAGAWA K. ; OKANOUE T. and TAKINO T. Immunoglobulin M antibody to hepatitis B core antigen (IgM anti-hbc) as a marker of interferon therapy in patients with persistent Hepatitis B virus infection - Biken Journal (1987) 30 ; 17-23 11. LEMON S.M. (1988) - What is the role of testing for IgM antibody to core antigen of Hepatitis B virus? Mayo Clin. Proc. 63 : 201-204 59

60 12. NEURATH A.R., SZUMNESS W., STEVENS C.E., STRICK N., HARLEY E.J. Radioimmunoassay and Some Properties of Human Antibodies to Hepatitis B Core Antigen J. gen Virology (1978) 38 : 549-559 13. Manuel Guide - Safety Management N. CDC-22 Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts. (April 30, 1976) Atlanta, GA : Center for Disease Control. 14. Approved Standard - Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipucture - H3-A3, (1991). National Committee for Clinical Laboratory Standards, 3 rd Edition. 15. Approved Guideline - Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens, H18-A, (1990). National Committee for Clinical Laboratory Standards.

IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

(GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tél.: +33 1 47 95 60 00 01/2009 Fax.: +33 1 47 41 91 33 Code: 883565