IBD diagnostik jakten på den perfekta markören Aleksandra M. Havelka
Tarmsjukdomar - IBS och IBD 1,5 miljoner svenskar lider av kroniska mag-tarmbesvär (ffa irritabel kolon = IBS) 55 000 av dessa har inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) Varje år insjuknar ca 1500 individer i IBD (i Sverige)
Också kallad colon irritabile, känslig tarm, funktionella tarmbesvär eller irritabel tarm. Vad beror sjukdomen på? Störningar i tarmens nervsystem och/eller muskler? Intolerans eller överkänslighet för olika födoämnen? Ärftlig sjukdom? Debut efter tarminfektioner är vanligt. Hur ställer man diagnos? IBS (Irritable Bowel Syndrome) Det finns inte några laboratorietester som visar att man har sjukdomen och det syns heller inte några förändringar på eller i tarmen. Diagnosen ställs på symptom.
Symptom Magsmärtor Diarré Blod i avföringen Feber Viktminskning Trötthet 4 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
IBD (Inflammatory Bowel Disease) IBD - kronisk, periodvis mer aktiv inflammation av okänd genes Makroskopiska inflammationer: Ulcerös colit (UC) Chron s sjukdom (CD) CD Indeterminate colitis (IC) = odifferentierad kolit IC UC Mikroskopiska inflammationer: Kollagen och lymfocitär kolit
IBD IBD är betydligt vanligare i den industrialiserade västvärlden med en prevalens som närmar sig 1%. Insjuknandet är vanligast i 20 30 års åldern för Crohns sjukdom och ulcerös kolit medan mikroskopiska koliter företrädesvis drabbar kvinnor i medelåldern. 6 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Crohns sjukdom kronisk inflammation som kan förekomma i hela magtarmkanalen, med segmentell utbredning, sår, inflammation i alla vägglager samt ibland fistlar eller abscesser. Ulcerös kolit kronisk inflammation med utbredning från rektum som sträcker sig proximalt till delar av- eller hela kolon (ändtarmen och grovtarmen). Odifferentierad kolit kolit där man trots omfattande utredning ej kunnat skilja mellan Crohns sjukdom och Ulcerös kolit.
Behandling När tarminflammationen befinner sig i en aktiv fas inriktas den medicinska behandlingen på att dämpa symtomen med hjälp av antiinflammatoriska läkemedel, till exempel 5-aminosalicylater (5- ASA) eller kortison Vid svårare tillstånd kan andra läkemedel som hämmar immunsystemet, så kallade immunosuppressiva medel, användas. Kirurgiska åtgärder övervägs vid kolit som inte svarar på medicinsk behandling Av stor vikt är ett välfungerande samarbete mellan primärvårdsläkare och gastroenterolog, då de flesta IBDpatienter upptäcks i primärvården
Diagnostik av IBD Anamnes / status - vikt, längd, - nutritionsbedömning Blodprover - blodstatus, diff - SR / CRP, elfores, - albumin, leverstatus - yersinia o. Salmonellaserologi - celiakimarkörer Avföringsprov - Odling (salmonella, shigella, yersinia, campylobact) - Toxinbildande clostr. difficile - Fekalt calprotectin
Skopiundersökning Gold standard diagnos och läkningskontroll Invasiv undersökning Besvärlig; Laxering, Sövning (barn) Kostsam Frisk Crohn`s sjukdom Ulcerös kolit
IBD diagnostik metoder och markörer Scintigrafi med autologa leukocyter, 111 Indium eller 99 Tc märkta Högkänslig Kvantitativ Korrelerar väl med inflammationsgraden både vid CD och UC Nackdelar Patienten utsätts för strålning Kostnad Speciella faciliteter behövs för att genomföra testet 1- eller 4 dygns samling av faeces används 13 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Mätning av kväveoxid (NO) i tarmlumen Mängden NO är förhöjd i tarmen vid olika inflammatoriska tillstånd. Man kan studera uttryck av inos (inducible NO syntase) i biopsier eller mäta NO som ansamlas i tarmlumen. Nackdelar Invasiv Ej specifik (högst konc. vid kollagen kolit). Magnetisk resonasnstomografi (MR), Datortomografi (CT), Ultraljud 14 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Kan utredning av IBD förbättras och underlättas för patienter och sjukvården?
Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut? Stabil Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten Kan mätas i små mängder av faeces Påverkas ej av födan och läkemedel Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod 16 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Potentiella markörer i faeces? Calprotectin (S100 A8/A9) S100A12 Lactoferrin Human neutrophil lipocalin (HNL, NGAL) Myeloperoxidase (MPO) Alfa-1 antitrypsin Elastase F-Hb 18 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Calprotectin tarmens CRP 19 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Calprotectin Calcium- och zink-bindande protein Står för 60 % av proteininnehållet i cytoplasman hos neutrofila granulocyter Mätbart i olika kroppsvätskor (blod, likvor, ledvätska och faeces) vid bakteriella, inflammatoriska och maligna sjukdomar Verkar anti-inflammatoriskt och antimikrobiellt
21 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Calprotectin Calprotectin Granulocyte
Calprotectin Värmeresistent Resistent mot proteolys Hållbart i rumstemperatur 4 dygn (ev. 7 dygn) prov kan skickas med vanlig post Kvantitativ ELISA-metod för bestämning av calprotectin koncentration i faeces
Calprotectin i faeces - Referensintervall Vuxna och barn över 4 år: < 50 mg/kg ( gråzon 50-100 mg/kg) Friska spädbarn har högre normalkoncentration (spädbarn 2-10 veckor har ett medelvärde på 278 mg/kg) Dag till dag variation: ca 19% coefficient of variation
Fekalt calprotectin som diagnostiskt markör
Calprotectin i faeces hos barn med misstänkt IBD TEST Fekalt Calprotectin Albumin TPK Oroso mucoid ESR CRP CUT OFF 50mg/g <37g/l >400 x 10 9 /l 1,15 g/l 16 mm/h 7 g/l SENSITIV ITET 95% 59% 50% 41% 41% 36% Sensitivitet = andel sjuka med förhöjt värde U. L. Fagerberg et al. - Colorectal Inflammation is Well Predicted by Fecal Calprotectin in Children with Gastrointestinal Symptoms Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2005;40:450-455
Fekalt calprotectin hos barn med IBD Correlation between faecal calprotectin and inflammatory scores Macroscopic scores Histological scores Extent score Severity score Extent & Severity score Extent score Severity score Extent & Severity score Correlation ( r ) 0.61 0.52 0.65 0.71 0.72 0.75 Significance (p value) <0.001 0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 Fecal Calprotectin - A Quantitative Marker of Colonic Inflammation in Children with Inflammatory Bowel Disease Fagerberg UL et al. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2007;45(4):414-420
Fekalt calprotectin som diagnostiskt hjälpmedel i praktiken >2000 Fekalt calprotectin (mg/kg) 1000 Avsevärd inflammation > 100 indikerar gastrointestinal inflammation 100 50 0 50 100 mg/kg = gråzon Biologisk variabilitet? Sjuk? => Penetrera anamnes, symptom / överväg uppföljning < 50 mg/kg Referensvärde hos vuxna och barn 4 år
Hur mäter man calprotectin i faeces? 31 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Two-site sandwich ELISA is used for measurment of calprotectin concentration in faeces Polyclonal antibodies Measuremet range: upp to 2500 mg/kg Monoclonal antibody Measuremet range: upp to 1800 mg/kg Two monoclonal antibodies Measuremet range: upp to 2100 mg/kg? Recomended measuremet range: upp to 1200 mg/kg 32 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Buhlmann Immundiagnostik Difference between results obtained with kit from different manufacturers 800 700 600 500 400 300 200 Calprotectin, mg/kg Calprotectin, mg/kg 100 600 y = 0,7577x + 34,905 R 2 = 0,7028 0 y = 0,4841x - 11,14 500 20,00 220,00 420,00 620,00 820,00 1020,00 1220,00 R 2 = 0,854 1400 400 1200 300 100,00 200 90,00 80,00 100 70,00 60,00 0 50,00 0 100 200 300 400 500 600 40,00 PhiCal 30,00 20,00 10,00 0,00 20,00 220,00 420,00 620,00 820,00 1020,00 1220,00 1000 800 600 400 200 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Buhlmann 33 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
EQUALIS har nyligen startat ett kvalitetssäkringsprogram för F- calprotectin 34 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Extraktion Väg upp 50-150 mg faeces Tillsätt rätt volym extraktionsbuffert Blanda med Vortex i 60 sekunder och skaka i 20 minuter Häll av i ett nytt rör och centrifugera (10 000 x g i 5 min) Häll av supernatanten och analyser 35 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
ELISA, sandwich 1 2 3 4 5 6 1. Brunnarna är täckta med monoklonala antikroppar mot Calprotectin 2. Calprotectin / provet tillsätts till plattan och binder till antikropparna 3. Detektionsantikropp mot calprotectin tillsätts. Antikroppen är konjugerad till HRP 36 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
ELISA, sandwich TMB 1 2 3 4 5 6 4. Tillsatts av TMB, ett substrat till HRP. En färgreaktion sker i brunnen, TMB omvandlas till en blåfärgad produkt. 5. Efter tillsatts av stop-lösning omvandlas den blåa lösningen till gul 6. Avläsning av absorbansen vid 450 nm 37 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Antal analyserade prover på KS Number of analyzed calprotectin samples at Karolinska University Laboratory (2004-2009) 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 2004 2005 2006 2007 2008 2009 38 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Snabbtest för calprotectin i faeces Prevent ID CalDetect från Preventis Semi-quantitative immunochromatographic test 39 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
40 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
41 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Tolkning av resultat Ingen inflammation Ingen inflammation Måttlig inflammation Höggradig inflammation 42 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Prevent ID CalDetect vs ELISA (Bühlmann) ELISA Calpro Calpro T1 Calpro T1+T2 Calpro T1+T2+T3 CO=50 µg/g ND < 15 ug/g 15-60 ug/g > 60 ug/g 85,0 xx xx x 85,0 xxx x 85,0 x xxx 102,0 xxxx 106,0 xxx x x 110,0 xxxx 119,0 x xxx 55 patientprover Specificitet 100% Sensitivitet 60-80% (beroende på avläsning) 43 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
44 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
45 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören Mätintervall 30 3000 mg/kg
Quantum Blue Quantum Blue vs ELISA - korrelation 350 Scatter Plot with Fit 300 250 y = 0,8959x + 3,0664 R 2 = 0,82 200 150 100 40 patientprover, cut off 50 mg/kg 50 0 Specificitet 100% Sensitivitet 93% -50 0 50 100 150 200 250 300 ELISA 46 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Prevent ID CalDetect + - Enkel och snabb extraktion Semi-kvantitativ Inget krav för extra utrustning Resultaten kan vara svåra att bedöma Quantum Blue + - Kvantitativt Lång extraktion som kräver extra utrustning 47 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
A new rapid home test for faecal calprotectin in ulcerative colitis M. ELKJAER*, J. BURISCH*, V. VOXEN HANSEN*, B. DEIBJERG KRISTENSEN*, J.-K. SLOTT JENSEN & P. MUNKHOLM* Lateral Flow Device (LFD) for faecal calprotectin measurement with the Test and Control lines and the bar codes. Rapid test (RTscanning): The colour intensity of the test line was read by an ordinary table-top scanner after 10 min of incubation. The results of the faecal calprotectin measurement showed on a laptop computer screen in mg kg. 48 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
A new rapid home test for faecal calprotectin in ulcerative colitis M. ELKJAER*, J. BURISCH*, V. VOXEN HANSEN*, B. DEIBJERG KRISTENSEN*, J.-K. SLOTT JENSEN & P. MUNKHOLM* Faecal calprotectin measurement in mg kg is appearing on the phone screen 15 s after the picture has been sent to the server. 49 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Framtida utmaningar Snabbtest Optimera snabbtester enkel extraktion, kvantitativt svar med brett mätområde Kortare svarstider från labbet Snabbare metod för analys ersätta ELISA med en immunokemisk assay Effektivisera upparbetning av faecesprover 50 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Helt automatiserat system för upparbetning av faeces prover 51 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Vad gör SoniC? SoniC utför automatiskt alla steg nödvändiga för effektiv upparbetning av faecesprover: Identifierar och registerar provet (avläsning av barcode ID) Väger provet Tillsätter exakt mängd extraktionsbuffert i förhållande till provets vikt Homogeniserar provet med ultraljud Centrifugerar provet Alikvoterar supernatanten till sekundärt rör Späder provet till analys 52 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
ALIKVOTERINGSSTATION BARCODE AVLÄSNING CENTRIFUG RACK FÖR SEKUNDÄRA RÖR 53 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören RACK FÖR PRIMÄRA RÖR VÅGEN ULTRALJUDS HOMOGENISATOR
SoniC Jämförelse mellan manuell och automatiserad upparbetning av prover för analys av calprotectin i faeces 1600 1400 1200 y = 1,0089x - 14,846 R 2 = 0,9793 1000 800 600 400 200 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Manuell upparbetning Bra korrelation mellan manuell och automatiserad upparbetning 54 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Calprotectin koncentration (mg/kg) Ingen cross-contamination mellan proverna 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Dubbelprovsprecision: ca 10% (calprotectin nivå: 4-1400 mg/kg) Kapacitet: 100-120 prover / 8h 55 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Roboten Utveckling Avkorkning av primära rör Möjlighet att applicera prover på en ELISA platta Flera applikationer Provtagningskit för faecesprover Möjliggör hygienisk provtagning Resulterar i rätt provmängd 56 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Fördelar över den manuella metoden Bättre spårbarhet av patientprover Snabbare upparbetning leder till kortare svarstider Jämn och hög kvalité med ultraljudshomogenisering av prover Frigör personal från den manuella upparbetningsprocessen Förbättrar arbetsmiljön Provtagningskit resulterar I rätt provmängd som skickas till laboratoriet Förhoppningsvis kommer den automatiserade hanteringen av faecesprover att underlätta upptäckt av nya biomarkörer (t.ex. cancer och inflammationsmarkörer) i faeces. 57 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Fecalt calprotectin Billig och känslig markör för inflammation i tarmen tarmens CRP-test Kan användas som diagnostiskt test (ref.värde <50 mg/kg från 4 år) för att spåra IBD och andra inflammatoriska tillstånd i tarmen Underlättar selektion och prioritering av patienter till koloskopiundersökning
Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut? Stabil i faeces Kan mätas i små mängder av faeces Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod Påverkas ej av födan och läkemedel Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten 59 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Möjliga felkällor vid mätning av calprotectin konc. Variga övre luftvägsinfektioner Användning av vissa anti-inflammatoriska läkemedel ffa. NSAID preparat Förhöjda värden kan även ses vid: Bakteriell gastroenterit Obehandlad celiaki, esofagit, allergisk enterokolit Polyper och adenocarcinom 60 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut? Stabil i faeces Kan mätas i små mängder av faeces Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod Påverkas ej av födan och läkemedel Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten Calprotectin är en stabil, känslig, icke invasiv, billig men OSPECIFIK markör för inflammation i GI trakten 61 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Jakten på den perfekta markören fortsätter! Aleksandra M. Havelka
Tack för uppmärksamheten!!!