IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören. Aleksandra M. Havelka

Transkript

1 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören Aleksandra M. Havelka

2 S100 proteinfamilj Calprotectin

3 S100 proteinfamilj Består av 25 lågmolekylära proteiner, kda Proteinerna innehåller en EF-hand motiv (a helix loop a helix) E-helix Ca 2+ F-helix

4 Ca 2+ krävs för aktivering - konformationsförändring

5 Calprotectin S100A8/A9 Heterodimer av S100 A8 och S100 A9 S100 A8 calgranulin A S100 A9 calgranulin B S100 A12 calgranulin C Calprotectin Calgranulins - myeloid-related proteins Uttrycks i celler av myeloid ursprung.

6

7 Calprotectin S100A8/A9 Uttrycks ffa i neutrofila granulocyter men finns även representerad i monocyter, makrofager epitelceller, eosinofiler och vissa cancer celler. Dale; Scand J Clin Lab Invest 1990; 50:

8 Calprotectin Calcium- och zink-bindande protein Står för 60 % av proteininnehållet i cytoplasman hos neutrofila granulocyter Mätbart i olika kroppsvätskor (blod, likvor, ledvätska och faeces) vid bakteriella, inflammatoriska och maligna sjukdomar Verkar anti-inflammatoriskt och antimikrobiellt

9

10 Förhöjda värden av calprotectin finner man i olika inflammatoriska tillstånd Reumatoide-, juvenile- och reaktiv arthritis Glomerulonephritis Astma Diabetes melitus type 2 Atherosclerosis-related inflammation Neurodegenerative diseases Inflammatory bowel disease (IBD) Foell et al., Biochem J. 2006; 396:

11 Tarmsjukdomar - IBS och IBD 1,5 miljoner svenskar lider av kroniska magtarmbesvär (ffa irritabel kolon - IBS) av dessa har inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 0,5-1% Varje år insjuknar ca 1500 individer i IBD (i Sverige)

12 IBS (Irritable Bowel Syndrome) Också kallad colon irritabile, känslig tarm, funktionella tarmbesvär. Vad beror sjukdomen på? Störningar i tarmens nervsystem och/eller muskler? Intolerans eller överkänslighet för olika födoämnen? Ärftlig sjukdom? Debut efter tarminfektioner är vanligt. Hur ställer man diagnos? Det finns inte några laboratorietester som visar att man har sjukdomen och det syns heller inte några förändringar på eller i tarmen. Vid normala calprotectin värden kan man utesluta IBD Diagnosen ställs på symptom.

13 Symptom Magsmärtor Diarré Blod i avföringen Feber Viktminskning Trötthet

14 IBD (Inflammatory Bowel Disease) IBD - kronisk, periodvis mer aktiv inflammation av okänd genes Makroskopiska inflammationer: Ulcerös colit (UC) Chron s sjukdom (CD) Indeterminate colitis (IC) = odifferentierad kolit Mikroskopiska inflammationer: Kollagen och lymfocitär kolit CD IC UC

15 IBD IBD är betydligt vanligare i den industrialiserade västvärlden med en prevalens som närmar sig 1%. Insjuknandet är vanligast i års åldern för Crohns sjukdom och Ulcerös kolit medan mikroskopiska koliter företrädesvis debuterar i medelåldern.

16 Crohns sjukdom förekommer i hela mag-tarmkanalen segmentell utbredning inflammation i alla vägglager förekomst av sår, fistlar eller abscesser.

17 Ulcerös kolit Drabbar rektum och delar av- eller hela kolon (ändtarmen och grovtarmen) Inflammationen är begränsad till mucosan

18

19 Etiologi och patogenes Etiologin till IBD är relativt okänd. Kombination av immunologiska, mikrobiella och yttre faktorer som bidrar till sjukdomsuppkomst hos en genetisk predisponerad individ. Ärftligheten är en stark riskfaktor, särskilt vid Crohns sjukdom. Rubbad balans i tarmfloran Tobaksrökning är en risk-faktor för utveckling av Crohns sjukdom men verkar minska risken för att insjukna i Ulcerös kolit NSAID preparat

20 Tarmbarriären skyddar oss från antigener och mikroorganismer i tarmlumen De flesta genetiska förändringar kan kopplas till störningar i barriäregenskaper och epitelväggsfunktion.

21 Etiologi och patogenes Genetiska varianter ger dock inte hela förklaringen till IBD De flesta personer med NOD2 förändringar blir inte tarmsjuka I asiatiska populationer förekommer det knappast några polymorfier men allt fler insjuknar i IBD Ca 80% av patienterna har vid diagnostillfället ingen förstagradssläktning med IBD Utöver genetisk predisposition behövs det något mer som utlöser och driver inflammationen

22 Symptom IBD Magsmärtor Diarré Blod i avföringen Feber Viktminskning Trötthet Symptom IBS Magsmärtor Diarré Blod i avföringen Feber Viktminskning Trötthet Hos barn: Försenad pubertet Dålig tillväxt

23 Diagnostik av IBD Anamnes / status - vikt, längd, - nutritionsbedömning Blodprover - blodstatus - SR / CRP, elfores, - albumin, leverstatus - yersinia o. Salmonellaserologi - celiakimarkörer Avföringsprov - Odling (salmonella, shigella, yersinia, campylobact) - Toxinbildande clostr. difficile - Cystor o. maskägg - Fekalt clprotectin

24 Diagnostik av IBD - undersökningar Gastro- och coloskopi Tunntarmsröntgen MRT Buköversikt vid behov Ultraljud vid behov CT vid behov

25 Skopiundersökning Gold standard diagnos och läkningskontroll Invasiv undersökning, ej riskfritt Kostsam Besvärlig; Laxering, Sövning Frisk Crohn`s sjukdom Ulcerös kolit

26 Frågeställning: Kan utredning av IBD förbättras och underlättas för patienter och sjukvården?

27 Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut? Stabil i faeces Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten Kan mätas i små mängder av faeces Påverkas ej av födan och läkemedel Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod

28 Calprotectin i faeces Värmeresistent Resistent mot proteolys Hållbart i rumstemperatur i 4-7 dygn provet kan skickas med vanlig post Kvantitativa metoder används för bestämning av calprotectin koncentration i faeces

29 Calprotectin i faeces Vad är normalt? Vuxna och barn över 4 år < 50 mg/kg ( gråzon mg/kg) Friska spädbarn har högre koncentration (spädbarn 2-10 veckor har ett medelvärde på 278 mg/kg) Dag till dag variation: ca 19% coefficient of variation

30 Fekalt calprotectin som diagnostiskt hjälpmedel i praktiken >2000 Fekalt calprotectin (mg/kg) 1000 Avsevärd inflammation >100 indikerar gastrointestinal inflammation gråzon; Biologisk variabilitet? Sjuk? => Penetrera anamnes, symptom / överväg uppföljning <50 mg/kg Referensvärde hos barn 4 år

31 Hur ställer man diagnos? IBD eller IBS

32 IBD diagnostik metoder och markörer Scintigrafi med autologa leukocyter, 111 Indium eller 99 Tc märkta Högkänslig Kvantitativ Korrelerar väl med inflammationsgraden både vid CD och UC Nackdelar Patienten utsätts för strålning Kostnad Speciella faciliteter behövs för att genomföra testet 1- eller 4 dygns samling av faeces används

33 Mätning av kväveoxid (NO) i tarmlumen Mängden NO är förhöjd i tarmen vid olika inflammatoriska tillstånd. Man kan studera uttryck av inos (inducible NO syntase) i biopsier eller mäta NO som ansamlas i tarmlumen. Nackdelar Invasiv Ej specifik (högst konc. vid collagenous colitis). Endoskopi Gold standard Nackdelar Invasiv och kostsam Magnetisk resonasnstomografi (MR), Datortomografi (CT), Ultraljud

34 Hur analyseras fekalt calprotectin idag?

35 Calprotectin historik 1980 Fagerhol och medarbetare publicerar för första gången närvaro av L1 protein (calprotectin) i neutrofiler Release and quantification of leukocyte derived protein (L1). Fagerhol MK, Dale I, Anderson I., Scand. J. Haematol. 1980; 24: L1 isoleras och karakteriseras Purification and partial characterization of a highly immunogenic human leukocyte protein, the L1 antigen. Dale I, Fagerhol MK, Naesgaard I., Eur J Biochem Jul 15;134(1): ELISA Roseth et al Assessment of the neutrophil-dominating protein calprotectin in feces. A methodological study. Scand. J Gasreoenterol ; 27: Improved assay for fecal calprotectin Ton et al., Improved assay for fecal calprotectin. Clin. Chem. Acta 2000; 292:41-54

36 Calprotectin ELISA RIDASCREEN

37 Thermo Fisher SCIENTIFIC EliA Calprotectin Test principle Fluorescence enzyme immunoassay Coating Mouse monoclonal antibodies Cut-off < 50 mg/kg Measuring range mg/kg Time to result 2h to 1st result, thereafter every minute

38 Hur analyseras fekalt calprotectin idag? Väg upp mg faeces Behöver man väga? Ska provet blandas? Dubbelprov? Tillsätt rätt volym extraktionsbuffert Blanda med vortex i 60 sekunder och skaka i 20 minuter Häll av i ett nytt rör och centrifugera ( x g i 5 min) Häll av supernatanten och analysera Dubbelprov? Stabilitet?

39 Snabbtest för calprotectin i faeces Prevent ID CalDetect från Preventis Semi-quantitative immunochromatographic test 40 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören

40 Tolkning av resultat Ingen inflammation Ingen inflammation Måttlig inflammation Höggradig inflammation 41 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören

41

42

43 A new rapid home test for faecal calprotectin in ulcerative colitis M. ELKJAER*, J. BURISCH*, V. VOXEN HANSEN*, B. DEIBJERG KRISTENSEN*, J.-K. SLOTT JENSEN & P. MUNKHOLM* Faecal calprotectin measurement in mg kg is appearing on the phone screen 15 s after the picture has been sent to the server.

44 2010 startade EQUALIS ett kvalitetssäkringsprogram för F-kalprotektin

45 RESULTAT prov B (mg/kg) Sammanställning Buhlmann ELISA CALPRO ELISA mmundiagnostik ELISA Buhlmann-Snabbtest RESULTAT Prov A (mg/kg)

46 Prov B Kalprotektin (mg/kg) Sammanställning Prov A Kalprotektin (mg/kg) BÜHLMANN Elisa Immundiagnostik Elisa CALPRO Elisa Snabbtest - Bühlmann

47 Sammanställning

48 Kalprotektin Antal deltagare: 42 Resultat intervall Prov A: mg/kg CV% = 54 Prov B: mg/kg CV% = 50 Prov C: mg/kg CV% = 42

49 Framtida utmaningar Gemensam standardisering av metoder för analys av calprotectin Optimering av snabbtester Automatisering av: Den pre-analitiska upparbetningen av faecesprover Mätningen av calprotectin koncentrationen = ökad effektivitet och kortare svarstider

50 Fekalt kalprotektin Billig och känslig markör för inflammation i tarmen tarmens CRP-test Kan användas som diagnostiskt test (ref.värde <50 mg/kg från 4 år) för IBD och andra inflammatoriska tillstånd i tarmen Underlättar selektion och prioritering av patienter till koloskopi-undersökning

51 Möjliga felkällor vid mätning av kalprotektin Variga övre luftvägsinfektioner Användning av vissa anti-inflammatoriska läkemedel ffa. NSAID preparat Förhöjda värden kan även ses vid: Bakteriell gastroenterit Obehandlad celiaki, esofagit, allergisk enterokolit Polyper och adenocarcinom 52 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören

52 Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut? Stabil i faeces Kan mätas i små mängder av faeces Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod Påverkas ej av födan och läkemedel Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten 53 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören

53 Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut? Stabil i faeces Kan mätas i små mängder av faeces Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod Påverkas ej av födan och läkemedel Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten Calprotectin är en stabil, känslig, icke invasiv, billig men OSPECIFIK markör för inflammation i GI trakten 54 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören

54 Jakten på den perfekta markören fortsätter Aleksandra M. Havelka

55 Tack för uppmärksamheten!!!