Växtbioteknik Växtbioteknik (Transgena Växter) Ines Ezcurra Docent i molekylär genetik, Glykovetenskap, KTH Bioteknologi ines@biotek.kth.se Historik och GMO kontroversen Lagstiftning & regler Transgena växter: metoder Largescale biology Industriella tillämpningar Definition: Växtbioteknik = Modifiering av växtcellers proteinuttryck med hjälp av rekombinant DNA teknik Exempel: Stabila transgener, "transient" uttryck, gene silencing Historik och GMO kontroversen Jordbrukets revolutioner: 20 000 3 000 BC: Den neolitiska revolutionen m.h.a. domesticering av grödor. 60talet: Den gröna revolutionen m.h.a. hybridgrödor, bevattning, konstgödsel. 90talet: Växtbiotekniska revolutionen? GMO kontroversen Den första GMOn var Flavr Savr tomaten, 1994, antisense polygalakturonas, mognar i plantan och förblir fast. God efterfråga, ingen kontrovers. Sen kom: Endless Summer tomaten, saknar produktion av växthormonet etylen, förblir grön (marknadsfördes aldrig p.g.a. patenttvist) Bt majs, uttrycker Bacillus thuringiensis insekticid protein Cry9C Roundup so, uttrycker herbicidresistent protein EPSPS från Agrobacterium. Herbiciden glyfosat (Roundup) inhiberar växtens endogena EPSPS, som behövs för biosyntes av aromatiska aminosyror
Några inflytelserika artiklar: För alla dessa produkter: ingen självklar fördel för konsumenter, dålig info om fördelar från producenter. Allmänheten fortfarande känslig efter galnakosjukan 1996. Det handlar ju om mat och miljö! Playing God in the garden, av Michael Pollan, New York Times söndagsbilaga 1998. Monark fjärilen vs. Btmajs, artikel i Nature 1999. Kontroversen om kontamination av transgen majs i gamla majssorter i Mexico, artikel i Nature 2000. Frankenfoods!!! Antiglobaliseringsrörelsen 1999 tog ställning mot GMO och Monsanto. AntiGMO argumenten handlar ofta om den moderna jodbrukens problem & dilemma, och om jordbrukspolitik, snarare än om GMO. José Bové under en antigmo protest i Mars 2006 Lagstiftning i Sverige och EU All verksamhet som gäller GMO kräver tillstånd av Jordbruksverket, som bör analysera miljö och hälsorisker samt konsekvenser av eventuella skador. Detta gäller: Utsläppande på marknaden, det vill saga försäljning eller användning i olika produkter Försöksodling i fält Innesluten användning, till exempel i växthus och i laboratorier GMO skall alltid märkas!!! på labb, i växthus, på fält, i den färdiga produkten Debatten håller på att vända: Växtbioteknologi växer i hela världen, särskilt i 3:e världen. T.ex. jordbruksboomen i Sydamerika, som drivs av export av transgen soya Klimatföränding och energikrisen skapar behov av biobränsle Tillväxt i 3:e världen skapar stora behov av vaccin och medicin Tekniska genombrott för produktion av farmacevtiska proteiner i växter
Increased yields Transformation av växter Some economic statistics (Argentina 2005) Transformation av växter Stabila transformanter: ärftlig modifiering GMOs Transient" uttryck: ickeärftlig modifiering ej GMO Transient GFP uttryck Agrobacterium transformation: Tiplasmiden = en naturlig växtvektor Auxin & Cytokinin: växthormoner Opiner syntes & secretion från tumörer används som Ckälla av A. tumefaciens Border sekvens (höger): krävs för TDNA integrering Ti = tumor inducing TDNA = transferred DNA virgener Transfer + integrering av TDNA Ori: startpunkt för replikation
Modifierade Ti plasmider = växtvektorer, även kallade binära vektorer Transformation av tobak (t.ex. kanamycin R ) 1 2 Virgenerna i förs in i Agrobakterium cellen genom en modifierad Tiplasmid utan TDNA, s.k. helper plasmid. 1. Cocultivation: sterila bladbitar + Agrobacterium 2. Vävnadskultur under selektion + växthormoner som inducerar skott & rötter 3. Stabila transformanter 3 Transient uttryck: agroinfiltration Magnifection: ~ 5 d Agrobakterium kultur pressas in i bladet genom klyvöppningar i bladets undersida. Promotorer och reportergener: Växtpromotorer: viktiga verktyg för växtbioteknik PROMOTER X PROMOTER X GENE X REPORTER GENE By ex. GUS, LUC, GFP Reportergen aktiveras under samma omständigheter som GEN X 35S (från växtvirus) ubiquitin napin Inducerbara: Glucocorticoid receptor system: induceras med dexometason, kräver uttryck av GRfusion Hsp: heat shock promoter, induceras vid ~50 C konstitutiva fröspecifik AD DB RE GR + dex Y.F.P.
Reporter gener: Kan selekteras Hysto Kvantitkemisk ativ analys analys GUS, ßglukuronidas LUC, luciferas GFP kanamycinr hygromycinr streptomycinr Histokemisk GUS analys med olika växt promotorer GA1 PAL840 klassiska reporters Napin selektionsmarkörer LeExt1 Biolistik transformation med heliumdrivna gene guns Bra för arter som inte kan transformeras med Agrobacterium, t.ex. sädesslagen. Transient GUS activity in bombarded immature wheat embryos Även för transient uttryck. Guldpartiklar med höghastighet Dicots Populus Arabidopsis Monocots Rice An gi os pe rm s 150200 Ma S pl eed an ts Systems Biology Model Plants Animals Gymnosperms Seedless plants 400 Ma? 1600 Ma Moss, Physcomitrella patens
Växtgenom internationella initiativ Skogsbioteknik viktig för Sverige Kartlagda och publicerade genom: Arabidopsis thaliana Ris Populus trichocarpa, jättepoppel Medicago truncatula (legym) Physcomitrella patens (mossa) Eukalyptus Problem: Long generationstid p.g.a. blomning efter 1030 år Pågående initiativ: Korn (barley) Soya Lotus ponicus (legym) Sorghum Brachypodium (gräss, biobränsle) Zea mays (majs) Cassava Skogsbruk långt efter Växtförädling Jordbruk 10 000 år sedan Domesticering Te i os nt e In Växtföradlingsrevolution a di n co rn C or n Domesticering 1995 1995 Bioteknologirevolution Idag Kan man påskynda träföradling? Blomning efter 1530 år 10 000 år sedan Förädlingsrevolution Bioteknologi revolution Idag! Trädens förädlingspotential har inte utnyttts Somatisk embryogenes Embryolika strukturer induceras genom kultur av somatisk vävnad; bildar hela plantor på samma sätt som zygotiska embryo Artificiell frö
Blomningsmekanismer avslöde av bl.a. svenska forskare 2005 & 2006 kunskapen kan användas för att påskynda blomning, genom överuttryck av FT (signal protein) eller LEAFY (transkriptionsfaktor) Inducerad blomning blomning hos 6 månaders gamla plantor! Multiple developmental pathways for flowering in Arabidopsis: photoperiodism, vernalization (low temperature), sugar and gibberellin. The photoperiodic pathway is located in the leaves and involves the production of a transmissible floral stimulus, FT protein. In Arabidopsis, FT protein is produced in the phloem in response to CO protein accumulation under long days. It is then translocated to the apical meristem. FT binds to FD, and the FT/FD protein complex activates the AP1 and SOC1 genes, which trigger LFY gene expression. LFY and AP1 then trigger the expression of the floral homeotic genes. Ove Nilsson, UPSC Skogsbioteknik Largescale biology på träd Skogen saknar både domesticering och en grön revolution p.g.a. long generationstid; det tar 1530 år för våra skogsträd att blomma!!! Poppel genomet färdig 2006 Populus trichocarpa, jättepopel Blomningsmekanismer avslöde av svenska forskare 2005. En av årets viktigaste upptäcker enligt Science börn av en trädförädlings revolution? Sverige världsledande på skogbioteknologi: Bioteknologi behövs för snabbare och mera precis förädling Berzelii Center för Skogsbioteknik vid UPSC 2006 skogsbioteknik FUNCFIBER vid UPSC & KTH 2005 vedbiologi BioMime vid KTH & UPSC 2006 nya träfibrer Bio4Energy vid UPSC 2010 Svensk skogsbioteknik: med redskap ur växtgenomik identifierar man cellvägsenzymer som är viktiga för träets utvekling och materialegenskaper Vedens tre viktigaste komponenter Cellulosa Hemicellulosa (tvärbindande polysackarider) Lignin CesA GH Cell wall Plasma membrane GT Nucleus Golgi CesA, cellulosasyntaser GH, glykosylhydrolaser GT, glykosyltransferaser phydroxyphenyl (H) Guaiacyl (G)? DNA RER RNA Syringyl (S) Tvärsnitt av fibercellens cellvägg Vilka enzymer deltar i biosyntesen av cellvägspolymerer under träutveckling? Använd genomik istället för biokemi under första steget! Transcript profiling (4Omethylglucurono)xylan lövträd, hardwoods Galactoglucomannan barrträd, softwoods Xyloglucan primära cellväggen
Genvaskning Genvaskning under träutvekling: Globalt genuttryck under xylemutveckling (=gene mining) Microarray analysis A B C D Tissue section Ongoing process D E Genes upregulated during secondary cell wall formation Expected upregulated genes A = Cambium Cell division, 1 wall formation Cellcycle genes B = Early expansion 1 wall formation Inhibitors of cell division, genes involved in expansion Genes involved in expansion and C = Late 1 and 2 wall formation regulation of the transition 1 / 2 wall expansion Bioinformatics Genes upregulated in D D upregulated genes 20 CAZymes and other interesting targets 15 10 D = Early 2 wall 2 Cellulose synthesis Genes involved in cellulose synthesis E = Late 2 wall 2 Lignification, programmed cell death Genes involved in lignin synthesis and ray metabolism 5 0 Skogsbioteknik: farhågor & kontrovers 5 PH A B C D D E 10 Functional characterization Industriella tillämpningar Plantageskog vs urskog: skogens värde för fritid & rekreation Genflödet för träd upp till 1000 km Internationella satsningar på biobränsle Biobränsle: Sockerrör socker bioetanol Stärkelse socker bioetanol Cellulosa socker bioetanol Cellulosanedbrytning: med svagsyrahydrolys plus cellulaser (från svampar). Mest energikrävande alternativ, dock är cellulosa den mest förekommande biopolymer i jorden, så potentialen är stor. Stora forskningsinsatser just nu för att effektivisera försockring av cellulosa. US Dept of Energy (DOE) och BP (British petroleum satsade 2007 $800 miljoner på två stora forskningscentra Målet: att effektivisera produktion av bioetanol från cellulosa Cellulosanedbrytande enzymer Nya snabbväxande arter Transgena växter modifierade för lättare nedbrytning av cellulosa Fermentationsprocessen
BPsatsningen BP (British Petroleum) satsar 500 miljoner dollar för att skapa nytt forskningscentrum i Berkeley, CA, kallad EBI, Energy Biosciences EBI, utvecklar metoder för kostnadeffektiv och 'kolneutral' global energi produktion Tvärvetenskaplig forskning: biologi genomik ingenjörsvetenskap materialvetenskap kemi fysik Cellulosic biofuels are expected to become the dominant source of biofuels in the US Ethanol (Billions of gal/yr) 70 60 50 40 30 20 10 EXISTING EMERGING Sugar Platform New Enzymes Pretreatment Fermentation Cellulose Grain 0 2000 2005 2010 2015 2020 2025 Year ADVANCED Fundamental Advances in Lignocellulose Processing and fermentation (by US DOE) Modified from Richard Bain, NREL Forskning på EBI Solenergi Växtfibrer Sockerarter Biobränsle GM växter Modellväxter: snabbväxande gräs, typ elefantgräs och hirs (Panicum, Miscanthus) & jättepoppel Enzym teknologi, kemi, fysik o Från lignocellulosa till etanol Fem steg för produktion av bioetanol från lignocellulosa råvara 1. En förbehandlingsfas, som underlättar hydrolys av lignocellulosa råvara 2. Enzymatisk cellulosahydrolys, bryter ner polysackarider till socker 3. Separation av sockerlösning från kvarvarande obrutet material 4. Microbiell fermentation av socker 5. Destillation Möjliga vägar till effektivare katalys Enzymupptäckt genom metagenomics av bacteriell tarmflora från termiter och/eller idisslare, eller av microorganismer från skogsmark och/eller komposthögar In vitro proteinengineering av lovande enzymer Utveckling av syntetiska organiska katalyster (för polysackarider och lignin) Biobränsle i Sverige: Antalet miljöbilar ökar snabbt 80 % av allt bioetanol i Sverige har importerats från Brasilien. Nytt för 2006: tullar skyddar svensk biobränsle industri SEKAB & etanolpiloten i Örnsköldsvik: etanol av cellulosa Agroetanol i Norrköping: etanol av spannmål
Biobränsle i Sverige PMPs: Plantmade pharmaceuticals Firms making proteins in plants, 2006 Vacciner Antikroppar Enzymer Bioaktiva proteiner tillväxtfaktorer cytokiner antimikrobiella proteiner från modersmjölk Nature Biotechnology, 2006, 24:1191 Ventria Bioscience: humana modersmjölksproteiner, lactoferrin & lysozym, från transgen ris Studie i Peru visar att Ventrias proteiner är effektiva mot akut barndiarré. Två miljoner barn dör i akut barndiarré varje år i världen
PMPs i vattenväxter: växter som bioreaktorer Lemna (andmat) Chlamydomonas (gröna algaer) Fördelar: kombinerar fördelar från växtbaserade system och mikroorganismer Snabb tillväxt Utsöndring till odlingsmedium Avgränsat system Möjlighet att skala upp Producerar glukocerebrosidas, en lysosom hydrolas för behandling av Gaucher sjukdom, i morotsceller. Världsmarknad för glukocerebrosidas uppskattas till US$200 miljoner Världsproducent Genzyme (Ma, USA) fick stänga sin mammaliecell anläggning p.g.a. virus kontamination under 2009 Protalix aktie ökade 30% glukocerebrosidas Lemna system Biolex (Lemnabaserad) Liten, flytande aquatisk växt, monokot Vegetativ reproduktion med biomass fördubblingstider av 4872h Kan också blomma och bilda frö, vilket möjliggör genetisk korsning Transformationssystem finns Utvecklad och marknadsförd av Biolex Therapeutics i North Carolina, USA LEX system: patenterad Lemnabaserad transformation & expression system Produkt: Locteron, interferonα Hepatit C är en $5+ milrd marknad Kostnad för byggnad av LEXanläggning: $50 millioner, 3 år Kostnad för byggnad av mammaliecellanläggning: $400 millioner, 5 år Vacciner i växter Tidskurva för växtvacciners hypefaktor Många vetenskapliga rapporter beskriver framgångsrika försök. Bara två produkter fått licens av myndigheter: En HBV vaccin i Cuba, producerad i transgen tobak. En NDV (Newcastle disease virus) vaccin för fågel, producerad i tobaksceller av Dow AgroSciences Skäl: brist på investering, konservativ industri, stränga regler. (Ed Rybicki 2009)
Transgenic tomatoes expressing human betaamyloid for use as a vaccine against Alzheimer s disease Agroindustriella tillämpningar: herbicidresistens Immunization of mice with tomatoderived 3Ab (trimer) resulted in antiab antibody responses subsequent to the oral uptake of transgenic plant materials. Mice were gavaged by extracts from either nontransfromed (NT) plants (slash line bar) or transgenic line 3Ab6 (black bar) with CTB adjuvant. Bleeding time constitutes just before the examination (1st); after primary immunization, which was three times with weekly intervals (2nd); and after a booster at 7 weeks (3rd). Youm et al. 2008, Biotechnol Lett 30:1839 Plogningsfri odling Kräver herbicidbehandling & herbicidresistenta grödor Minskar jorderosion, näringsläkage och bränsle förbrukning Minskar vattenavdunstning från marken Binder kol i marken Minskar emission av växthusgaser Ökar ekonomisk vinst genom sänkta kostnader för maskiner, arbete och bränsle Notillage corn in US
Roundup technology The company: Monsanto The herbicide: glyphosate (Roundup) The plant target protein: EPSPS, an enzyme acting in the shikimate pathway that yields aromatic amino acids and secondary plant products. Resistance: by introducing EPSPS from resistant microbial sources Notes: Ma = Megaannum (10 6 years) (SI unit) EPSP Synthase: 5enolpyruvyl shikimate3phosphate synthase (EPSPS) is an enzyme involved in aromatic amino acid biosynthetic pathway and is the target of glyphosate based herbicides. In petunia, enzyme is synthesized in flowers at a high level and is hardly found in leaves, although in tomato it is synthesized both in flowers and leaves.