Växtbioteknik. Ines Ezcurra. (Eller: Transgena Växter) Docent i molekylär genetik, Träbioteknik, KTH Bioteknologi.

Transkript

1 Växtbioteknik (Eller: Transgena Växter) Ines Ezcurra Docent i molekylär genetik, Träbioteknik, KTH Bioteknologi ines@biotek.kth.se

2 Växtbioteknik - Historik och GMO kontroversen - Lagstiftning & regler - Transgena växter: metoder - Large-scale biology - Industriella tillämpningar

3 Definition: Växtbioteknik = Modifiering av växtcellers proteinuttryck med hjälp av rekombinant DNA teknik Exempel: Stabila transgener, "transient" uttryck, gene silencing

4 Historik och GMO kontroversen

5 Jordbrukets revolutioner: BC: Den neolitiska revolutionen m.h.a. domesticering av grödor talet: Den gröna revolutionen m.h.a. hybridgrödor, bevattning, konstgödsel talet: Växtbiotekniska revolutionen?

6 GMO kontroversen Den första GMOn var Flavr Savr tomaten, 1994, antisense polygalacturonas, mognar i plantan och förblir fast. God efterfråga, ingen kontrovers. Sen kom: - Endless Summer tomaten, saknar produktion av växthormonet etylen, förblir grön (marknadfördes aldrig p.g.a. patenttvist) - Bt majs, uttrycker Bacillus thuringiensis insekticid protein Cry9C - Roundup soja, uttrycker herbicidresistent protein EPSPS från Agrobacterium. Herbiciden glyfosat (Roundup) inhiberar växtens endogena EPSPS, som behövs för biosyntes av aromatiska aminosyror

7 - För alla dessa produkter: ingen självklar fördel för konsumenter, dålig info om fördelar från producenter. - Allmänheten fortfarande känslig efter galna-kosjukan Det handlar ju om mat och miljö! Frankenfoods!!!

8 Några inflytelserika artiklar: - Playing God in the garden, av Michael Pollan, New York Times söndagsbilaga Monark fjärilen vs. Bt-majs, artikel i Nature Kontamination av transgen majs i gamla majssorter i Mexico, artikel i Nature 2000.

9 Antiglobaliseringsrörelsen 1999 tog ställning mot GMOs och Monsanto. José Bové under en anti-gmo protest i Mars 2006

10 Anti-GMO argumenten handlar ofta om den moderna jodbrukens problem & dilemma, och om jordbrukspolitik, snarare än om GMOs.

11 Lagstiftning i Sverige och EU All verksamhet som gäller GMO kräver tillstånd av en myndighet, som bör analysera miljö- och hälsorisker samt konsekvenser av eventuella skador. Detta gäller: - Utsläppande på marknaden, det vill saga försäljning eller användning i olika produkter - Försöksodling i fält - Innesluten användning, till exempel i växthus och i laboratorier GMO skall alltid märkas!!! på labb, i växthus, på fält, i den färdiga produkten

12 Debatten håller på att vända: - Växtbioteknologi växer i hela världen, särskilt i 3:e världen. T.ex. utvecklingen i Argentina: soya export skapar $$$-inflöde, jordbruket & ekonomin blomstrar - Fågelinfluensan skapar vaccinbehov - Energikrisen skapar behov av biobränsle, Greenpeace reviderar uppfattning - Tekniska genombrott för produktion av terapeutiska proteiner i växter

13 Increased yields

14 Some economic statistics (Argentina 2005)

15 Transformation av växter

16 Transformation av växter Stabila transformanter: ärftlig modifiering GMOs Transient" uttryck: icke-ärftlig modifiering ej GMO Transient GFP uttryck

17 Agrobacterium transformation: Ti = tumor inducing T-DNA = transferred DNA

18 Ti-plasmiden = en naturlig växtvektor Auxin & Cytokinin: växthormoner Opiner - syntes & secretion från tumörer - används som C-källa av A. tumefaciens Border sekvens (höger): krävs för T-DNA integrering vir-gener Transfer + integrering av T-DNA Ori: startpunkt för replikation

19 Modifierade Ti plasmider = växtvektorer, även kallade binära vektorer (t.ex. kanamycin R ) Vir-generna i Agrobakterium cellen genom en modifierad Ti-plasmid utan T-DNA

20 Transformation av tobak Co-cultivation: sterila bladbitar + Agrobacterium 2. Vävnadskultur under selektion + hormoner som inducerar skott & rötter 3. Stabila transformanter 3

21 Biolistik - transformation med helium-drivna gene guns - Bra för arter som inte kan transformeras med Agrobacterium, t.ex. sädesslagen. - Även för transient uttryck. - Guldpartiklar med höghastighet

22 Transient GUS activity in bombarded immature wheat embryos

23 Promotorer och reportergener: PROMOTER X GENE X PROMOTER X REPORTER GENE By ex. GUS, LUC, GFP Reportergen aktiveras under samma omständigheter som GEN X

24 Växtpromotorer: viktiga verktyg för växtbioteknik 35S (från växtvirus) ubiquitin konstitutiva napin Inducerbara: Glucocorticoid receptor system: induceras med dexometason, kräver uttryck av GR-fusion Hsp: heat shock promoter, induceras vid ~50 C fröspecifik AD DB RE GR + dex Y.F.P.

25 Reporter gener: Kan selekteras Hystokemisk analys Kvantitativ analys GUS, ß-glukuronidas - ja ja LUC, luciferas - ja - GFP - ja - kanamycin R ja - - hygromycin R ja - - streptomycin R ja - - klassiska reporters selektionsmarkörer

26 GA1 Histokemisk GUS analys med olika växt promotorer PAL840 Napin LeExt1

27 Transient uttryck: agroinfiltration ~ 5 d Agrobakterium kultur pressas in i bladet genom klyvöppningar i bladets undersida.

28 Virala vektorer: Levereras med hjälp av Agrobakterium Binär vektor: T-DNA innehåller växtpromotor plus TMV (tobacco mosaic virus) genom, plus kodande delen för givet målprotein RB Växtpromotor Virus replikas Virus movement protein Målprotein RB (RNA) mrna = RNA virus (protein) REPLICASE Målprotein REPLICASE = RNA-dependent RNApol (sense type)

29 Teknisk genombrott med virala vektorer

30 Upp till 80 % av bladets proteininnehåll!!! Marillonnet et al. 2005, Nature Biotechnology 23:718

31 Magnifection:

32 Magnifection teknologi & 100x100 m 2 facilitet 400 kg ren protein per år!!! (påstår författarna)

33 VIGS = viral induced gene silencing Första ssrna produceras genom Agrobacterium transformation, m.h.a. binär vector innehållande virus cassette. RdRP = RNAdependent RNApol RISC = RNA induced silencing complex

34 En binär vektor för VIGS RdRP = RNA-dependent RNApol CP = coating protein

35 Systems Biology

36 Animals Model Plants Dicots Populus Arabidopsis Ma Angiosperms Monocots Gymnosperms Rice Seed plants Seedless plants 400 Ma? 1600 Ma Physcomitrella patens

37 Växtgenom - internationella initiativ Kartlagda genom: Arabidopsis thaliana Rice Populus trichocarpa Physcomitrella patens, mossa Pågående initiativ: Tobacco Arabidopsis lyrata Lotus japonicus (model för legymer) Sorghum Brachypodium, (model för gräss & sädesslag) Cotton Cassava

38 The Arabidopsis Genome Initiative: - Genomet The 2010 Project: funktion av alla gener!!! Mycket har åstadkommits på 5 år, se TAIR (The Arabidopsis Information Resource) - Fortsättning följer: The 2020 Project diskuteras

39 Genomet är bara början; slutmålet är att skapa en virtuell växt Gen Genomik mrna Transcriptomik Protein Metabolit Proteomik Metabolomik Bioinformatik Virtuell växt Kolhydrat Glycomics Fenotyp Fenomik

40 Skogsbioteknik - Skogen saknar både domesticering och en grön revolution p.g.a. long generationstid; det tar år för våra skogsträd att blomma!!! - Blomningsmekanismer avslöjade av svenska forskare En av årets viktigaste upptäcker enligt Science början av en trädförädlings revolution? - Bioteknologi behövs för snabbare och mera precis förädling

41 Large-scale biology på träd Poppel genomet färdig 2006 Populus trichocarpa, jättepopel Sverige världsledande på skogbioteknologi: - Berzelii Center för Skogsbioteknik vid UPSC skogsbioteknik - BioMime vid KTH & UPSC nya träfibrer - FUNCFIBER vid UPSC & KTH vedbiologi

42 Gen-vaskning under cellulosabiosyntes: (=gene mining) A B C D E Tissue section A = Cambium B = Early expansion C = Late expansion D = Early 2 wall E = Late 2 wall On-going process Cell division, 1 wall formation 1 wall formation 1 and 2 wall formation Cellulose synthesis Lignification, programmed cell death Expected up-regulated genes Cell-cycle genes Inhibitors of cell division, genes involved in expansion Genes involved in expansion and regulation of the transition 1 / 2 wall Genes involved in cellulose synthesis Genes involved in lignin synthesis and ray metabolism

43 Globalt genuttryck under xylemutveckling Microarray analysis D Genes upregulated during secondary cell wall formation Bioinformatics Genes upregulated in D D up-regulated genes PH A B C D E CAZymes and other interesting targets Functional characterization

44 Skogsbioteknik: farhågor & kontrovers - Plantageskog vs urskog: skogens värde för fritid & rekreation - Genflödet för träd upp till 1000 km

45 xx Industriella tillämpningar

46 Biobränsle: Sockerrör socker bioetanol Stärkelse socker bioetanol Cellulosa socker bioetanol Cellulosanedbrytning: med svagsyrahydrolys plus cellulaser (från svampar). Mest energikrävande alternativ, dock är cellulosa den mest förekommande biopolymer i jorden, så potentialen är stor. Stora forskningsinsatser just nu för att effektivisera försockring av cellulosa.

47 Internationella satsningar på biobränsle 2007 US Dept of Energy (DOE) och BP (British petroleum satsar $800 miljoner på två stora forskningscentra Målet: att effektivisera produktion av bioetanol från cellulosa - Cellulosanedbrytande enzymer - Nya snabbväxande arter - Transgena växter modifierade för lättare nedbrytning av cellulosa - Fermentationsprocessen

48 BP-satsningen BP (British Petroleum) satsar 500 miljoner dollar för att skapa nytt forsknings-centrum i Berkeley, CA, kallad EBI, Energy Biosciences EBI, utvecklar metoder för kostnadeffektiv och 'kol-neutral' global energi produktion Tvärvetenskaplig forskning: biologi - genomik - ingenjörsvetenskap - materialvetenskap - kemi - fysik

49 Forskning på EBI o Solenergi Växtfibrer Sockerarter Biobränsle GM växter Enzym teknologi, kemi, fysik Modellväxter: snabbväxande gräs, typ elefantgräs och hirs (Panicum, Miscanthus) & jättepoppel

50 Biobränsle i Sverige: Antalet miljöbilar ökar snabbt 80 % av allt bioetanol i Sverige har importerats från Brasilien. Nytt för 2006: tullar skyddar svensk biobränsle industri SEKAB & etanolpiloten i Örnsköldsvik: etanol av cellulosa Agroetanol i Norrköping: etanol av spannmål

51 Andra internationella satsningar Biobutanol av Dupont & BP: i marknaden 2008

52 PMPs: Plant made pharmaceuticals - Vacciner - Antikroppar - Enzymer - Bioaktiva proteiner tillväxtfaktorer cytokiner antimikrobiella proteiner från modersmjölk

53

54

55 Ventria Bioscience: humana modersmjölksproteiner, lactoferrin & lysozym, från transgen ris Studie i Peru visar att Ventrias proteiner är effektiva mot akut barndiarré.

56 Två miljoner barn dör i akut barndiarré varje år i världen

57 Agroindustriella tillämpningar: herbicidresistens

58 No tillage technology requires herbicide application & herbicide resistant crops reduces soil erosion, nutrient leakage and fossil fuel consumption reduces water evaporation from the soil sequesters carbon in the soil lower emission of greenhouse gases increases net profits by significantly reducing machinery and labor costs and fossil fuel consumption

59 Plogningsfri odling i Youtube: odling av GM-solrosor i Argentina

60

61

62

63

64 No-tillage corn in US

65 Roundup technology The company: Monsanto The herbicide: glyphosate (Roundup) The plant target protein: EPSPS, an enzyme acting in the shikimate pathway that yields aromatic amino acids and secondary plant products. Resistance: by introducing EPSPS from resistant microbial sources

66 Ökad motstånd mot torka och vattenstress

67 ERA1 technology era1 mutant: enhanced response to abscisic acid (Pei et al. 1998, Science 282:287) The mutant has increased response to ABA This causes the stomata to close earlier and more tightly ERA1 is a farnesyltransferase, but its protein targets are unknown

68

69 YPT, yield protection technology based on ERA1 Drough-responsive promoter plus ERA1 antisense = YPT technology, licenced to Performance Plants from Canada transgenic YPT rapeseed resistant to drought

70 YPT canola yields better under diverse field conditions