Jordbrukets revolutioner:

Transkript

1 Växtbioteknik Växtbioteknik (Transgena Växter) Ines Ezcurra Docent i molekylär genetik, Träbioteknik, KTH Bioteknologi - Historik och GMO kontroversen - Lagstiftning & regler - Transgena växter: metoder - Large-scale biology - Industriella tillämpningar ines@biotek.kth.se Definition: Historik och GMO kontroversen Växtbioteknik = Modifiering av växtcellers proteinuttryck med hjälp av rekombinant DNA teknik Exempel: Stabila transgener, "transient" uttryck, gene silencing

2 Jordbrukets revolutioner: BC: Den neolitiska revolutionen m.h.a. domesticering av grödor talet: Den gröna revolutionen m.h.a. hybridgrödor, bevattning, konstgödsel talet: Växtbiotekniska revolutionen? GMO kontroversen Den första GMOn var Flavr Savr tomaten, 1994, antisense polygalacturonas, mognar i plantan och förblir fast. God efterfråga, ingen kontrovers. Sen kom: - Endless Summer tomaten, saknar produktion av växthormonet etylen, förblir grön (marknadfördes aldrig p.g.a. patenttvist) - Bt majs, uttrycker Bacillus thuringiensis insekticid protein Cry9C - Roundup soja, uttrycker herbicidresistent protein EPSPS från Agrobacterium. Herbiciden glyfosat (Roundup) inhiberar växtens endogena EPSPS, som behövs för biosyntes av aromatiska aminosyror - För alla dessa produkter: ingen självklar fördel för konsumenter, dålig info om fördelar från producenter. - Allmänheten fortfarande känslig efter galna-kosjukan Det handlar ju om mat och miljö! Frankenfoods!!! Några inflytelserika artiklar: - Playing God in the garden, av Michael Pollan, New York Times söndagsbilaga Monark fjärilen vs. Bt-majs, artikel i Nature Kontroversen om kontamination av transgen majs i gamla majssorter i Mexico, artiklar i Nature 2000, PNAS 2005.

3 Antiglobaliseringsrörelsen 1999 tog ställning mot GMOs och Monsanto. Anti-GMO argumenten handlar ofta om den moderna jodbrukens problem & dilemma, och om jordbrukspolitik, snarare än om GMOs. José Bové under en anti-gmo protest i Mars 2006 Lagstiftning i Sverige och EU All verksamhet som gäller GMO kräver tillstånd av Jordbruksverket, som bör analysera miljö- och hälsorisker samt konsekvenser av eventuella skador. Detta gäller: - Utsläppande på marknaden, det vill saga försäljning eller användning i olika produkter - Försöksodling i fält - Innesluten användning, till exempel i växthus och i laboratorier GMO skall alltid märkas!!! på labb, i växthus, på fält, i den färdiga produkten Debatten håller på att vända: - Växtbioteknologi växer i hela världen, särskilt i 3:e världen. T.ex. jordbruksboomen i Sydamerika, som drivs av export av transgen soya - Klimatföränding och energikrisen skapar behov av biobränsle - Tillväxt i 3:e världen skapar stora behov av vaccin och medicin - Tekniska genombrott för produktion av farmacevtiska proteiner i växter

4 Increased yields Some economic statistics (Argentina 2005) Transformation av växter Transformation av växter Stabila transformanter: ärftlig modifiering GMOs Transient" uttryck: icke-ärftlig modifiering ej GMO Transient GFP uttryck

5 Agrobacterium transformation: Ti-plasmiden = en naturlig växtvektor Auxin & Cytokinin: växthormoner Opiner - syntes & secretion från tumörer - används som C-källa av A. tumefaciens Border sekvens (höger): krävs för T-DNA integrering Ti = tumor inducing T-DNA = transferred DNA vir-gener Transfer + integrering av T-DNA Ori: startpunkt för replikation Modifierade Ti plasmider = växtvektorer, även kallade binära vektorer Transformation av tobak (t.ex. kanamycin R ) 1 2 Vir-generna i Agrobakterium cellen genom en modifierad Ti-plasmid utan T-DNA 1. Co-cultivation: sterila bladbitar + Agrobacterium 2. Vävnadskultur under selektion + hormoner som inducerar skott & rötter 3. Stabila transformanter 3

6 Transient uttryck: agroinfiltration Magnifection: ~ 5 d Agrobakterium kultur pressas in i bladet genom klyvöppningar i bladets undersida. Promotorer och reportergener: Växtpromotorer: viktiga verktyg för växtbioteknik PROMOTER X PROMOTER X GENE X REPORTER GENE By ex. GUS, LUC, GFP Reportergen aktiveras under samma omständigheter som GEN X 35S (från växtvirus) ubiquitin napin Inducerbara: Glucocorticoid receptor system: induceras med dexometason, kräver uttryck av GR-fusion Hsp: heat shock promoter, induceras vid ~50 C konstitutiva fröspecifik AD DB RE GR + dex Y.F.P.

7 Reporter gener: Kan selekteras Hystokemisk analys Kvantitativ analys GA1 Histokemisk GUS analys med olika växt promotorer GUS, ß-glukuronidas - ja ja LUC, luciferas - ja - GFP - ja - kanamycin R ja - - klassiska reporters Napin PAL840 hygromycin R ja - - streptomycin R ja - - selektionsmarkörer LeExt1 Biolistik - transformation med helium-drivna gene guns - Bra för arter som inte kan transformeras med Agrobacterium, t.ex. sädesslagen. - Även för transient uttryck. - Guldpartiklar med höghastighet Transient GUS activity in bombarded immature wheat embryos

8 Systems Biology Animals Model Plants Dicots Populus Arabidopsis Ma Angiosperms Monocots Gymnosperms Rice Seed plants 400 Ma? Seedless plants 1600 Ma Physcomitrella patens Växtgenom - internationella initiativ Kartlagda och publicerade genom: Arabidopsis thaliana Ris Populus trichocarpa, jättepoppel Medicago truncatula (legym) Physcomitrella patens (mossa) Pågående initiativ: Korn (barley) Soya Lotus japonicus (legym) Sorghum Brachypodium (gräss, biobränsle) Zea mays (majs) Cassava Skogsbioteknik viktig för Sverige Problem: Long generationstid p.g.a. blomning efter år

9 Växtförädling - Jordbruk Skogsbruk - långt efter år sedan Domesticering Växtföradlingsrevolution Teosinte Indian corn Corn år sedan Domesticering 1995 Förädlingsrevolution Blomning efter år 1995 Idag Bioteknologirevolution Idag! Bioteknologi revolution Trädens förädlingspotential har inte utnyttjats Kan man påskynda träföradling? Somatisk embryogenes Embryo-lika strukturer induceras genom kultur av somatisk vävnad; bildar hela plantor på samma sätt som zygotiska embryo Artificiell frö

10 Inducerad blomning blomning hos 6 månaders gamla plantor! Blomningsmekanismer avslöjade av bl.a. svenska forskare 2005 & 2006 kunskapen kan användas för att påskynda blomning, genom överuttryck av FT (signal protein) eller LEAFY (transkriptionsfaktor) Ove Nilsson, UPSC Multiple developmental pathways for flowering in Arabidopsis: photoperiodism, vernalization (low temperature), sugar and gibberellin. The photoperiodic pathway is located in the leaves and involves the production of a transmissible floral stimulus, FT protein. In Arabidopsis, FT protein is produced in the phloem in response to CO protein accumulation under long days. It is then translocated to the apical meristem. FT binds to FD, and the FT/FD protein complex activates the AP1 and SOC1 genes, which trigger LFY gene expression. LFY and AP1 then trigger the expression of the floral homeotic genes. Skogsbioteknik - Skogen saknar både domesticering och en grön revolution p.g.a. long generationstid; det tar år för våra skogsträd att blomma!!! - Blomningsmekanismer avslöjade av svenska forskare En av årets viktigaste upptäcker enligt Science början av en trädförädlings revolution? - Bioteknologi behövs för snabbare och mera precis förädling

11 Large-scale biology på träd Poppel genomet färdig 2006 Populus trichocarpa, jättepopel Sverige världsledande på skogbioteknologi: - Berzelii Center för Skogsbioteknik vid UPSC skogsbioteknik - BioMime vid KTH & UPSC nya träfibrer - FUNCFIBER vid UPSC & KTH vedbiologi Svensk skogsbioteknik: med redskap ur växtgenomik identifierar man cellvägsenzymer som är viktiga för träets utvekling och materialegenskaper GH Cell wall CesA, cellulosa-syntaser GH, glykosylhydrolaser GT, glykosyltransferaser CesA Plasma membrane GT Golgi Nucleus RER DNA RNA Använd genomik istället för biokemi under första steget!? Vilka enzymer deltar i biosyntesen av cellvägspolymerer under träutveckling? Transcript profiling The Three Major Components of Wood Cellulose Lignin Hemicelluloses (matrix polysaccharides) (=gene mining) Gen-vaskning under träutvekling: A B C D E p-hydroxyphenyl (H) Guaiacyl (G) Syringyl (S) Schematic cross section of fiber cell wall 4-O-methylglucurono)-xylan - Hardwoods Galactoglucomannan - Softwoods Xyloglucan - Primary cell wall Tissue section A = Cambium B = Early expansion C = Late expansion D = Early 2 wall E = Late 2 wall On-going process Cell division, 1 wall formation 1 wall formation 1 and 2 wall formation Cellulose synthesis Lignification, programmed cell death Expected up-regulated genes Cell-cycle genes Inhibitors of cell division, genes involved in expansion Genes involved in expansion and regulation of the transition 1 / 2 wall Genes involved in cellulose synthesis Genes involved in lignin synthesis and ray metabolism

12 Globalt genuttryck under xylemutveckling Skogsbioteknik: farhågor & kontrovers D Microarray analysis Genes upregulated during secondary cell wall formation - Plantageskog vs urskog: skogens värde för fritid & rekreation - Genflödet för träd upp till 1000 km Genes upregulated in D D up-regulated genes Bioinformatics PH A B C D E CAZymes and other interesting targets Functional characterization Industriella tillämpningar Biobränsle: Sockerrör socker bioetanol Stärkelse socker bioetanol Cellulosa socker bioetanol Cellulosanedbrytning: med svagsyrahydrolys plus cellulaser (från svampar). Mest energikrävande alternativ, dock är cellulosa den mest förekommande biopolymer i jorden, så potentialen är stor. Stora forskningsinsatser just nu för att effektivisera försockring av cellulosa.

13 Internationella satsningar på biobränsle 2007 US Dept of Energy (DOE) och BP (British petroleum satsar $800 miljoner på två stora forskningscentra Målet: att effektivisera produktion av bioetanol från cellulosa - Cellulosanedbrytande enzymer - Nya snabbväxande arter - Transgena växter modifierade för lättare nedbrytning av cellulosa - Fermentationsprocessen BP-satsningen BP (British Petroleum) satsar 500 miljoner dollar för att skapa nytt forsknings-centrum i Berkeley, CA, kallad EBI, Energy Biosciences EBI, utvecklar metoder för kostnadeffektiv och 'kol-neutral' global energi produktion Tvärvetenskaplig forskning: biologi - genomik - ingenjörsvetenskap - materialvetenskap - kemi - fysik Cellulosic biofuels are expected to become the dominant source of biofuels in the US Ethanol (Billions of gal/yr) EXISTING EMERGING Sugar Platform -New Enzymes -Pretreatment -Fermentation ADVANCED Fundamental Advances in Lignocellulose Processing and fermentation Cellulose Grain Year Modified from Richard Bain, NREL (by US- DOE) Forskning på EBI Solenergi Växtfibrer Sockerarter Biobränsle GM växter Modellväxter: snabbväxande gräs, typ elefantgräs och hirs (Panicum, Miscanthus) & jättepoppel Enzym teknologi, kemi, fysik o

14 From lignocellulose to ethanol There are five stages to produce bioethanol from lignocellulose feedstocks 1. A pretreatment phase, to make the lignocellulisic material such as wood or straw amenable to hydrolysis 2. Enzymatic cellulose hydrolysis breaks down molecules into sugars 3. Separation of the sugar solution from the residual materials 4. Microbial fermentation of sugars 5. Distillation Possible routes to improved catalysts Enzyme discovery through metagenomics of bacterial flora from digestive tract of termites and/or ruminants, or from microorganisms from forest floors and/or compost heaps In vitro protein engineering of promising enzymes Develop synthetic organic catalysts (for polysaccharides and lignin) Biobränsle i Sverige: Biofuels in Sweden Antalet miljöbilar ökar snabbt 80 % av allt bioetanol i Sverige har importerats från Brasilien. Nytt för 2006: tullar skyddar svensk biobränsle industri SEKAB & etanolpiloten i Örnsköldsvik: etanol av cellulosa Agroetanol i Norrköping: etanol av spannmål

15 PMPs: Plant-made pharmaceuticals Firms making proteins in plants, Vacciner - Antikroppar - Enzymer - Bioaktiva proteiner tillväxtfaktorer cytokiner antimikrobiella proteiner från modersmjölk Nature Biotechnology, 2006, 24:1191 PMPs in aquatic plants: plants as bioreactors Lemna (duckweed, andmat) Chlamydomonas (green algae) Advantages: combined advantages from plant-based systems and microorganisms Rapid growth Secretion to growth medium Contained system Possible to scale up Lemna system Small, free-floating aquatic plants, monocot Vegetative reproduction with biomass doubling times of 48-72h Can also flower and seed, allowing genetic crosses Transformation system available Developed and commercialized by Biolex Therapeutics in North Carolina, USA

16 Biolex (Lemna-based) LEX system: patented Lemnabased transformation & expression system Product: Locteron, interferon Hepatit C is $5+ billion market Cost for building LEX plant: $50 million, 3 years Cost for building mammalian cell plant: $400 million, 5 years Ventria Bioscience: humana modersmjölksproteiner, lactoferrin & lysozym, från transgen ris Studie i Peru visar att Ventrias proteiner är effektiva mot akut barndiarré. Två miljoner barn dör i akut barndiarré varje år i världen Phytochem Rev (2008) 7:553

17 Transgenic tomatoes expressing human beta-amyloid for use as a vaccine against Alzheimer s disease Immunization of mice with tomato-derived 3Ab (trimer) resulted in anti-ab antibody responses subsequent to the oral uptake of transgenic plant materials. Mice were gavaged by extracts from either non-transfromed (NT) plants (slash line bar) or transgenic line 3Ab-6 (black bar) with CTB adjuvant. Bleeding time constitutes just before the examination (1st); after primary immunization, which was three times with weekly intervals (2nd); and after a booster at 7 weeks (3 rd ). Youm et al. 2008, Biotechnol Lett 30:1839

18 Agroindustriella tillämpningar: herbicidresistens No tillage technology requires herbicide application & herbicide resistant crops reduces soil erosion, nutrient leakage and fossil fuel consumption reduces water evaporation from the soil sequesters carbon in the soil lower emission of greenhouse gases increases net profits by significantly reducing machinery and labor costs and fossil fuel consumption

19 No-tillage corn in US Roundup technology The company: Monsanto The herbicide: glyphosate (Roundup) The plant target protein: EPSPS, an enzyme acting in the shikimate pathway that yields aromatic amino acids and secondary plant products. Resistance: by introducing EPSPS from resistant microbial sources xx