Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2

Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 platta 96 72561 5 plattor 480 72562 KOMBINERAT SCREENINGKIT FÖR HCV-ANTIKROPPAR OCH HCV-ANTIGEN I SERUM ELLER HUMANPLASMA MED EN TEKNIK FÖR ENZYMIMMUNANALYS 862224 2014/09

INNEHÅLL 1. AVSEDD ANVÄNDNING 2. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET 3. ANALYSMETODENS PRINCIPER 4. REAGENS 5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHET 6. PATIENTPROVER 7. FÖRFARANDE 8. ANALYSENS BEGRÄNSNINGAR 9. PRESTANDAEGENSKAPER 10. LITTERATURREFERENSER 2 [SE]

1. AVSEDD ANVÄNDNING Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 är en kvalitativ enzymimmunanalys för påvisande av infektion med hepatit C-virus (HCV). Analysen baseras på påvisande av HCV-antikroppar och viruskapsidantigen i serum eller humanplasma. Hepatit C-screeninganalysen kan användas av diagnostiska laboratorier och blodcentraler. 2. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Hepatit C-virus (HCV) är ett höljebärande plussträngat RNA-virus (9,5 kb) som tillhör familjen flavivirus och finns i sex genotyper. HCV anses vara huvudorsak till non-a och non-b-virushepatit. HCV-infektion kännetecknas av akut eller kronisk infektion som kan leda till cirros och hepatocellulärt karcinom. Serologiska bevis på HCV-infektion kan fås genom blodprov för HCV-antigen och/eller HCV-antikroppar och/eller HCV-RNA. I jämförelse med blodprov för enbart HCV-antikroppar kan en kombinerad screeninganalys för både HCV-antikroppar och HCV-kapsidantigen minska det serologiska fönstret och göra det lättare att påvisa infektionen. 3. ANALYSMETODENS PRINCIPER Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 grundar sig på att man använder en fast fas som förbereds med renade antigener: två rekombinanta proteiner från den icke-strukturella delen (NS3 och NS4) och en peptid-kapsid från den strukturella delen av hepatit C-viruset samt en monoklonal antikropp mot hepatit C-viruskapsiden. Den flytande fasen innehåller två konjugat: Det första konjugatet (R6) består av biotinylerad monoklonal antikropp från mus mot hepatit C-viruskapsiden. Den monoklonala antikroppen reagerar inte mot den kapsidpeptid som används i den fasta fasen. Det andra konjugatet (R7) är en blandning av peroxidasmärkta antihumana IgG-antikroppar från mus och peroxidasmärkt streptavidin. Analysförfarandet består av följande reaktionsmoment: 1) Konjugat 1 och de prover som ska analyseras samt kontrollserum dispenseras i brunnarna på mikroplattan. Om antikroppar mot HCV förekommer binds de till de antigener som finns i den fasta fasen Om en hepatit C-kapsidantigen förekommer binds denna av de monoklonala antikropparna från den fasta fasen och de biotinylerade monoklonala antikropparna mot hepatit C-viruskapsidantigenen (konjugat 1). 2) Efter inkubation i 37 C under 90 minuter och ett tvättmoment tillsätts konjugat 2 med peroxidasmärkta anti-humana IgG-antikroppar och peoxidasmärkt streptavidin till alla brunnar på mikroplattan. Om humant IgG förekommer och har reagerat med den fasta fasen binds de anti-humana IgGantikropparna till de humana antikropparna. Peroxidas-streptavidinkonjugatet binds till biotinet i konjugat 1 om provet innehåller en HCV-kapsid. 3) Efter 30 minuters inkubation i 37 C tas allt obundet enzymatiskt konjugat bort i tvättmomentet och förekomsten av antigen-antikroppar-peroxidas-konjugaten påvisas genom tillsats av substratet. 4) Efter 30 minuters inkubation i laboratorietemperatur (18 30 C) och efter att reaktionen har stoppats avläses spektrofotometern vid 450/620 700 nm. Med hjälp av den uppmätta absorbansen i ett prov kan man påvisa förekomst eller frånvaro av HCV-antikroppar och/eller viruskapsidantigen av hepatit C i provet. Färgens intensitet är proportionell till den andel HCV-antikroppar och/eller hepatit C- viruskapsidantigen som binds i den fasta fasen. 3 [SE]

4. REAGENS 4.1. Beskrivning Identifiering på etikett Beskrivning Form Beredning 72561 Form Beredning 72562 R1 Microplate Mikroplatta 12 remsor med 8 brunnar vardera som har belagts med monoklonala antikroppar mot HCV-viruskapsid, renad rekombinant hepatit C-antigen (NS3, NS4) och en HCV-kapsid-peptid. Särskilt ID-nummer = 93 1 platta 5 plattor R2 Concentrated washing solution (20X) Koncentrerad tvättlösning (20X) Trisbuffert NaCl, ph 7,4 Konserveringsmedel: ProClin 300 (0,04%) 70 ml Spädes 235 ml Spädes R3 Negative control Negativ kontroll Tris-HCI-buffert med BSA (bovint serumalbumin); Konserveringsmedel: ProClin 300 (0,1%) 1 ml 1 ml R4 Positive control Positiv kontroll Humant serum med antikroppar mot HCV, icke-reaktivt för HB-antigen och för antikroppar mot HIV-1/HIV-2, spätt i tris-hci-buffert med BSA och fotokemiskt inaktivt. Konserveringsmedel: ProClin 300 (0,1%) 1,5 ml 3 ml R5a Antigen positive control Positiv kontroll för antigen Syntetisk positiv kontroll för antigen med lyofiliserad kapsid-peptid. q.s. ad 1 ml Rekonstitueras q.s. ad 1 ml Rekonstitueras R5b Antigen diluent Spädningsvätska R5a Destillerat vatten med ett konserveringsmedel: ProClin 300 (0,5 %) 1 ml Rekonstituera s 1 ml Rekonstituera s R6 Conjugate 1 Konjugat 1 Biotinylerad monoklonal antikropp från mus mot HCV-kapsidantigen. Lila färg Konserveringsmedel: Natriumazid (< 0,1 %), Cosmocil CQ (0,025 %) 15 ml 2 flaskor 2 x 30 ml R7 Conjugate 2 Konjugat 2 Antikroppar från mus mot humant IgG/peroxidas och streptavidin/peroxidas. Grön färg Konserveringsmedel: ProClin 300 (0,5 %) 15 ml 2 flaskor 2 x 30 ml R8 Substrate buffer Substrat Citronsyra och natriumacetat, lösning, ph 4,0, med H 2 O 2 (0,015 %) och dimetylsulfoxid (DMSO) 4 % 60 ml Rekonstituera s 2 flaskor 2 x 60 ml Rekonstituera s 4 [SE]

R9 Chromogen: TMB solution (11X) Kromogen TMB-lösning Lösning med 3,3, 5,5 tetrametylbenzidin (TMB) 5 ml Spädes 2 flaskor 2 x 5 ml Spädes R10 Stopping solution Stopplösning Svavelsyrelösning (H 2 SO 4 1N) 28 ml 3 flaskor 3 x 28 ml 4.2. Förvaring och hantering Kitet ska förvaras vid 2 8 C. Varje del i kitet som förvaras vid 2 8 C kan användas fram till det utgångsdatum som finns på förpackningen (om ingenting annat anges). Efter öppnandet och vid frånvaro av kontaminering kan reagensen R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 och R10 användas fram till det utgångsdatum som finns på förpackningen vid förvaring i 2 8 C. Identifiering R1 R2 R5a + R5b R8 + R9 Förvaring Mikrobrunnsremsorna kan användas i en månad efter att den vakuumförslutna påsen har öppnats vid förvaring i 2 8 C i samma påse som noga försluts med tejp. Den spädda tvättlösningen kan förvaras vid 2 30 C i 2 veckor. Den koncentrerade tvättlösningen (R2) kan förvaras vid 2 30 C. Efter rekonstitution kan arbetslösningen med positiv antigenkontroll (R5) förvaras i 1 månad vid 2 8 C och i 2 månader vid 20 C (upp till 5 frys-upptiningscykler efter frysning vid 20 C). Efter rekonstitution kan reagens som förvaras mörkt användas i 6 timmar vid rumstemperatur (18 30 C). 5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHET Används för in vitro-diagnostik av hälso- och sjukvårdspersonal. 5.1. Hälso- och säkerhetsåtgärder Analyskitet bör endast hanteras av behörig personal som är utbildad i laboratorieprocedurer och bekant med eventuella risker. Lämpliga skyddskläder, handskar och ögon-/ansiktsskydd ska användas och kitet ska hanteras på rätt sätt enligt god laboratoriesed. Analyskitet innehåller blodkomponenter av humant ursprung. Material av humant ursprung som har använts i framställningen av R4-reagenset (positiv kontroll) har testats och funnits vara icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg) och antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV-1 och HIV-2) och reaktivt för antikroppar mot hepatit C-virus (HCV). Den positiva kontrollen R4 inaktiveras genom uppvärmning. Ingen känd testmetod kan fullständigt garantera frånvaro av smittsamma ämnen. Därför ska alla produkter av humant ursprung, reagens och humana patientprover hanteras som potentiellt smittförande. Följ alla rekommenderade lokala, regionala och nationella försiktighetsåtgärder för blodburna patogener. Biologiskt spill: Spill av material av humant ursprung ska betraktas som potentiellt smittförande. Spill som inte innehåller syror ska dekontamineras genast med lämpligt kemiskt desinfektionsmedel som är effektivt mot de potentiella biologiska risker som proverna utgör. Det betyder att spillområdet, materialen och eventuella kontaminerade ytor eller utrustningsdelar torkas av med en blandning i förhållandet 1:10 av blekmedel, 70 80 % etanol eller isopropanol, en jodofor (t.ex. 0,5 % Wescodyne Plus) och sedan torkas torra. Spill som innehåller syra ska torkas upp eller neutraliseras, området spolas med vatten och torkas torrt. Material som används för att torka upp spill bör hanteras som biologiskt riskavfall. Området ska sedan dekontamineras med ett kemiskt desinfektionsmedel. OBS! Lösningar som innehåller blekmedel får inte placeras i autoklav! 5 [SE]

Kassera alla prover och material som används för att utföra testet på samma sätt som om de var smittförande. Laboratorieavfall samt kemiskt eller biologiskt riskavfall måste hanteras och kasseras i enlighet med alla lokala, regionala och nationella bestämmelser. Rekommendationer för risker och försiktighetsåtgärder i samband med vissa kemiska komponenter i det här analyskitet finns i piktogrammen på etiketterna och i informationen i slutet av bruksanvisningen. Säkerhetsdatablad finns på www.bio-rad.com. 5.2. Försiktighetsåtgärder relaterade till protokollet 5.2.1. Beredning Resultatens tillförlitlighet är beroende av ett korrekt handhavande enligt god laboratoriesed. Reagens får inte användas efter utgångsdatum. Reagens från olika batcher får inte blandas eller förenas i samma analysomgång. Före användning ska reagensen stabiliseras vid rumstemperatur (18 30 C) i 30 minuter. På ramen till alla mikroplattorna finns analysens namn och särskilda identifieringsnummer. Det särskilda identifieringsnumret finns även på remsorna. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2: Särskilt ID-nummer = 93 Kontrollera det särskilda identifieringsnumret före användning. Om identifieringsnummer saknas eller skiljer sig från numret på analysen som ska utföras får remsan inte användas. ANMÄRKNING: För tvättlösning (R2, identifieringsmärkning: 20X grön färg), substratbuffert med peroxidas (R8, identifieringsmärkning: TMB-buffert, blå färg), kromogen (R9, identifieringsmärkning: TMB 11X, lila färg) och stopplösning (R10, identifieringsmärkning: 1N, röd färg). Det går att använda andra batcher än de som ingår i kitet så länge samma batch används i hela analysomgången. Reagensen går att använda med en del av företagets andra produkter. Kontakta teknisk service för mer information. Rekonstituera reagensen försiktigt och undvik kontaminering. Använd laboratorieglas som har tvättats väl och sköljts med avjoniserat vatten eller helst engångsmaterial. Mikroplattan får inte torka mellan avslutad tvätt och dispensering av reagensen. Enzymreaktionen är mycket känslig för metalljoner. Därför får inga metallföremål komma i kontakt med de olika konjugaten eller substratlösningarna. Enzymlösningen (substratbuffert + kromogen) måste vara rosafärgad. En förändring i den rosa färgtonen inom några minuter efter rekonstitueringen är en indikation på att reagenset inte kan användas och ska bytas ut. Enzymlösningen kan beredas i ett rent engångsplasttråg eller en ren engångsglasbehållare som har förtvättats med 1N HCl, noga sköljts med destillerat vatten och torkats. Reagenset måste förvaras mörkt. Samma behållare får aldrig användas för dispensering av både konjugat och enzymlösning. 5.2.2. Bearbetning Analysförfarandet får inte ändras. Analysen får inte utföras vid förekomst av reaktiva ångor (sura ångor, alkaliska ångor och aldehydångor) eller damm som kan påverka konjugatets enzymatiska aktivitet. En ny pipett ska användas för varje prov. En viktig del av förfarandet är att tvätta brunnarna. Det rekommenderade antalet tvättcykler ska följas. Alla brunnar ska fyllas helt och sedan tömmas. Om tvättningen utförs på fel sätt kan det leda till felaktiga resultat. Det angivna tvättförfarandet ska noga följas för bästa analysresultat. Vid användning av vissa instrument kan man behöva optimera tvättförfarandet (öka antalet cykler och/eller mängden tvättbuffert i respektive cykel) så att ett godtagbart OD-bakgrundsvärde erhålls för det icke-reaktiva provet. Kontakta företaget för information om anpassade och särskilda förfaranden. 6. PATIENTPROVER Ta ett blodprov enligt fastställda rutiner. Analysen ska utföras på serum eller plasma i outspädd form (EDTA-, natriumcitrat- eller ACD-rör). Provtagning i rör med tillsats av litiumheparin rekommenderas inte. En lägre signal observerades för prover som var reaktiva för HCV-antigen. 6 [SE]

Patientprover med aggregat måste separeras genom centrifugering före analysen. Suspenderade partiklar av fibrin eller aggregat kan ge falskt positiva resultat. Proverna förvaras vid 2 8 C om analysen utförs inom 7 dagar. I annat fall kan de djupfrysas vid 20 C. Högst 3 frys-upptiningcykler får utföras. Proverna måste tinas i rumstemperatur (18 30 C). Proverna bör homogeniseras genom att vändas upp och ned före användning. Prover som innehåller upp till 120 g/l albumin, 50 µg/l biotin, och 200 mg/l bilirubin, prover som innehåller 33 g/l triolein och prover som innehåller 2 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. Användning av prover som kontaminerats på grund av hyperlipemi eller hemolys rekommenderas inte. Uppvärmning av proverna rekommenderas inte eftersom detta kan försämra möjligheten att påvisa HCV-antigen. Om proverna ska transporteras måste de förpackas i enlighet med fastställda regler för transport av etiologiska agens. Helst ska proverna transporteras i fruset tillstånd. 7. FÖRFARANDE 7.1. Material som behövs men som inte ingår i förpackningen Destillerat vatten Natriumhypoklorit (klorin) och natriumbikarbonat. Absorberande papper Självhäftande film Engångshandskar Skyddsglasögon Engångsrör Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller flerkanalspipetter för mätning och dispensering 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl och 1 ml Graderade cylindrar i storleken 10 ml, 200 ml och 1 000 ml Vortexblandare Automatiskt, halvautomatiskt eller manuellt tvättsystem för mikroplattor Vattenbad eller motsvarande inkubator för mikroplattor, termostatinställd temperatur på 37 C ± 1 C (*) Behållare för biologiskt riskavfall Läsare för mikroplattor utrustad med filter i storleken 450, 490 och 620 700 nm (*). (*) Kontakta oss om du vill ha mer information om vilken utrustning som rekommenderas av vår tekniska avdelning. 7.2. Reagensberedning 7.2.1. a reagens Reagens 1 (R1) Mikroplatta Ramarna har kapacitet för 12 remsor och är förpackade i förseglade foliepåsar. Öppna påsen med sax eller skalpell 0,5 till 1 cm ovanför förseglingen. Öppna påsen och ta ut ramen. Lägg tillbaka oanvända remsor i påsen. Förslut påsen noga med tejp och förvara på nytt vid 2 8 C. Reagens 6 (R6) Konjugat 1 Homogeniseras genom att det vänds upp och ned före användning. Reagens 7 (R7) Konjugat 2 Homogeniseras genom att det vänds upp och ned före användning. 7.2.2. Reagens som ska konstitueras Reagens 2 (R2): Koncentrerad tvättlösning (20X) Spädes i förhållandet 1:20 i destillerat vatten till bruksfärdig tvättlösning. Bered 800 ml för en platta med 12 remsor. Reagens 8 (R8) + reagens 9 (R9): Enzymlösning Kromogenen (R9) spädes i substratbufferten i förhållandet 1:11 (t.ex. 1 ml reagens R9 + 10 ml reagens R8) under förutsättning att 10 ml behövs och är tillräckligt för 12 remsor. Homogeniseras. Reagens 5a (R5a) + reagens 5b (R5b): Arbetslösning (R5) 7 [SE]

Häll innehållet i spädningsvätskan R5b i flaskan R5 med lyofiliserad Ag. Sätt tillbaka proppen på flaskan och låt stå i rumstemperatur (18 30 C) i 10 minuter. Vänd flaskan upp och ned då och då så att pulvret löser sig lättare. 7.3. Analysförfarande Förfarandet ska följas noga. Validera analyskvaliteten med serum från den negativa och positiva kontrollen för varje analys. God laboratoriesed ska följas: 1) Upprätta en noggrann skriftlig plan för dispensering och identifiering av prover. 2) Bered den spädda tvättlösningen R2 och arbetslösningen för positiv kontroll för antigen (R5a + R5b). (Se 7.2.) 3) Ta ut ramen ur skyddsemballaget och det antal remsor som behövs (R1). Lägg tillbaka oanvända remsor i förpackningen. Försegla förpackningen och förvara den på nytt vid 2 8 C. 4) Dispensera i brunnen i följande ordning (rekommenderad dispensering): 100 µl konjugat 1 (R6) i varje brunn 50 µl negativ kontroll (R3) i brunn A1 50 µl positiv kontroll (R4) i brunn B1, C1, D1 50 µl arbetslösning för positiv kontroll av antigen (R5a + R5b) i brunn E1, 50 µl av det första provet i brunn F1 50 µl av det andra provet i brunn G1 osv. Blandningen homogeniseras med minst 3 aspirationer eller på skak för mikroplattor i 5 sekunder. Om dispenseringen av proverna tar mer än 10 minuter bör de negativa och positiva kontrollerna dispenseras efter de prover som ska analyseras. Beroende på vilket system som används går det att ändra placeringen av kontrollerna eller ordningen på dispenseringen. ANMÄRKNING: Efter dispenseringen av proverna färgas brunnen som innehåller provet (eller kontrollerna) lila eller blå. Förekomsten av (prov + konjugat 1) i brunnen kan kontrolleras genom spektrofotometrisk mätning vid 620 nm (se 7.7). 5) Om möjligt ska plattan täckas över med ny självhäftande plastfilm. 6) Mikroplattan inkuberas i 90 minuter (± 5 min) vid 37 C ± 1 C. 7) Den självhäftande filmen kan tas bort vid behov. Aspirera innehållet i samtliga brunnar i behållare för flytande avfall och tillsätt minst 370 µl tvättlösning i alla brunnarna. Aspirera på nytt och upprepa tvättningen minst 5 gånger. Den återstående volymen måste vara mindre än 10 µl (torka remsorna vid behov genom att lägga dem uppochned på absorberande papper). Vid användning av diskmaskin ska samma tvättcykel följas. 8) Dispensera snabbt 100 µl lösning av konjugat 2 (R7) i alla brunnar på plattan. Konjugatet måste skakas försiktigt före användning. Täck om möjligt över med ny självhäftande film och inkubera i 30 minuter (± 5 min) vid 37 C ± 1 C. ANMÄRKNING: Konjugatet är grönfärgat. Förekomsten av konjugat i brunnen kan kontrolleras genom spektrofotometrisk mätning vid 620 nm (se 7.7). 9) Ta bort den självhäftande filmen, töm samtliga brunnar genom aspiration och tvätta minst 5 gånger enligt anvisningarna ovan. 10) Bered enzymlösning (reagens R8 + R9). 11) Dispensera snabbt 80 µl av den beredda enzymlösningen (R8 + R9) i samtliga brunnar. Låt reagera i mörker i 30 minuter (± 5 min) i rumstemperatur (18 30 C). Självhäftande film ska inte användas vid inkubationen. ANMÄRKNING: Dispenseringen av enzymlösningen som är rosafärgad kan kontrolleras visuellt i det här steget. Det finns en tydlig färgskillnad mellan en tom brun och en brunn som innehåller den rosa substratlösningen. (Se 7.7.) 12) Tillsätt 100 µl av stopplösningen (R10) med samma ordningsföljd och hastighet som vid dispenseringen av enzymlösning. ANMÄRKNING: Dispensering av den färglösa stopplösningen kan kontrolleras visuellt i det här steget. Substratfärgen, rosa (för icke-reaktiva prov) eller blå (för reaktiva prov) försvagas i brunnarna och blir färglös (för icke-reaktiva prov) eller gul (för reaktiva prov) när stopplösningen tillsätts. 8 [SE]

13) Torka försiktigt av undersidan på samtliga plattor. Vänta i minst 4 minuter och högst 30 minuter efter att du har tillsatt stopplösningen. Läs av den optiska densiteten vid 450/620 700 nm med en plattläsare. 14) Kontrollera överensstämmelsen mellan de spektrofotometriska och visuella avläsningarna och kontrollera med plattan, provdispenseringen och identifieringsplanen. 7.4. Kvalitetskontroll Använd de positiva kontrollerna (R4 och R5) och den negativa kontrollen (R3) i varje analysomgång för validering av analysen. (Se 7.5.) 7.5. Valideringskriterier för analysen Analysen valideras om nedanstående förhållanden är uppfyllda: 1) För den negativa kontrollen (R3): Det uppmätta absorbansvärdet är mindre än 60 % av cutoff-värdet: OD < cutoff x 0,6 2) För den positiva kontrollen för antikroppar R4: 0,800 genomsnittlig OD R4 2 700 Om ett av värdena för den positiva kontrollen R4 skiljer sig mer än 30 % från genomsnittet ska du bortse från det värdet och göra om beräkningen med de två återstående positiva kontrollvärdena. 3) För arbetslösningen R5: OD > 0,500 7.6. Beräkning/tolkning av resultaten Cutoff-värdet bestäms med den positiva kontrollen R4: Beräkna det genomsnittliga uppmätta absorbansvärdet för den positiva kontrollen R4. Beräkna cutoff-värdet: Genomsnittlig OD R4 CO = --------------------- 5 Förekomsten eller frånvaron av HCV-antikroppar och/eller HCV-kapsidantigen påvisas genom en jämförelse mellan den registrerade absorbansen och det beräknade cutoff-värdet för respektive prov. Följande förhållande beräknas för varje prov: Förhållande = provets OD/CO-värde Prover med en optisk densitet som är lägre än cutoff-värdet tolkas som icke-reaktiva (förhållande < 1) i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2. Resultat precis under cutoff-värdet (CO 10 % < OD < CO, förhållande mellan 0,9 och 1) ska tolkas med försiktighet. Omanalys i duplikat av dessa prover är att rekommendera om det tillåts av systemet och laboratorieförfarandet. Prover med en optisk densitet som är större eller lika med cutoff-värdet (förhållande 1) tolkas som initialt reaktiva i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2. Dessa prover ska omanalyseras i duplikat före slutlig tolkning. Om förhållandet efter omanalys för minst ett av de två duplikaten är lika med eller större än 1 är det initiala resultatet repeterbart och provet definieras som reaktivt i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2. Om förhållandet för de 2 duplikaten är mindre än 1 är det initiala resultatet icke-repeterbart och provet definieras som icke-reaktivt. Prover som har omanalyserats två gånger och befunnits icke-reaktiva med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 men med ett värde som är i närheten av cutoff-värdet (förhållande mellan 0,9 och 1) ska tolkas med försiktighet. Patienten bör analyseras på nytt med en annan metod eller med ett annat prov. Om de analyserade proverna har mycket låg optisk densitet (negativ OD) och förekomsten i prover och reagens har kontrollerats kan resultaten tolkas som icke-reaktiva. 9 [SE]

Det rekommenderas att de reaktiva proverna bekräftas enligt fastställda nationella rekommendationer och algoritmer. 7.7. Spektrofotometrisk verifiering av pipetterade prov och konjugat (valfritt) Verifiering av prov och konjugat 1 (R6) Förekomsten av konjugat 1 (R6) + prov i brunnen kan verifieras genom automatisk avläsning vid 620 nm. Varje brunn som innehåller prov och konjugat 1 (R6) måste ha en OD som är större än 0,800. ANMÄRKNING: Efter att provet har tillsatts färgas konjugat 1 (R6) lila eller blått. Verifiering av konjugat 2 (R7) Konjugat 2 (R7) är grönfärgat. Förekomsten av konjugat 2 (R7) i brunnarna kan kontrolleras genom automatisk avläsning vid 620 nm: ODvärdet i varje brunn måste vara större än 0,300 (ett lägre värde än så tyder i regel på bristande dispensering av konjugatet). Verifiering av enzymlösning Förekomsten av rosa enzymlösning i brunnen kan verifieras genom automatisk avläsning vid 490 nm. En brunn som innehåller enzymlösning måste ha en optisk densitet som är större än 0,100 (lägre OD tyder på bristande dispensering av enzymlösningen). De tomma brunnarna skiftar tydligt färg från ofärgad till rosa när den beredda lösningen med kromogent substrat tillsätts. 8. ANALYSENS BEGRÄNSNINGAR Eftersom patienter med HCV-infektion har olika immunsvar (särskilt vid serokonversion) kan vissa skillnader observeras i resultat beroende på vilken typ av antigena proteiner som används. Ett icke-reaktivt resultat vid en screeninganalys utesluter därför inte möjligheten av exponering för eller infektion med hepatit C-virus. Enligt litteraturen kan patienter med HCV-infektion som står på immunosuppresiv behandling eller har samtidig infektion med HIV ha särskilt låga nivåer av antikroppar, under detektionsgränsen för HCVanalysen. Alla ELISA-tekniker kan ge en falskt positiv reaktion. Reaktionens specificitet bör kontrolleras för alla prover som definieras som repeterbart reaktiva enligt tolkningskriterierna i Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-kitet med en lämplig metod: antingen med enbart ELISA-screening eller tillsammans med immunoblot-metod för att bekräfta förekomsten av HCV-antikroppar. Vid behov kan man screena efter HCV-genomet med en molekylärbiologisk metod. Vid kontroll med kolorimetrisk metod av förekomsten av deposition i prover och/eller konjugat och/eller enzymlösning går det inte att garantera att de dispenserade volymerna som ska kontrolleras är rätt. Metoden påvisar endast förekomsten av provet och/eller konjugaten och/eller enzymlösningen. Andelen felsvar med metoden är nära förbunden med systemets noggrannhet (en total variationskoefficient för dispensering och läsning som överskrider 10 % försämrar kontrollkvaliteten markant). Användning av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen har inte godkänts för provpooler eller spädda prover. Fina partiklar kan i undantagsfall förekomma i konjugat 1 (R6) men förekomsten påverkar inte på något sätt reagenskvaliteten. 9. PRESTANDAEGENSKAPER 9.1. Precisionsmått Reproducerbarheten och den intermediära precisionen har fastställts med hjälp av prover med olika koncentration av HCV-antikroppar och HCV-antigen. Proverna analyserades 30 gånger i samma analysserie för att fastställa repeterbarheten. Den intermediära precisionen utvärderades genom analys av proverna i duplikat under 20 dagar i 2 separata analysomgångar per dag. Genomsnittligt förhållande, standardavvikelse och variationskoefficient (CV) beräknades. 10 [SE]

9.1.1. Repeterbarhet Prover N Genomsnitt ligt förhållande Standardav vikelse CV % Negativ S1 30 0,23 0,024 10,4 HCVantigen, positiv Anti-HCV, positiv S2 30 1,21 0,048 4,0 S3 30 1,43 0,053 3,7 S6 30 7,18 0,166 2,3 S4 30 1,42 0,046 3,2 S5 30 1,35 0,083 6,1 S7 30 6,73 0,153 2,3 Variationskoefficienten för de 6 reaktiva proverna är <10 %. Negati v 9.1.2. Intermediär precision Prover HCVantige n, positiv Anti- HCV, positiv S1 S2bi s S3 S6 S4 S5 S7 N 8 0 8 0 8 0 6 8 8 0 8 0 8 0 Genomsnittli gt förhållande 0,22 2,80 1,56 6,69 1,57 1,75 7,69 *: Det negativa variansvärdet beräknas vid 0. Mellan analyser SD 0,01 7 0,14 3 0,12 4 0,50 0 0,06 2 0,07 5 0,28 5 C V % 7, 5 5, 1 7, 9 7, 5 3, 9 4, 3 3, 7 Mellan analyser/operatör er SD CV % SD 0,028 12,5 0,277 9,9 0,129 8,2 0,621 9,3 Variationskoefficienten för de 6 reaktiva proverna är högst 15 %. 9.2. Klinisk prestanda Under en dag 0,02 9 0,28 3 0,08 3 0,55 7 CV % 12, 7 10, 1 Total reproducerbarh et SD CV % 0,043 19,4 0,421 15,0 5,3 0,197 12,6 8,3 0,973 14,5 0,125 8,0 0* 0,140 8,9 0,164 9,3 0* 0,181 10,3 0,531 6,9 0* 0,603 7,8 Prestandan för Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 har fastställts genom analys av prover från slumpvis utvalda blodgivare, inlagda patienter, patienter med akut och kronisk infektion med hepatit C-virus och patienter med kliniska tecken utan samband med infektion med hepatit C-virus. Studierna utfördes vid två blodcentraler, på ett sjukhus och vid Bio-Rads laboratorier. 9.2.1. Diagnostisk specificitet Studien utfördes på prover med serum och EDTA-plasma som tagits vid två blodcentraler från slumpvis utvalda givare. En specificitetsstudie utfördes också på prover från inlagda patienter. Samtliga prover analyserades med CE-märkt anti-hcv-analys. 11 [SE]

Population Plats Typ av prov Antal Blodgivare #1 Antal upprepade reaktiva prov (RR) Specificitet (%) serum 537 1 536/537 plasma 2002 0 2002/2002 #2 serum 2638 2 2636/2638 Konfidensintervall 95 % #1 + #2 5177 3 99,94 % 5174/5177 99,83 99,99 % Inlagda patienter #3 serum 502 1 99,80 % 501/502 98,92 100,00 % *: Tre blodgivare som gav indeterminant resultat med referensanalysen togs bort från beräkningarna. 9.2.2. Diagnostisk känslighet Den diagnostiska känsligheten studerades för 575 prover från patienter med HCV-infektion. Av dessa prover kom 25 från patienter vars prover togs 24 timmar före analysen. 481 olika prover med fastställd genotyp (1, 2, 3, 4, 5, 6) analyserades. Tabell 1: Analyserade genotyper Genotyper 1 2 3 4 5 6 (1, 1a, 1b, 1a/b) (2 2a/c, 2a, 2b, 2b/3 (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n) Totalt N 241 56 107 63 8 6 481 Den diagnostiska känsligheten för samtliga analyserade prover är 100 % (575/575) med 95 % konfidensintervall (99,4 100,0). Prover från patienter med akut infektion: 39 serokonversionspaneler (10 kapsidprofiler, 10 NS3-profiler och 19 multiprofiler) analyserades med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen och jämfördes med en kombinerad analys av antigen och antikroppar och med en analys av HCV-antikroppar, båda CE-märkta. Analyshastigheten har mätts för samtliga paneler. Av de 39 panelerna var det en som inte påvisades av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 och tre som inte påvisades av den kombinerade Ag-Ab-analys som användes som referens. Av de 38 paneler som påvisades med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2, påvisade 5 tidigare resultat, 27 likvärdigt resultat och 6 senare resultat jämfört med Ag-Ab-analysen. I jämförelse med en analys av HCVantikroppar påvisade 28 paneler tidigare resultat, 9 likvärdigt resultat och 1 senare resultat. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 kontrakombinerad Ag-Ab HCVanalys Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 kontraanti-hcv Antal paneler 38 38 Tidigare resultat 5 28 Likvärdigt resultat 27 9 Senare resultat 6 1 9.3. Studie av analytisk specificitet/korsreaktivitet 365 prover med risk för interferens på grund av innehåll av antikroppar mot patogener som kan leda till infektionssjukdomar (cytomegalovirus, Epstein-Barrvirus, VZV, mässlingvirus, rubellavirus, påssjukevirus, herpesvirus, influensavirus, hepatit A-virus, hepatit B-virus, HIV 1/2, HTLV 1/2, syfilis, Toxoplasma gondii, dengue, Chagas), prover från riskgrupper (dialyspatienter, icke-hepatisk cirros, gravida kvinnor, multipara kvinnor) eller prover från patienter med autoimmun sjukdom (autoantikroppar, reumatoida faktorer, anti-musantikroppar och myelom) analyserades med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen. 12 [SE]

Två prover visade sig vara repeterbart icke-reaktiva med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen. Denna målpopulation hade en observerad specificitet på 99,45 % (363/365), vilket var jämförbart med specificiteten för de kliniska proverna. 9.4. Prozoneffekt Risken för prozoneffekt studerades genom analys av 5 prover med hög titer och i olika spädningar. De likvärdiga resultat som observerades indikerar frånvaro av prozoneffekt. 10. LITTERATURREFERENSER Bhartia A.R., Letendrea S.L., Wolfsona T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : 328 332. Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, 36 : 211-218. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby A., Barp P.J., Weiner A.J., Bradley D.W., Kuo G. and Houghton M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455. EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64. Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729. Lambert N. Value of HCV Antigen-Antibody Combined HCV Assay in Hepatitis C Diagnosis. Dev. Biol. (Basel), 2007, 127: 113-121. Laperche S., Le Marrec N., Girault A., Bouchardeau F., Servant-Delmas A., Maniez-Montreuil M., Gallian P., Levayer T., Morel P., Simon N. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-hcv antibodies improves the early detection of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(8): 3877-83. Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1045. Rider P.J. and Liu F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32. Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.A., Tubiana R., Duvivier C., Ghosn J., Simon A., Katlama C. and Thibault V. Early Detection of Hepatitis C Virus Infection by Use of a New Combined Antigen-Antibody Detection Assay : Potential Use for High-Risk Individuals. J. Clin. Microbiol. 2006, 1561-1563. Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171. Widell A., Busch M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281. 13 [SE]

14 [SE]

15 [SE]

16 [SE]

17 [SE]

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette Frankrike Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/09 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 862224 www.bio-rad.com 18 [SE]