Datum på laborationen: 2010-11-16 Handledare: Alexander Engström Preparation och spektroskopisk karakterisering av Myoglobin Namn/Laborant: Jacob Blomkvist Medlaborant: Emmi Lindgren Antonia Alfredsson
Innehåll Innehåll... 1 Sammanfattning... 2 Introduktion... 3 Metod/Utförande... 4 Resultat och diskussion... 5 Källor... 6 1
Sammanfattning Denna laboration är en som går ut på att man ska analysera vilken koncentration man har av olika myoglobin sorter. Myoglobin är ett protein som finns i kroppen och kan binda syre och fungerar som en backup till hemoglobin som transporterar syre. När man analyserar detta tar man hjälp av en metod som kallas kolonn gelfiltrering där man fick separerar stora och små molekyler ifrån vanandra. Sedan använder man en spektofotometer som man kan se vilken absorbans man har på sitt prov. Vi använde oss av en metod där vi hade en bit nötfärs som vi fick det myoglobi som vi behövde. Sedan så ville vi få bort olika salter som fanns i provet med hjälp av gelfiltreringen för att sedan köra i spektrofotometern och få ut koncentrationer. Innan vi hade gjort detta hade vi haft i medel så att det hade reduceras och oxideras så att vi hade två olika former av myoglobin. Det resultat som vi fick var att innan vi renade provet var att koncentrationen var 0,864mg/ml medans efter vi hade renat och hade vi en koncentration på met- myoglobin på 0,579 mg/ml och för oxi- myoglobin på0,784 mg/ml. 2
Introduktion Det denna laboration går ut på att man ska ta reda på hur mycket av hemoglobin som man har i en bit köttförs. Sedan ska man hur mycket av respektive myoglobin som bildas av respektive som bildas efter det har reduceras och oxideras. Myoglobin är ett ganska litet protein som har en molekylmassa på ca 17000 g/ml. Med ett värde på myoglobin så kan man se hur mycket syre som köttet kan ha som reserv om det skulle vara så att inte får tillräckligt med syre genom hemoglobin. Myoglobin är ungefär uppbyggt som hemoglobin men att det har en hemgrupp bundet till proteinet. Myoglobin finns i tre olika former, met- myoglobin, oxi- myoglobin och en form som har något syre som ligand och heter deoxi- myoglobin. Om man har levande celler så kan man hitta formerna oxi och deoxi som mest. När en cell dör kommer det att blidas mer met- myoglobin från oximyoglobin allt eftersom tiden går. För att man ska kunna se vilken form av myoglobin man har så kan man titta på vilken absorbans myoglobin har. För om man gör detta kan man ganska enkelt se vilken av myoglobin man har, detta eftersom met- myoglobin och oximyoglobin har den egenskapen att det har specifika absorptionsspektra. Proteiner som innehåller en hemgrupp har sitt absorptionsmaximum runt 400nm i största allmänhet. Detta brukar också kallas för Soret band eller så kan man kalla det för Soret maximum. När man titta och letar efter detta på met- myoglobin så kommer detta band ligga på 409nm och när man tittar på oxi- myoglobin så kommer detta band att ligga på 417nm. Skillnaden i dessa spektra kommer att göra att man uppfattar de olika myoglobin formerna som olika färger. Nämligen att met- myoglobin kommer att vara brun i våra ögon, medans oxi- myoglobin kommer vara röd. Om man tillsätter oxidationsmedel respektive reduktionsmedel så kam man kan skynda på denna process när det olika myoglobin formerna omvandlas till varandra. Vill man att det skall bildas mer met- myoglobin från oxi- myoglobin så kan man tillsätta ett kan man tillsätta hexacyanoferrat(iii), detta gör att det oxi- myoglobin an har kommer då att oxideras till met- myoglobin. Medans om man tillsätter ditionit så kommer det ske en omvänd reaktion där alltså met- myoglobin kommer att reduceras till oxi- myoglobin. När man kör spektra för att se vilken sort av myoglobin man har så får man ut en absorbans vid den toppen som är kopplad till det myoglobin man tittar på. Om man har absorbansen så kan man räkna ut vilken koncentration man har av respektive myoglobin sort. Detta kan man göra med hjälp av Lambert-Beers Lag:. Där man har koncentrationen c, ε är en konstant som kallas för absorptionskofficient och denna är olika och kända för det olika myoglobin sorterna, A är den uppmätta absorbansen och l är den läng som ljuset kommer passera genom kyvetten i spektra körningen. Men det man gåt ut av detta är inte det man brukar ange koncentrationen i. För att få det så tar man och multiplicerar med myoglobins molmassa. Gör man detta så kommer man att få ut koncentrationen i g/l eller mg/ml. För att inte få med massor av salter och föroreningar när man kör en spektroskopisk analys så gör man en typ av separations metod som kallas för gelfiltrering. När man kör en gelfiltrering så använder man av en gel av porösa korn. När man då tillsätter sitt prov med olika stora molekyler så kommer detta vandra olika snabbt genom gelen. Detta beror på att när proteinerna ska ta sig genom gelen kommer det ta olika vägar. De stora proteinerna kommer inte att kunna ta sig igenom det porer som finns på kornen och kommer då att ta en väg runt 3
alla korn och kommer att komma ner snabbt ner genom kolven, medan de små molekylerna kommer gå genom alla det porer som finns och kommer på så sätt kommer de att ta en längre tid att ta sig igenom kolven. På detta sätt kan man separera det stora myoglobin molekylerna från alla det mindre molekylerna som salter till exempel. Metod/Utförande Det myoglobin som vi använder i denna laboration har vi fått ut från nötfärs. Myoglobin kommer att undersökas med hjälp av att man kommer att undersöka det vilket spektra man får när man kör en spektroskopisk analys av provet. Man kommer också att göra så att man kommer oxidera och reducera delar av provet för att se hur mycket av de olika myoglobin sorterna man har. Det man behöver för att göra denna laboration är: Mald nötfärs (ca 10g) Buffert I: 20mM Kaliumfosfat ph 5,6 Glas-stavar Centrifugrör Kyvetter: volym 1mL; strålgångens längd 1cm Buffert II: 20mM kaliumfosfat ph 5,6 och 50mM KCl Kaliumhexacyanoferrat(III) Natriumditionut 2x PD-10 kolonner Microcentifugrör Man börjar med att man tar sin nötfärs och lägger det i ett centrifugrör och tillsätter 20ml Buffert I till centrifugröret. Blanda sedan försiktigt (för våldsam omröring kan göra så att provet förorenas) i ungefär 1 minut. Centrifugera sedan i 15 minuter med hastigheten 10 000 rpm. Innan man centrifugerar så måste man se till att det är jämvikt mellan proverna som står mitt emot varandra i centrifugen. Efter 15 minuter i centrifugen plockar man upp sitt rör och då skall den vätska som man har i provet vara klar. Om det inte är så skall man göra om centrifugeringen. Har man n klar vätska så använder man en pastueur-pipett och för över den klara vätskan till ett plast rör. När man ska använda spektrofotometern så ska den vara inställd på ett scanning mode som ska ligga mellan 300 och 700nm. Sedan placerar man en kyvett med Buffert I längst bort i maskinen som referens, sedan så tar man sitt prov och har ner i en annan kyvett som man placerar närmast. Sedan stänger man luckan och kör en körning. Detta kommer att visa en kurva där man inte ser toppen på kurvan. Så då måste man späda sitt prov så man ser toppen. Vi spädde då med en del prov fem delar Buffert I. då kunde man se toppen på provet och kunde då få ut ett värde vilken absorbans det var vid just detta prov. Gör sedan i ordning två PD-10 gelfiltreringskolonner som man markerar med O och R. Man monterar dessa med en slaskbägare under och ekvilibreras med 30 ml av Buffert II. Sedan ska man göra i ordning 4
10st microcentrifugrör som man markerar med R1-R10 och 10st som man markerar med O1- O10. Sedan ska man göra i ordning två olika centrifugrör som man markerar R och O. I det rör man har R tillsätter man 1ml av sitt prov lösning och en spateludd av Natriumditionut som är ett reduktionsmedel. Till O röret tillsätter man 1ml av sin provlösning och en spateludd av ett oxidationsmedel som heter Kaliumhexacyanoferrat(III). Låt sedan rören stå i 5 minuter i rumstemperatur, notera om det kommer att bli några färgändringar. När det har stått i 5 minuter så har man ner respektive provlösning i respektive kolonn. Sedan låter man provet rinna igenom kolonnen. När det har runnit igenom kolonnen så ska man tillsätta 10x1ml Buffert II och samla upp varje ml i ett microcentrifugrör. Gör så med båda kolonnerna, när man har sätt till 10 gånger så ska man skölja båda kolonnerna med 30 ml avjonat vatten. Välj sedan det microcentrifugrör som man tycker är den som har mest färg. Detta två prov ska man köra i spektrofotometern. Här kommer det också behöva spädas och då späde vid en del prov och 10 del Buffert II. Sedan ska man scanna dessa prover som man har gjort förut. Sedan ska man avläsa vilken absorbans man få på respektive prov. Resultat och diskussion Det resultat vi fick när vi körde det förstaprovet i spektrofotometern så fick vi dessa resultat. Den absorbans att vi bara en topp på 409nm och där hade vi en absorbans 1,82 A. Vi tog dock reda på vilken absorbans vi hade på 417nm, där hade vi en absorbans på 1,46. Men eftersom det inte var en topp på där så kan man tro att det inte fanns någon av formen oxi- myoglobin i detta första prov. Med hjälp av Lamberts- Beers lag kan man räkan ut vilken koncentration man hade av myoglobin man har i den nötfärs som man använder. Nu när man har alla värden utom en kan man enkelt räkna ut vilken koncentration (c) man har: * 5 * 170000g/mol = 0,864g/l = 0,864mg/ml Att man tar multiplicerar med fem är eftersom man hade spätt provet fem gånger så att man kunde se toppen. När vi sedan hade ner oxidationsmedlet och reduktionsmedlet så vart det ett färgomslag i det prov som man hade ner oxidationsmedlet, detta prov blev gulaktigt när vi hade ner medlet. När vi sedan körde proven genom kolonnen så blev det att när vi körde provet med reduktionsmedlet så var det flesta av proverna genomskinliga (R1-2, 5-10), R3 fick en röd färg och R4 fick också en röd färg, dock var denna färg väldigt ljus. Det provet som vi hade haft oxidationsmedlet så blev det att O1-2 och O10 blev genomskinlig medan O3 blev brun, O4 blev mindre brun, medans O5-9 fick en gulaktig färg som minskade med i takt med att man bytte uppsamlingsrör. De prov som vart gula ska man inte använda, detta eftersom det är salter som man kan vara föroreningar som man inte vill ha med i sina prover. Det prov som var mest färgad av båda proverna tog vi och körde i spektrofotometern. Det absorbansen på 409nm som vi fick då var att O proverna som hade met- myoglobi var 0,61A. R provet som ska innehålla oxi- myoglobi som vi hade vi en absorbans vid 417nm på 0,59. Nu kan vi räkna ut vilka koncentrationer som vi hade av respektive prov på samma sätt som förut. Med dessa räkningar så fick vi koncentrationen * 10 * 170000g/mol = 0,579mg/ml och för met- myoglobin och för oxi- myoglobin hade koncentrationen * 5
10 * 170000g/mol = 0,784 mg/ml. Att man tar och multiplicerar med tio i denna uträkning är att man spädde provet tio gånger för att man skulle kunna se topparna. Det resultat som vi fick stämmer ganska bra. Detta eftersom att det har bilads ganska mycket av met- myoglobin på den andra körningen. Att det är en större koncentration efter att vi hade gjort gelfiltreringen borde vara därför att man har fått en mycket mer ren produkt och att det inte är så många t.ex. salter som är där och späder myoglobin koncentrationen Källor Laborationshandledningen 6