Expressionsstudie av promotorregioner för kloratreduktas och kloritdismutas från Ideonella dechloratans

Transkript

1 Fakulteten för teknik och naturvetenskap Biokemi Emelie Edström Expressionsstudie av promotorregioner för kloratreduktas och kloritdismutas från Ideonella dechloratans Expression study of the promoter regions for chlorate reductase and chlorite dismutase from Ideonella dechloratans Examensarbete 15 hp Kemi Datum/Termin: HT-2012 Handledare: Maria Rova Examinator: Thomas Nilsson Karlstads universitet Karlstad Tfn Fax

2 Abstract The perchlorates and chlorates which today exist in nature mainly comes from human effluents. These effluents, caused by the production of rocket fuel, fertilizers, herbicides and generated as a byproduct of chlorine bleaching of pulp, creates both environmental and health problems. Degradation by microorganisms has proven to be the most efficient way to reduce these impurities from waters. Chlorate reducing bacteria use the enzymes chlorate reductase and chlorite dismutase to break down the chlorate to chloride and oxygen. This type of treatment requires that an anaerobic environment is maintained. Studies of the regulation of the enzyme expression are to develop this process so that it would be possible to perform in the presence of oxygen. A studied chlorate reducing species is Ideonella dechloratans. In earlier work, the genes clr for chlorate reductase and cld for chlorite dismutase in I. dechloratans have been sequenced and probable promoter sequences have been cloned into plasmid pqlacz1. The promoter sequence for cld contains a sequence similar to FNR. In E. coli FNR is involved in the regulation of proteins that is part of the anaerobic metabolism. In the present study the expression of the clones Clr1-4 and Cld1-4 in E. coli strain XL-1 Blue was studied. As the construction of the plasmids in these had not been fully characterized, digestion and PCR were first performed to verify the constructions. It was found that the clones could only be digested by one of the two enzymes used for the cloning procedure. Attempts to amplify the inserts by PCR failed. β-galactosidase assay was performed on XL-1 Blue with and without the plasmid and with the eight clones Cld1-4 and Clr1-4. The results showed that XL-1 Blue with the plasmid pqlacz1 gave only a low background expression and it seems suitable for use in β-galactosidase assay. Assays on the eight clones showed that several of these gave expression of β-galactosidase indicating that they contain the promoter sequences for genes clr and cld. Furthermore, β-galaktosidas assay also showed a tendency for the anaerobic culture conditions to result in a higher expression than the aerobic. That digests and PCR, in contrast to the results of β-galactosidase assay, did not show any insert could be explained by changes by cloning in the area of one of the cleavage sites. 2

3 Sammanfattning De perklorater och klorater som idag finns i naturen kommer främst från mänskliga utsläpp. Dessa utsläpp, som orsakas av tillverkning av raketbränsle, gödnings- och ogräsmedel samt uppkommer som biprodukt vid klorblekning av pappersmassa, skapar både miljö och hälsoproblem. Nedbrytning med hjälp av mikroorganismer har visat sig vara det mest effektiva sättet att rena vatten från dess föroreningar. Kloratnedbrytande bakterier använder enzymerna kloratreduktas och kloritdismutas för att bryta ner klorat till klor och syre. Denna typ av reningsprocess kräver idag att en anaerob miljö upprätthålls. För att kunna utveckla denna process, så att den skulle gå att utföra i närvaro av syre, behöver regleringen av uttrycket av enzymerna studeras. En kloratreducerande bakterie som studerats är Ideonella dechloratans. I tidigare arbeten har generna clr för kloratreduktas och cld för kloritdismutas i I. dechloratans sekvensbestämts och troliga promotorsekvenser för dessa har klonats in i plasmiden pqlacz1. Promotorsekvensen för clr innehåller en FNR-liknande sekvens. I E. coli ingår FNR i regelringen av proteiner som ingår i den anaeroba metabolismen. I detta arbete har uttrycket av klonerna Cld1-4 och Clr1-4 i E. coli stammen XL-1 Blue undersökts. Då konstruktionerna av plasmiderna i dessa inte var helt karaktäriserade utfördes först klyvningar och PCR för att verifiera konstruktionerna. Det visade sig att klonerna endast kunde klyvas med det ena av de två enzymer som använts vid kloningsproceduren. Försöken att amplifiera inserten med PCR misslyckades. β-galaktosidas assay utfördes på XL-1 Blue med och utan plasmid samt med de åtta klonerna Cld1-4 och Clr1-4. Resultaten visade att XL-1 Blue med plasmid pqlacz1 endast gav ett lågt bakgrundsuttryck så den verkar var lämplig att använda vid β-galaktosidas assay. Analysen av de åtta klonerna visade att ett flertal av dessa gav ett uttryck av β-galaktosidas vilket indikerar att de innehåller promotorsekvenser för generna clr och cld. Vidare fanns vid β-galaktosidas assay även en tendens till att de anaeroba odlingsbetingelserna gav ett större uttryck än de aeroba. Att klyvningar och PCR, i motsats till resultaten vid β-galaktosidas assay, inte visar på några insert kan förklaras med att området kring det ena klyvningssätet har blivit förändrat vid kloning. 3

4 Förkortningar bp Baspar Cld Clr FNR gdna IPTG kda LB OD ONPG PCR MOPS ÖN Kloritdismutas Kloratreduktas Fumarat Nitratreduktas Regulator Genomiskt DNA Isopropyl- β-d-1-thiogalaktopyranosid kilo Dalton Luria Bertani broth Optisk densitet o-nitrofenyl-β-d-galaktosid Polymerase chain reaction 3 - [N-morfolino] propansulfonsyra Över natt 4

5 Innehållsförteckning Abstract... 2 Sammanfattning... 3 Förkortningar Inledning Oxoklorater Ideonella dechloratans Genreglering pqlacz Syfte Material och metod Bakteriestammar och kolonier Plasmidpreparation Klyvningar PCR Gelelektrofores Odling i minimalmedium β-galactosidas assay Resultat och Diskussion Plasmidpreparation Klyvningar PCR Odling med minimalmedium β-galaktosidas assay Litteraturförteckning Appendix I : Recept LB-medium MOPS-medium Medium A Z-buffert xTAE-buffert Appendix II: molekylviksmarkörer O GeneRuler Low Range DNA Ladder, ready-to-use

6 Lambda DNA/Eco1301 (Styl) Marker, Appendix III: Gensekvenser Gensekvens för kloritdismutas: Gensekvens för kloratreduktas Appendix IV Rådata för β-galaktosidas assay

7 1 Inledning 1.1 Oxoklorater Perklorater och klorater förekommer naturligt endast i små mängder. Det är först nyligen med avancerade instrument som det framkommit att de kan ha ursprung i naturliga processer. Bland annat har försök visat att det med hjälp av olika atmosfäriska processer, som exempelvis elektriska urladdningar, går att skapa perklorater. Vidare tyder även fynd av perklorater i snö- och regnprover på att det finns ett atmosfäriskt ursprung [1]. Dock har större delen av de perklorater och klorater som finns i miljön idag ett mänskligt ursprung. Dessa kommer från olika typer av utsläpp så som tillverkning av raketbränsle, gödnings- samt ogräsmedel [2]. Inom pappersindustrin används klorindioxid(clo 2 ) som blekningsmedel vilket orsakar klorater i avloppsvattnet [3]. Dessa utsläpp skapar både miljö- och hälsoproblem. I Östersjön har det visast att både brunalger och blåstång påverkas toxiskt redan vid låga halter av klorater [4, 5]. Hos däggdjur har det vistas att perklorater påverkar sköldkörteln genom att hindra tyroideahormon att bildas. Detta sker genom att perklorater binder till Na + /I - symporten vilket blockerar intaget av jod till tyroidea [6]. Mikroorganismer som använder klorater eller perklorater som terminal elektronacceptor anses vara det mest effektiva sättet att rena perklorat- och kloratförorenat vatten. Processen sker i tre steg hos perkloratreducerande bakterier och i två steg hos kloratreducerande bakterier enligt: Bakterier som kan använda perklorat som elektronacceptor reducerar med hjälp av perkloratreduktas först perklorat till klorat och sedan klorat till klorit. Kloratreducerande bakterier kan inte bryta ner perklorater utan reducerar endast klorat till klorit med enzymet kloratreduktas. I båda dessa bakterietyper bryts sedan klorit ner av kloritdismutas. I denna process ingår en ovanlig mekanism där en syre-syre bindningen skapas. Som slutprodukt fås molekylärt syre och klor. Syret kan sedan användas som respiratorisk elektronacceptor [7]. Denna reningsprocess kräver idag att en anaerob miljö upprätthålls. Om regleringen av kloratreduktas och kloritdismutas kan modifieras så att dessa enzymer uttrycks i större utsträckning även i en aerob miljö skulle effektivare och billigare reningsprocesser skapas. För att kunna göra detta är ökad kunskap om dessa reglerande mekanismer viktig. 7

8 1.2 Ideonella dechloratans Idag har över 50 olika arter som kan reducera klorater hittats. En av dessa är den gramnegativa bakterien Ideonella dechloratans som isolerats ur slam från ett reningsverk. I. dechloratans är faklutivt anaerob och kan använda klorat som elektronacceptor i anaerob miljö, men kan inte reducera perklorater [8]. I periplasman hos I. dechloratans hittas enzymerna kloratreduktas och kloritdismutas [9]. Kloratreduktas består av tre subenheter som kodas av generna clra, clrb och clrc, genklustret innehåller även clrd som kodar för ett chaperon som hjälper till vid bildningen av komplexet. Proteinet innehåller bland annat järn och hemb och har en total molekylvikt på 160kDa [10]. Kloritdismutas som är ett hemprotein består av fyra lika stora subenheter och har en total molekylvikt på 25kDa [11]. Gensekvenserna för dessa enzym har bestämts och visas i Appendix III [12, 13]. Det har visat sig att dessa gener befinner sig i ett genkluster där cld transkriberas åt motsatt håll mot clr, se figur 1, [10]. Figur 1. Genklustret för generna som ingår i kloratmetabolismen i Ideonella dechloratans. Pilen markerar vart den FNR-liknande sekvensen finns. Vid jämförelse av enzymaktiviteten och uttryck av mrna för Cld och Clr ökar uttrycket fem respektive tio gånger vid övergång från aerob till anaerob odling med klorat; detta visar på att anaerob miljö ökar transkriptionen. Ökningen av aktiviteten hos Cld är motsvarande mot ökningen av mrna medan motsvarande ökning hos Clr endast motsvarar 1/20 av aktivitetsökningen och därmed kan det antas att även andra processer än transkription reglerar Clr. Tester har även gjorts där det tillsattes klorat till den aeroba miljön utan att varken aktivitet eller mrna nivåer ökade mot aerob miljö utan syre [14]. 1.3 Genreglering För att cellen inte ska behöva uttrycka alla gener på samma gång finns flera olika nivåer av reglering. På transkriptionsnivå kan reglering ske genom att proteiner; repressorer eller aktivatorer, binder till DNA vilket kan inhibera eller stimulera inbindningen av RNApolymeraset. Dessa proteiner binder till specifika platser på DNA, oftast i närhet av promotorregionen, och deras inbindning regleras av bindning till signalmolekyler. Signalmolekylernas bindning orsakar strukturell förändring vilket ändrar proteinernas affinitet för DNA [15]. Fakultivt anaeroba bakterier kan växla mellan att leva i en syrerik eller syrefattig miljö och behöver då kunna reglera de olika gener som krävs för aerob respektive anaerob metabolism. Flera olika reglersystem för detta har hittats varav ett av dessa är FNR-systemet hos E. coli. Bindning mellan FNR-proteiner och syremolekyler påverkar inbindningen av dessa proteiner till en specifik sekvens uppströms från transkriptionsstart, FNR-boxen [16]. Detta system reglerar ett stort antal gener som är involverade i den anaeroba metabolismen. Homologer till detta system har även hittats hos andra arter [17]. Uppströms från translationsstart av cld hos I. dechloratans finns en sekvens som har stora likheter med FNR-boxens karaktäristiska sekvens (TTGAT----ATCAA) [9, 18]. I Appendix III finns denna sekvens markerad. 8

9 1.4 pqlacz För att kontrollera om en promotor för en specifik gen är aktiv i olika tillväxtförhållanden kan en reportervektor användas. Med hjälp av denna typ av plasmid kan en reglerande sekvens kopplas samman med en reportergen som har en detekterbar produkt och föras in i en cell. pqlacz1 är en broad-hoast-range reportervektor vilket innebär att den kan användas i ett flertal olika bakterier. Plasmiden ingår i en serie på tre med olika antibiotikaresistens, pqlacz1 är spectinomycinresistent. Vidare är den är baserad på IncQ replikonet som är aktivt i ett flertal bakterier och är kompatibelt med överföringssystem baserade på IncP [19]. Ett replikon är en del av en kromosom som replikeras från en specifik replikationsstart. Figur 2. Konstruktionen för pqlacz1. I plasmiden finns reportergenen lacz som kodar för β-galaktosidas nedströms från polylinkerområdet, se figur 2. Detta medför att när promotorn som satts in i plasmiden är aktiverad kommer β-galaktosidas att uttryckas. Mängden uttryckt β-galaktosidas kan enkelt mätas då enzymet hydrolyserar ONPG vilket ger produkterna o-nitrofenol och galaktos. Om ONPG tillsats i överskott kommer mängden bildad o-nitrofenol att vara proportionell mot reaktionens tid samt mängden enzym. O-nitrofenol har en gul färg vars absorbans kan mätas vid 420 nm [20]. 9

10 2 Syfte Syftet med detta examensarbete är att studera om promotorregioner för cld och clr ger genuttryck i E. coli och om detta utryck varierar mellan aeroba och anaeroba odlingsbetingelser. För detta ändamål har används kloner erhållna i tidigare examensarbeten där sekvenserna uppströms cld och clr amplifierats och ligerats in i pqlacz-1. Konstruktionen av dessa var dock inte helt utredd och ytterligare karaktärisering krävdes av dem innan expressionsstudien kunde genomföras. 10

11 3 Material och metod 3.1 Bakteriestammar och kloner I detta arbete har E. coli av stammen XL-1 Blue används. XL-1 Blue har en defekt hos genen lacz som gör att inget aktivt β-galaktosidas produceras. I de olika försöken har denna bakterie använts som den är eller med plasmiden pqlacz1 insatt. Även har åtta kloner av XL-1 Blue, som konstrueras som del av examensarbeten våren 2012, använts [22, 23]. Dessa kloner innehåller plasmiden pqlacz1 med insert av troliga promotorsekvenser för cld respektive clr. Dessa sekvenser visas i Appendix III och har valts utifrån jämförelse av promotorsekvenser hos andra prokaryoter. Dessa kloner omnämns som Cld1-4 samt Clr1-4. Som kontroll i β- galaktosidas assayen användes även stammen SH7Met, denna är positiv för lacz och kan producerar β-galaktosidas vid närvaro av laktos eller laktosanalogen IPTG. 3.2 Plasmidpreparation Plasmidpreparationer gjordes på de åtta klonerna. Till respektive preparation användes 15 ml kultur odlad i LB-medium, se Appendix I, i timmar. Varje odling hade 100 µg/ml spectinomycin tillsatt. Framreningarna utfördes med E.Z.N.A., Plasmid Mini Kit 1, D , från OMEGA bio-tek utifrån protokollet för Low Copy-Numer Plasmid. För att få en så hög koncentration som möjligt användes minsta rekommenderade mängden eluerings buffert: 30 µl. Koncentration och renhet av plasmiderna bestämdes genom spektrofotometrisk mätning vid 260 och 280 nm. Kvoten av A 260 /A2 80 ger ett mått på renheten av DNA då det visar på förhållandet mellan DNA och proteiner, ett värde över 1,8 anses som ett rent prov. Absorbansen vid 260 nm används för koncentrationsbestämning då 1 A 260 motsvarar 50 µg DNA/ml. 3.3 Klyvningar Inledningsvis utfördes klyvningar av de framrenade plasmiderna med både BamHI (ER0051) och EcoRI (ER0271), från Fermentas, i 2xTango buffert en timme vid 37 C enligt tillverkarens protokoll. För att kontrollera dubbelklyvningen utfördes enkelklyvningar med respektive restriktionsenzym var för sig vid samma förhållanden som ovan. Med EcoRI gjordes även ytterligare kontroller där 5-30 U/µg DNA av enzymet tillsattes i antingen 2xTangoBuffert eller 1xEcoRI Buffert. Som kontroll av enzymfunktionen hos EcoRI gjordes även klyvningar av λdna. Klyvningsförsök utfördes även med SmaI (ER0661) i 1xTango Buffert vid 30 C i en timme. 3.4 PCR För att söka efter inserten utfördes även PCR med de framrenade plasmiderna från Clr1-4 samt Cld1-4 som templat. Som positiv kontroll användes genomiskt DNA från I. dechloratans (19 ng/µl) och som negativkontroll av plasmiden pqlacz utan insert (20 ng/µl). 1µl templat blandades med 49µl av mastermixen som gjordes enligt receptet nedan: 10x Taq Buffert 5 µl dntp Mix 10 mm 1 µl UP primer 2 µm 5 µl LP primer 2 µm 5 µl 11

12 MgCl 25 mm 4 µl Taq DNA polymeras 5 u/µl 0,5 µl Autoklaverat vatten 28,5 µl Följande program användes: 1. 1x 94 C 5 min 2. 35x (94 C 1 min/ 62 C 0,5 min/ 72 C 1 min) 3. 1x 72 C 5 min 4. 4 C Tabell 1. Sekvenser för primrarna och förväntad längd på produkterna. Gen Primersekven 5 3 Fragmentets förväntade längd Cld undre primer GCG CCT GCA GGC TGG GCG GCT 222bp TGG TC Cld övre primer GGG CAA GCT TGC GAG GTG GTC 222bp GGC GTC AGT Clr undre primer GCG CCT GCA ATG TCG GCT GCT 569bp TT G Cld övre primer GGG CAA GCT TCT GCG GCT GGT CTA TCG 569bp Då Taq polymeaset tog slut användes till de sista PCR försöken HotStarTaq Plus Mastermix Kit från QIAGEN. HotStarTaq Plus Master Mix, 2x 25 µl UP primer 2 µm 2,5 µl LP primer 2 µm 2,5 µl Autoklaverat vatten 19 µl Templat DNA 19 ng/µl 1 µl Samma program som tidigare vid tidigare försök användes. 3.5 Gelelektrofores För kontroll av klyvningsförsöken sattes först 1 µl av produkten på 0,6 % agarosgel och gelelektrofores kördes vid 100 V i 30 min. Som markör användes Lambda DNA/Eco1301 (styi) Marker, 16 #SM0161 från Fermentas, se Appendix II. För att sedan visualisera inserten sattes resterande material (ungefär 18 µl) på 3 % agarosgel och kördes vid 90V i 35min. Här användes O Generuler Low Range DNA Ladder, ready-to-use, #SM1203 från Fermentas, se Appendix II. För kontroll av PCR-produkterna utfördes gelelektrofores på 3 % agarosgel på samma sätt som efter klyvningsförsöken. I respektive brunn sattes 5 µl produkt. Alla geler färgades ungefär 15 min med 2 µg/ml etidiumbromid. 12

13 3.6 Odling i minimalmedium Odling av de olika E. coli stammar som användes i β-galaktosidas assayen skedde i flera steg. Först togs bakteriekultur odlad på LB-plattor till 5 ml LB-medium, se Appendix I, som ÖNkulturer i Falconrör. Detta centrifugerades sedan 5 min vid 3500 rpm och pelleten resuspenderades och överfördes till cirka 50 ml MOPS-medium modifierat enligt [23], se Appendix I. Glukos som kolkälla byttes mot 0,1 volym % glycerol och till anaerobodlingarna tillsattes 40 mm NaNO 3 som elektronacceptor. Till odlingarna med XL-1 Blue tillsattes 40 mg/l tiamin och till SH7Met 40 mg/l tiamin och 20 mg/l metionin. Dessa odlingar centrifugerades åter 5 min vid 3500 rpm efter ca ett dygns tillväxt och ympades över till nytt MOPS-medium. Vidare ympningar gjordes genom att 5 ml kultur fördes över till nytt medium. Efter problem med odling i MOPS-mediet utfördes odlingar i ett medium som använts på laboration i kursen fortsättningskurs i biokemi. Detta medium omnämns medium A, se Appendix I. Även här gjordes först ÖN-kulturer i 5 ml LB-medium innan de ympades över genom centrifugering till medium A. Sedan ympades kulturerna vid behov för att hålla dem på ett OD 600 mellan 0,2-1,0 Alla aeroba odlingar odlades i 50 ml medium i antingen 250 eller 100 ml kolvar med bommullspropp. De anaeroba odlingarna gjordes i 50 ml kolvar som fylldes och förslöts med gummikork. 3.7 β-galactosidas assay I medium A odlades de olika E. coli stammarna SH7Met, XL-1 Blue, Xl-1 Blue med pqlacz1, XL-1Blue klon Clr1-4 samt XL-1 Blue klon Cld1-4. Alla de olika kulturerna odlades både aerobt och anaerobt, kulturerna utan insert odlades även med och utan IPTG. När odlingskulturerna nått ett OD, mätt vid 600 nm, mellan 0,3-0,6 sattes de på isbad 20 min för att stoppa tillväxten. Därefter tillsattes 0,5 ml Z-buffert, se Appendix I, samt 0,5 ml av kulturen till rena eppendorfrör och vändes några gånger för att blanda. Samtidigt togs 1 ml av kulturen till en OD mätning vid 600 nm. Därefter tillsattes 1 droppe toluen och rören vortexades 10 s innan de sattes i värmeskåp på 37 C med öppna lock tills toluenen dunstat, ca 40 min. Rören placerades i 5 min i 28 C vattenbad innan 0,2 mg ONPG (4 mg/ml) tillsattes och tidur startades. Reaktionen fick fortskrida i vattenbadet till det uppstod en ordentligt gul färg. Därefter mättes OD vid 420 nm samt 550 nm och Miller unit beräknades enligt nedanstående formel [20]: OD 420 motsvarar absorptionen av o-nitrofenol, OD 550 *1,75 räknar bort den ljusspridning som cellerna i provet orsakar vid 420 nm, OD 600 speglar celltätheten precis innan reaktionen, t motsvarar tiden för reaktionen i minuter och v tillsatt volym av kulturen i ml. 13

14 4 Resultat och Diskussion 4.1 Plasmidpreparation Vid plasmidpreparationerna framrenads DNA med en koncentration mellan ng/µl och dessa framreningar hade en renhet kring 1, Klyvningar Vid de första försöken av klyvningar användes både BamHI och EcoRI för klyvning av Cld1 och 4 samt Clr1 och 4. Dessa försök resulterade i att de klyvda plasmiderna med Cld1, Cld1 och Cld4 som sattes på gel visade en tydlig skillnad mot motsvarande oklyvda plasmid, viket kan ses i figur 3A och B. Detta indikerar att dessa plasmider har blivit klyvda. Klyvningen av Cld1 visade inte lika stor skillnad mot den oklyvda plasmiden, denna klövs ytterligare en timme vilket gav en tydligare skillnad. De klyvda produkterna sattes sedan på en 3 % agarosgel för att visualisera inserten. Detta upprepades för alla åtta klonerna utan att något band syntes vid de förväntade 569bp för Clr eller 222bp för Cld, se figur 3C. Det enda som ses på dessa geler är plasmiden som ligger kvar i eller strax under brunnen. Att de oklyvda plasmiderna visar fler band än de oklyvda beror på att oklyvd är plasmiden cirkulär och kan då tvinnas på olika sätt. A) B) C) Figur 3. Klyvningsförsök med BamHI och EcoRI samtidigt. I A) samt B) är gelerna som körts 0,6 % agarosgeler och i C) 3 % agarosgel. I A) ses från vänster Clr1 oklyvd, Clr1 klyvd, markören Lambda DNA/Eco1301 (styi) Marker, 16, Cld1 klyvd, Cld1 oklyvd. I B) ses från vänster Clr4 oklyvd, Clr4 klyvd, markören Lambda DNA/Eco1301 (styi) Marker, 16, Cld4 klyvd, Cld4 oklyvd. I C) ses markören O Generuler Low Range DNA Ladder till vänster om klyvd Clr1. För att kontrollera att båda enzymerna och inte bara det ena klöv gjordes försök där Clr4 klövs med bara EcoRI, bara BamHI samt dem båda tillsammans. I figur 4A ses att bandet för klyvningen med EcoRI har vandrat längre än de andra banden medan banden för klyvning med bara BamHI och klyvning med båda enzymerna vandrat lika långt. Detta indikerar att EcoRI inte klyver och att det endast är BamHI som klyver i försöket med båda enzymen. Vid jämförelse av figur 3B och 4A kan det även notera att bandet för klyvningen med bara EcoRI har vandrat ungefär lika långt som det tydligaste i den oklyvda plasmiden. Detta stärker ytterligare misstankar om att EcoRI inte klyver. För att vidare undersöka klyvning med EcoRI gjordes försök där enzymet användes i olika koncentrationer i 2xTangobuffert och i EcoRI buffert. För att testa enzymets funktion klövs även λ-dna. Som ses i figur 4B och C klyver EcoRI ingen av Cld4 och Cld1 i någon av de olika buffertarna. Vidare ses att λ-dna klyvts 14

15 vilket visar att enzymet fungerar. Detta indikerar att det är något i klyvningssätet i plasmiden som gör att klyvning med EcoRI inte utförs. Att det inte går att klyva med både BamHI och EcoRI samtidigt medför att det inte går att undersöka om klonerna innehåller insert av förväntad längd. I regionen för klyvningssäten i QlacZ1 finns ej heller något annat klyvningssäte kvar som går att använda för att klyva ut insertet, se figur 2. A) B) C) Figur 4. Kontroll av restriktionsenzymerna EcoRI och BamHI, alla tre geler 0,6% agarosgeler med markören Lambda DNA/Eco1301 (styi) Marker, 16. I A) ses från vänster efter markören klyvning av Clr4 med BamHI, EcoRI samt med båda enzymer. I B) har klyvningar med EcoRI i EcoRI Buffert gjorts. Närmast makören syns λdna klyvd, därefter syns Cld4 klyvd med 5U/µg DNA, 10U/µgDNA, 20U/µgDNA och 30U/µg DNA av enzymet, som positivkontroll finns därefter Cld4 klyvd med båda enzymerna och som negativ kontroll Cld4 oklyd, slutligen syns λdna oklyvd. I C) har EcoRI klyft i 2xTango Buffert, från markören syns först Cld4 klyvd med 10U/µg DNA och 20U/µg DNA samt okyvd, därefter Clr1 klyvd med 30U/µg samt oklyvd och slutligen Cld4 klyvd med båda enzymerna. För att undersöka plasmiderna ytterligare gjordes klyvningar med SmaI. Då klyvningssätet för SmaI är beläget mellan sätet för BamHI och EcoRI, se figur 2, bör detta säte inte finnas kvar i plasmiden om denna blivit klyvd korrekt vid kloning. I figur 5A ses resultatet av klyvningar av Clr1, Clr4 och Cld1 med SmaI. Det visar att ingen av klonerna har klyfts vilket indikerar att SmaI-sätet har försvunnit vid kloningen. I figur 5B ses att pqlacz1 har linjäriserats med SmaI vilket visar att den ursprungliga plasmiden innehåller ett SmaI-säte som förväntat och att klyvningen fungerar. A) B) Figur 5. Klyvningar med SmaI. Den körda gelerna är 0,6 % agarosgeler med markören Lambda DNA/Eco1301 (styi) Marker, 16. I A)kommer efter markören Clr1 klyvd, Clr4 klyvd, Clr1 oklyvd, Cld1 klyvd, Cld1 oklyvd, pqlacz1 kluvd och pqlacz1 oklyvd. I B) ses samma klyvningar som i A) men i ordningen från vänster markör, Clr1 klyvd, Cld1 klyvd, Clr4 klyvd, Cld1 oklyvd, Clr1 oklyvd, pqlacz1 klyvd, pqlacz1 oklyvd. 15

16 4.3 PCR Eftersom det inte var möjligt att klyva ut inserten med BamHI och EcoRI utfördes PCR för att söka efter inserten. När den första mastermixen med Taq Polymeras användes fanns hela tiden ett svagt band i den negativa kontrollen. Den plasmid som användes kommer från en plasmidpreparation från ett tidigare examensarbete och det är troligt att denna har blivit kontaminerad. Vidare syntes även tydliga band vid ca 60 bp. Dessa band är för stora för att endast vara rester av de 30bp stora primrarna, utan indikerar att det bildas primerdimerer. Att de är tydliga kan vara ett tecken på att dessa har amplifierats. Då HotStarTaq Plus mastermixen används försvinner dessa band helt vid PCR av Cld1-4 och bleknar hos produkterna från Clr1-4, se figur 6. Detta beror på att detta Taq polymeras är inaktivt vid rumstemperatur och aktiveras efter 5 min vid 95 C. Detta hindrar att amplifiering av ospecifika DNA-sekvenser och primerdimerer på grund av inbindning av primrarna vid preparation av proverna sker. I figur 6 ses att ingen av de olika klonerna gav ett band där inserten förväntades; 222bp för Cld och 569bp för Clr. Samtidigt gav den positiva kontrollen ett band i förväntad nivå vilket visar att PCR-reaktionen utförts korrekt. Att inga produkter ses kan bero på att kloningen misslyckats och inserten inte finns i klonerna. En annan förklaring kan vara att den förändring i klyvningssätet för EcoRI som gör att det inte går att klyva även hindrar primrarna att binda och därmed kan ingen amplifiering utföras. 700bp 500bp 300bp 200bp A) B) Figur 6. PCR med HotStarTaq Plus av A) Clr 1-4 från vänster till höger B) Cld 1-3 från vänster till höger. Båda geler har längst till vänster O generuler low range DNA ladder som markör och efter klonerna finns först plasmiden pqlacz1 som negativ kontroll och sedan gdna från I. dechloratans som positiv kontroll. 16

17 4.4 Odling med minimalmedium Vid ett tidigare examensarbete har försök med kolonihybridisering indikerat att klonerna Clr1-4 och Cld1-4 innehåller insert [22]. Detta motiverade till att gå vidare med expressionsstudie trots att klyvningar och PCR inte kunde visa något insert. Till studien odlades först XL-1 Blue med ympning direkt från LB-platta till MOPS-mediet, både aeroba och anaeroba odlingar gjordes. Detta tillvägagångssätt visade efter ett dygn ingen tillväxt. XL-1 Blue, XL-1 Blue pqlacz1 och SH7Met odlades sedan, enligt beskrivning i material och metoddelen, som ÖN-kulturer i LB-medium innan de ympades över i MOPS-medium. Dessa kulturer växte till en början från ett OD 600 på 0,2 till 0,6 i aerob odling samt från 0,2 till 0,4 i den anaeroba odlingen. Vidare ympningar lede till en långsammare tillväxt och när kulturerna späddes kraftigt upphörde tillväxten. Vid odling i medium A växte alla de aeroba odlingarna från ett OD 600 på ca 0,2 till 1,0 över natt. De anaeroba odlingarna växte över natten från ca 0,2 till ungefär 0,5, de anaeroba odlingarna av SH7Met hade en tendens att växa lite långsammare än XL-1 Blue och XL-1 Blue pqlacz1. De kulturer som hade växt till ett OD 600 över 0,8 ympades om till ca 0,2. Kulturerna skördades till β-galaktosidas assay vi OD 600 mellan 0,27 och 0, β-galaktosidas assay För att kontrollera att stammen XL-1 Blue var lämplig att använda utfördes β-galaktosidas assay på aeroba och anaeroba odlingar, med och utan IPTG, av XL-1 Blue. Analysen utfördes även med XL-1 Blue pqlacz1 odlad under samma förhållanden för att bedöma om plasmiden uttryckte något β-galaktosidas utan insert. Som positiv kontroll användes SH7Met, som förväntades ge uttryck av β-galaktosidas i närvaro av IPTG. Tabell 2 visar att uttrycket av β- galaktosidas från XL-1 Blue resulterade i mellan 0-1,7 Miller units, hos XL-1 Blue pqlacz1 varierade resultatet mellan Miller units och SH7Met odlad med IPTG resulterade i ett värde på 270 Miller units. Detta resultat visar att XL-1 Blue inte uttrycker något β- galaktosidas. Uttrycket hos XL-1 Blue pqlacz1 är som störst 1/10 av det positiva uttrycket hos SH7Met vilket visar att plasmiden endast ger ett svagt bakgrundsuttryck. Konstruktionen kan därmed betraktas lämplig att använda som reportervektor i en β-galaktosidas assay. Tabell 2. Miller units för E. coli stammarna SH7Met, XL-1 Blue med pqlacz1 samt XL-1 Blue utan plasmid vid aerob och anaerob odling med och utan IPTG. Aerob Aerob + IPTG Anaerob Anaerob + IPTG SH7Met 4, ,5 XL-1Blue pqlacz XL-1 Blue 0 0,85 0,23 1,7 I tabell 3 visas att vid analys utav klonerna gav Cld1, Cld3 och Clr3 ett resultat på 0-1,4 Miller units, detta är i samma storlek som resultatet för XL-1 Blue och det kan anses att dessa kloner inte ger något uttryck av β-galaktosidas. Detta indikerar att i dessa kloner finns inga sekvenser som kan fungera som promotorer i E. coli. Detta kan bero på att dessa insert har blivit förändrade under kloningsproceduren så att eventuella promotorsekvenser förstörts eller att kloningen av dessa inte har lyckats och att de inte innehåller något insert från I. dechloratans. Hos de övriga klonerna, Clr1, 2 och4 samt Cld2 och 4, varierar det aeroba 17

18 uttrycket mellan 50 Miller units hos Clr2 till 240 Miller units hos Clr1 och det anaeroba mellan 100 Miller units hos Cld2 till 250 Miller units hos Clr1, se tabell 3. Dessa resultat är alla högre än bakgrundsuttrycket som XL-1 Blue pqlacz1 ger och de högsta är i samma storleksordning som det positiva uttrycket av β-galaktosidas från SH7Met med IPTG. Detta indikerar att klonerna Clr1, 2 och4 samt Cld2 och 4 innehåller ett insert från I. dechloratans med en sekvens som motsvarar en promotorsekvens. Vid jämförelse mellan aerob och anaerob odling hos respektive klon syns en tendens att den anaeroba odlingen ger ett högre uttryck. Skillnaden mellan det aeroba och det anaeroba uttrycket varierar från att det aeroba är 1,04 gånger så stort hos Clr1 till att vara 2,80 gånger så stort hos Clr2. Att det anaeroba uttrycket skulle vara större än det aeroba stämmer även med förväntningarna. I tidigare studier har mätningar av preparationer från anaeroba odlingar gett både högre enzymaktivitet och högre nivå av mrna än preparationer från aeroba odlingar [14]. Vidare finns den FNRliknande sekvensen som hittats uppströms transkriptionsstart för cld inkluderad i den klonade sekvensen. Detta skulle kunna ge en möjlighet till syrekänslig transkriptionsreglering. Dock visar inte β-galaktosidasmätningarna någon skillnad mellan klonerna för Cld och Clr vars klonade promotorsekvens inte innehåller någon FNR-liknande sekvens. Tabell 3 Miller units för XL-1 Blue pqlacz1 med Clr1-4 och Cld1-4 vid aerob respektive anaerob odling. Aerob Anaerob Aerob Anaerob Clr Cld1 0 0 Clr Cld Cld Clr3 1,4 1,1 Cld3 1,1 0,45 Clr Cld På klonen Cld2 gjordes dubbla försök vilket resulterade i värden som skiljde sig mellan det första och det andra försöket, i båda försöken ger den anaeroba odlingen ett högre värde än den aeroba, men skillnaden är inte lika stor idet andra försöket. Detta visar att metoden inte är helt reproducerbar och om försöken skall upprepas kan standardiseringar behöva göras. Absorbansmätningarna vid 420 nm varierade mellan 0,03 och 0,57. Enligt [20] rekommenderas att dess mätningar ligger mellan 0,6-0,9. Vid utförandet av assayen pågick reaktionen för de prov som snabbast fick en gul färg mellan 5-10 min och för de som inte fick någon gul färg avbröts reaktionen efter en till en och en halv timme. För att få en mer pålitlig mätning skulle det vara lämpligt att låta reaktionerna få fortlöpa under en längre tid för att få ett högre absorbansvärde. 18

19 5 Slutsatser Av de olika klyvningsförsöken kan det konstateras att i plasmiderna finns ett restriktionssäte för BamHI men det verkar inte finnas ett fungerande säte för EcoRI. Vidare saknas sätet för SmaI vilket indikerar att segmentet mellan BamHI och EcoRI är bortplockat. Att klyvning med EcoRI inte fungerar kan indikera att det kan ha skett en förändring av detta restriktionssäte under kloningen. Om så är fallet kan det leda till att inte primrarna binder in korrekt vid PCR och därmed fås inga produkter. Att inga produkter fås kan annars tyda på att inserten inte finns där vilket dock motsägs av resultaten från β-galaktosidas assayen. Då ett flertal av klonerna gav uttryck av β-galaktosidas kan det antas att kloningen av dessa har lyckats och att de sekvenser som valts vid kloningen innehåller promotorsekvenser. De insert som används i detta arbete är gjorda med långa sekvenser för att öka möjligheten att promotorn finns med. I framtida arbeten skulle det vara av intresse att korta ner sekvenserna för att närmare hitta de exakta promotorsekvenserna. Det vore även intressant att göra försök där konstruktionen används i I. dechloratans för att se vilken påverkan bakteriens egna proteiner har på promotorsekvenserna. Slutligen syntes i denna studie en tendens till att det skulle finnas en skillnad mellan aerob och anaerob odling som kan vara intressant att undersöka i framtida arbeten. 19

20 Litteraturförteckning [1] P. K. Dasgupta, P. K. Martinelango, W. A. Jackson, T. A. Anderson, K. Tian, R. W. Tock, och S. Rajagopalan, The Origin of Naturally Occurring Perchlorate: The Role of Atmospheric Processes, Environ. Sci. Technol., vol 39, num 6, ss , Mar [2] D. J. Vanwijk och T. H. Hutchinson, The Ecotoxicity of Chlorate to Aquatic Organisms: A Critical Review, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol 32, num 3, ss , Dec [3] Y. Ni, G. Kubes, och A. Vanheiningen, Mechanism of Chlorate Formation During Bleaching of Kraft Pulp with Chlorine Dioxide, Journal of Pulp and Paper Science, vol 19, num 1, ss J1 J6, Jan [4] A. Rosemarin, K.-J. Lehtinen, M. Notini, och J. Mattson, Effects of pulp mill chlorate on baltic sea algae, Environmental Pollution, vol 85, num 1, ss 3 13, [5] L. Landner, Disappearance of Bladder-Wrack (Fucus vesiculosus L.) in the Baltic Sea: Relation to Pulp-Mill Chlorate, Ambio, num 6, s 387, [6] J. Wolff, Perchlorate and the thyroid gland, Pharmacological Reviews, vol 50, num 1, ss , Mar [7] T. Nilsson, M. Rova, och A. Smedja Bäcklund, Microbial metabolism of oxochlorates: A bioenergetic perspective, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, vol 1827, num 2, ss , Feb [8] A. Malmqvist, T. Welander, E. Moore, A. Ternstrom, G. Molin, och I. Stenstrom, Ideonella-Dechloratans Gen-Nov, Sp-Nov, a New Bacterium Capable of Growing Anaerobically with Chlorate as an Electron-Acceptor, Systematic and Applied Microbiology, vol 17, num 1, ss 58 64, Mar [9] H. Danielsson Thorell, Enzymes and genes for microbial metabolism of oxochlorates / Helena Danielsson Thorell. Karlstad : Division for Chemistry, Department of Biochemistry, Univ., [10] H. Danielsson, T. Stenklo, J. Karlsson, och T. Nilsson, A gene cluster for chlorate metabolism in Ideonella dechloratans, Applied and Environental Microbiology, vol 69, num 9, ss , Sep [11] K. Stenklo, H. Thorell, H. Bergius, R. Aasa, och T. Nilsson, Chlorite dismutase from Ideonella dechloratans, Journal of Biological Inorganic Chemistry, vol 6, num 5 6, ss , Jun [12] Helena Danielsson Thorell, Jan Karlsson, Erik Portelius, och Thomas Nilsson, Cloning, characterisation, and expression of a novel gene encoding chlorite dismutase from Ideonella dechloratans, BBA - Gene Structure and Expression, vol 1577, ss [13] K. Stenklo, Enzymes of chlorate metabolism in Ideonella dechloratans / Katarina Stenklo. Karlstad : Division for Chemistry, Department of Chemistry, Univ., [14] M. Hellberg Lindqvist, N. Johansson, T. Nilsson, och M. Rova, Expression of Chlorite Dismutase and Chlorate Reductase in the Presence of Oxygen and/or Chlorate as the Terminal Electron Acceptor in Ideonella dechloratans, Applied and Environmental Microbiology, vol 78, num 12, ss , Apr [15] A. L. Lehninger, Lehninger principles of biochemistry, 5th ed. New York: W.H. Freeman, [16] S. Becker, G. Holighaus, T. Gabrielczyk, och G. Unden, O2 as the regulatory signal for FNR-dependent gene regulation in Escherichia coli., J. Bacteriol., vol 178, num 15, ss , Jan [17] G. Unden, S. Becker, J. Bongaerts, G. Holighaus, J. Schirawski, och S. Six, O 2 - Sensing and O 2 -dependent gene regulation in facultatively anaerobic bacteria, Archives of Microbiology, vol 164, num 2, ss 81 90, Aug

21 [18] A. Bell, K. Gaston, J. Cole, och S. Busby, Cloning of Binding Sequences for the Escherichia-Coli Transcription Activators, Fnr and Crp - Location of Bases Involved in Discrimination Between Fnr and Crp, Nucleic Acids Research, vol 17, num 10, ss , Maj [19] L. E. O Sullivan, A Series of IncQ-Based Reporter Plasmids for Use in a Range of Gram-Negative Genera, Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 20, num 5, ss , Maj [20] J. H. Miller, Experiments in molecular genetics [by] Jeffrey H. Miller. [Cold Spring Harbor, N.Y.] Cold Spring Harbor Laboratory, [21] D. Ölund, Konstruktion av reporterplasmider innehållande möjliga promotorregioner för kloratredukas respektive kloritdismutas från Ideonella dechloratans, Karlstad, Faculty of Thechnology and Science, C-uppsats, VT [22] C. Huyck, Construction of reporter plasmids for expression studies in the chloratreducing bakterium Ideonella dechloratans, Karlstads Universitet, fakulty of Thechnology and Sience, C-level thesis, Jun [23] V. Stewart och J. Parales, Identification and expression of genes narl and narx of the nar (nitrate reductase) locus in Escherichia coli K-12., J. Bacteriol., vol 170, num 4, ss , Jan

22 Appendix I : Recept LB-medium 10 g Trypton 5 g Jästextrakt 10 g NaCl Späd till 1 liter med dh 2 O. ph justeras till 7,0. MOPS-medium 0,2 M MOPS ställ ph till 7,8 med KOH 400 ml 0,1 M Tricine 40 ml 10 mm FeSO 4 10 ml 286 mm NH 4 Cl 100 ml 0,55 M MgSO 4 10 ml 0,5 M NaCl 100 ml 0,5 M NaHCO 3 20 ml Micronutrienter 10 ml o 0,1 mm Na 2 MoO 4 o 0,1 mm Na 2 SeO 3 o 0,04 mm H 3 BO 3 o 3 µm CoCl 2 o 1 µm CuSO 4 o 8 mm MnCl 2 o 1 µm ZnSO 4 88 mm K 2 HPO 4 Spädes till 1 liter med dh 2 O Medium A 7 g K 2 HPO 4 3 g KH 2 PO 4 0,2 g MgSO 4 * 7H 2 O 2 g (NH 4 ) 2 SO 4 5 mg tiamin 20 mg metionin 0,1 vol-% glycerol Då detta spätts till 1 liter skall ph vara 7,0 22

23 Z-buffert 16,1 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O (0,06 M) 5,5 g NaH 2 PO 4 * H 2 O (0,04 M) 0,75 g KCl (0,01 M) 0,246 g MgSO 4 * 7H 2 O (0,001 M) 2,7 ml β-mercaptoethanol (0,05 M) ph justeras till 7,0. Späd upp till 1 liter. 50xTAE-buffert 242 g Tris-bas 57,2 ml konc ättiksyra 100 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 med NaOH Späd till 1 liter 23

24 Appendix II: molekylviksmarkörer O GeneRuler Low Range DNA Ladder, ready-to-use # SM1203 Lambda DNA/Eco1301 (Styl) Marker, 16 #SM

25 Appendix III: Gensekvenser Gensekvens för kloritdismutas: Sekvens som klonats in som insert i pqlacz, FNR liknade sekvens, cld 1 gctgcaggcc aagtgcggtg gtgaagagag cttcgatctg ggtgttcatc gggcgcgagg 61 tcggcgtcag tgtcgggcgg ttgtccccga gggtcatgtt tgttgagaag tcaatttcca 121 ctggaaacgg catagagcca aaaatatagt gttaagtttc ggagaaactc ttgacttaaa 181 tcaaacacat aaaaaaggag aaatgcgaag attcgtgcac tttccgcttg ctcggcgacc 241 aagccgccca gcggattccg attcttaaca ctggagtaca tcatgaaagt tcgttgcgtt 301 tccttagtcg ccgcagggct cctcaccatc gcaggcagcg caatcggcca accggctcca 361 gcgcccatgc ccgcgatggc accagccgca aagccggcca tgaatacccc agttgatcgg 421 gcgaagatac tcagcgcgcc aggcgtgttt gtggcgttct caacttacaa aattcgtccc 481 gactacttca aagttgcatt ggctgaacgc aaaggtgcag cagatgaagt gatggcggtc 541 ttggaaaagc acaaagaaaa agtgattgtc gacgcctacc tgacgcgcgg ctatgaagcc 601 aagagcgact acttcctgcg cgttcatgcc tacgatgccg tagcggcgca ggcctttctg 661 gtcgatttcc gcgccacccg ctttggcatg tactcggatg tcacggagag cctggtgggt 721 atcaccaagg cgctaaacta tatctccaag gacaagtcgc ccgacctcaa caaggggctt 781 tccggtgcta cctacgccgg tgatgcaccg cgctttgcct tcatgattcc ggtcaagaaa 841 aacgctgatt ggtggaacct gacggacgag cagcgcctca aggagatgga gactcatacg 901 cttccgacgc tgccctttct ggtcaacgtc aagcgcaagc tctaccactc gacggggctc 961 gacgataccg attttattac ctacttcgag accaacgacc tcggagcctt caacaacctg 1021 atgctgtcgc tggccaaggt gccggagaac aagtatcacg tgcgctgggg caatccgacc 1081 gtgctgggta ccatccagcc catcgagaac ctcgtcaaga cgctgtcgat gggcaattga 1141 tggcttgaat gttcggccac caggaacatg gtggccgaac gaatcgaggc gtaaatggct 1201 tcaatagcca aactggacac gctgagtatc ggcccagcct gatacggttc ttcaaacatt 1261 cgcaaaggag ttaagcatga acaagatcgc cgcaattctt ctctctattg gttttctgtc 1321 aattgctgac ggggctttgg cgcaagatgg catgaaaaaa gacactatgg ccaaggaaag 1381 catggcgaaa gaggccatga ccaaggatga catgaaaaaa cctaccatgg gcaaggacgc 1441 aatggctaag gacggcatga tgaaaaaaga tgggatgaag aagggcgcca tgcccaagga Gensekvens för kloratreduktas Sekvens som klonats in som insert i pqlacz, clra, clrb, clrd, clrc 1 atgtactcca gtgttaagaa tcggaatccg ctgggcggct tggtcgccga gcaagcggaa 61 agtgcacgaa tcttcgcatt tctccttttt tatgtgtttg atttaagtca agagtttctc 121 cgaaacttaa cactatattt ttggctctat gccgtttcca gtggaaattg acttctcaac 181 aaacatgacc ctcggtggta caaccgcccg acactgacgc cgacctcgcg cccgatgaac 241 acccagatcg aagctctctt caccaccgca cttggcctgc agccgccctg gtacgtcgcc 301 aaggtcgagc tcaacacagc caagcggcgg atcgacttcg aggtcgagca caccggcgct 361 cgtgctacgt gtccggcgtg tggggccgag ccccagttga tccacgaccg ggtccggcgt 421 agctggcgtc acctggattt ctttcagttc gaagcgtggc tgcatgccgc gattccgcgc 481 gttcagtgca acggctgcgg caagaccacg cagctgccgg tgccgtgggc gcgtgagggg 541 agcggcttta ccctgctgtt cgaggcgctg agtctgtcgc tgtgccgaga gatgccggtg 601 cgccaggcgg ccaaccagtt gcgggttgcc ccgaagcgcc tgtggcgccg cgtgcgccat 661 tacgtcgagg tggcccgtgc caaagacgac atgtcgtgcg tgcgctacgt cgggatcgac 721 gagaccagcg tcaagcgtgg tcacgagtac atcaccgtcg tgcatgacct tgaagccaag 781 cgcttgctgt ttgccacccc ggggcgcggt cacgctacgt tgcaggtctt tgcccaggac 841 atgcgtgcgc acggcggcga tccgctgacc attgagcacg cgtgtatcga catgagcgcg 901 gcctacgcca agggagtcga ccagtcgctg cccaatgccc ggatcagcta cgaccgcttt 961 catgtcgtgg cgctggccaa cgcggcgatg gacgaggtgc gtcgcgaaga gatgcgtagc 1021 tcggcggcag cggtgcgcga agcggtcggc gcacagagca agaagacgct tcgtcagctg 1081 ctgtggggga tgcgcaagaa cccggtgagc tggacccgtg cccagttcga ggcgatgcac 1141 tggctgcaac gctcgaatct gaagagcgcg cgtgcgtggc gcctgaagca ggcactgcgg 1201 ctggtctatc gcgatgcagc cgcgagcaac agcgaggaga tcgcgcaagg tgccatgagc 1261 aaatggctga gctgggcgcg ccgcagccgc ctggagccct tcaagcggct ggccctcacc 1321 ctgaaggagc acctcggcgg cgtcgtgcgc ggcatgctcg acggacgcag caacgcctac 25

26 1381 gttgaagcga tgaacggcct gctccaacag acgaagaccg ccgcccgagg cttccgcaac 1441 atcgagaact tcatcgccat ggcctacctg cgaatgtcca agctcaagca tctaccgcag 1501 aaccccctgg tgccggccgt cgcccgcgac tacgggcgct accgtcatgt ttgttgagaa 1561 gtcaatttcc actggaaacg gcacagagcc atattttttc tccttttgaa cgacaaaacc 1621 atgtttttga aataggcatg gtgagagggg agttgcaagc atcgtgccca gcttcccgat 1681 attttggaaa caagagtcgc atggctcctg tctatttcac tgtcaaaagc agccgacatg 1741 tttgcaacct ggagtccatc aaatgaggaa tcgtcatgaa tagtcccgat gagcacaacg 1801 gccgccgccg gtttctacag ttctctgcgg ccgcgcttgc cagtgcggcc gcatccccca 1861 gtctgtgggc cttttcaaag atccagccca tcgaggatcc gctgaaagac tacccctacc 1921 gcgactggga agacctttac cgaaaggagt ggacctggga ttcagttggc gtcatgacgc 1981 actccaatgg ctgcgtcgct ggttgtgcct ggaatgtgtt cgtgaagaac ggtatcccga 2041 tgcgcgagga gcaaatcagc aagtacccgc aactgcccgg cattccggac atgaatccgc 2101 gcggttgcca aaagggggcg gtgtactgtt cctggtcaaa gcagccggac catatcaagt 2161 ggccgctcaa gcgcgtcggc gaacgcggtg agcgcaaatg gaagcgcatc tcctgggacg 2221 aagcgctcac cgaaatcgcg gacaagatca tcgacacgac ggtgaagcgc ggtcccggca 2281 acatctatat tcccaagcgc cctttcgcag tcatcaccaa cacggcatac acgcggatga 2341 caaagctgct aggggccatc agtccggatg ctacctccat gactggcgat ctctataccg 2401 gcatccagac ggtgcgcgtg ccggcctcaa ccgtgtccac tttcgacgac tggttcacct 2461 ccgacctcat cctgatgtgg cacaagaatc ccatcgtcac gcggattccg gacgcccact 2521 tcctcatgga agcgcgttac aacggcgcgc ggctggtgaa tatctcggcg gactataacc 2581 cgtcctcgat ccactccgac ctgttcgttc cggtgacctc gggtaccgac tcccatcttg 2641 ccgcagcgct agtcaatgtg cttatcgccg gtaaacacta caaggccgac tacctcaagg 2701 agcaaaccgc cctgcccttc ctggtacgca ccgacaacgg taaattccta cgcgagaagg 2761 acttcaaggc ggacggcagc gaccaggtct tctatgtctg ggacaccaag gcgggcaagg 2821 cggtgcttgc acccggcagc atgggcagca aggacaagac cttgaagctc ggcaccatcg 2881 atccggcgct ggagggaaac tttgaaactc atgggatcaa ggtcacgacg gtcttcgagc 2941 gtctgaaggc agaaatcacc ccgtacacgc ccgaggctac ccaggccacc accggtgtgc 3001 atccttccgt tgtacgccaa ttggcaggat ggatagccga atgcaaggcc ttgcgcattc 3061 tcgacggcta caacaaccag aagcacttcg acggattcca gtgcggtcgc ctgaagatat 3121 tgattctgac cctgatcggc caccatggca cgaccggctc catcgacacc accttcgagg 3181 gctggcggct ggaaggcaac tctgaactgg gcacggtgaa gggcaaaccc ggacgtagcg 3241 tctccgcagt gctggcccag tgggtgtggg gcgaacagta ccaacgctcg aaagactact 3301 ttaatgatgc gcagctacgc gaggagctgg gcttcggcgt cgacgagatg gagtcaatgc 3361 gcaaggaatc cgaggccaac ggctggatgc ccaattggca gtccatcaag gagccggtgg 3421 tcagcatcac aggcggcatc aacatgttcg ccacctccaa cggctaccag catcttcgag 3481 acaacttcct caagcgctgc gagctgaacg tcgtggtgga tttccgtctc aactccgggg 3541 cgatgtatgc cgatatcgtg ctgccggcgg cggaaaatac cgagaagctg gacattcgcg 3601 agacctcggt gacccgtttc atccatgcct tcggccaacc ggtcaagccc atgtacgagc 3661 gcaagaccga ctggcagatc atggtggcgc tcgcagccaa gatccaggag cgtgccaagg 3721 cgcgcggcat cgctcgcgta gatgatcccg agatcaagag cggcatcgac ttcgacaaga 3781 tctacgacga gttcaccatg aacggcaagg ttgtcaccga cgagcaggcg gtgcgcttcg 3841 tcatggacaa ctccaaggcc ctcggtccgg gcacctatga agaagtgatg aaaaacggct 3901 tcgtcgcggt cggtccctcg gctggcaaga ccgggccggt gccgaaggac aaaccgtacc 3961 gccccttcac agtgaacgtg accgacaaga agccgtacgg cacgcttacc ggacgcctgc 4021 agttttatgt ggaccacgac tggtttcagc gccttggggc caccgtgccc aagccccagt 4081 accgaggggg cgttctgggg ccgaaaaagt acccctttgt gcgcaactcg ccccatgccc 4141 gttggggtgt ccactccttc gcgcgtaccg agcaatggat gctgcgccac caacgcggcg 4201 agccggatgt gcgtatgagc cccaaggcca tggcagccaa ggggattaag gatggcgata 4261 tggtccgcat tttcaatgac tcgggtgagt tctttgccgt ggtcaaggcc atgcccgcat 4321 tgcccgacaa catgctgttc actgagcatg ggtgggaaca gtaccagtac aagaacatga 4381 cccactacaa catggtcagc tcggagctga tcaacccact ggagttggtg ggcggctacg 4441 gccacatcaa gtacacgtcg gggggattca atcctaaccg cattttctac gaaacgacgg 4501 ttgacgtcga gaaggcctga ggaacaaatc atgagtcaaa gacaagtagc ctacgtattc 4561 gatctgaaca agtgcatcgg ctgtcacacc tgcaccatgg cgtgcaaaca attgtggacc 4621 aaccgggacg gtcgcgagta catgtactgg aacaacgtgg agacccgccc cggcaagggc 4681 tatcccaaaa actgggaggg aaaaggcggc ggcttcgacc aggaaggcaa gctaaaaacc 4741 aacggcatca tccccatcat ggccgactat ggcggcagga tcggtgactt caacctgaac 4801 gaggtcctgc tggagggcaa agccgaccag gtggtgcccc atgagaaagc cacctggggc 4861 ccgaactggg acgaagacga gggcaagggc gaattcccga acaaccactc cttttacctg 4921 cctcgcatct gcaaccattg ctccaacccg gcttgcctgg ccgcctgccc caccaaagcg 4981 atctacaaac gccccgaaga cggcattgtg gtggttgacc agacgcgctg ccgtggctac 26

27 5041 cgttactgcg tcaaggcctg cccgtacggc aagatgtatt tcaatttgca gaaaggcaag 5101 tcagagaaat gcatcggctg ctatccgcgc gtcgaaaagg gcgaggcgcc cgcctgcgtc 5161 aagcaatgct cgggtcgcat tcgcttctgg ggctatcgag acgacaaaaa cggtccgatc 5221 tacaagctgg tcgagcaatg gaaagtggcg ctgccgctgc atgccgaata cggcaccgag 5281 cccaacgtct tttacgtgcc gcccatgaac accacgccgc cgccattcga ggaggacggc 5341 cgcctcggcg acaagccacg catcccgatc gaggatctcg aagcgctgtt tggccccggc 5401 gtcaagcagg ctctggcaac gcttgggggt gagatggcca agcggcgcaa ggcgcaggcg 5461 tcggaactca ccgacatcct catcggcttc accaacaagg acaggtacgg cgtatgaaca 5521 ccctcatcga caaccccaaa gccatggcca gcggctatct ggcgatggcc cagatgttct 5581 cttatcccga cgccgacgcc tggcgccgcc tgactgaaaa tgggctggtg gatccggcac 5641 ttggccgtga aacgctggag gcggagtacc tgggcctctt cgagatgggg ggcggcactt 5701 ccacaatgtc cctttacgaa gggcagaacc ggccggaacg cgggcgcgat ggcattctgc 5761 aggagttgtt gcgtttctac gagttcttcg acgtgcacct caatcaggac gagcgggagt 5821 acccagacca tctggtcacc gaactggagt tcctcgcatg gctttgtctg caggagcatg 5881 ccgccctgcg cgacgggcgc gacgcagaac cgtttcaaaa cgctgcgcga gactttctgg 5941 ttcggcactt ggcggcctgg ctgccggatt ttcgccagcg gctagaagcc acggagacca 6001 cttatgcgca gtacggacca acgctgggcg aactggtgga aactcaccgc agccgcctcg 6061 gcgatcagcc acaaaaatcg agagaaatgc aatgaaaaca aacattctag tgaagcgaat 6121 ggcagtgatc ggtctcgccg tcgcggcagc gtgcacgggt gctgctgcag cagcgcaagg 6181 cgccgtgccg caagcgcagc gcatcatccg cgtgctgtcg gtagcggggg gtgacgccgc 6241 gtctccccag gcggccgtct ggaaaaaggc gccgacgacg caggtcacgc tgctaacggc 6301 cttccccggc cacatctcaa tcgtgggcac ggccgcaact cagaagctcg ctgcccaagc 6361 tgtgcgcgct tcagggcggc tattcgtcag gcttgcctgg agcgaccgca ccgccaacac 6421 agtgatgaag gataccgatc agttcctgga cggcgccgca gtagagttcc ccgtcaacgg 6481 taaggtcgcc acgctgccct tcatgggcga tcctgtcaac gtcgtcaatg tgtggcattg 6541 gcgcgccgac gggcgcactt tgaacctgct ggccaaaggt ttcggcactt caacgccggt 6601 gccgaccgag gatctgcgca gtgcgtcggt gcgcaccggc gatggttggg aggtagtcct 6661 cagccgtccg ctgcgggtca aggcagaaga gggcgcgaac ctacagggcc gacggaccat 6721 gccgataggc tttgccgcct gggatggtga gaaccaggaa cgtgacgggc ttaaagccgt 6781 gaccatggag tggtggcagc ttcgcttttg aggacgtaac gacggtggca accgcttggc 6841 atgtattgtg acccgcatac 27