KARBOANHYDRAS RENFRAMSTÄLLNING OCH KARAKTÄRISERING AV ETT ENZYM. Enzymet karboanhydras: Förekomst, egenskaper och funktion

Transkript

1 KARBOANHYDRAS RENFRAMSTÄLLNING OCH KARAKTÄRISERING AV ETT ENZYM Enzymet karboanhydras: Förekomst, egenskaper och funktion Ett enzym är en specialiserad proteinmolekyl, som har förmåga att accelerera en kemisk reaktions hastighet. Livet i alla dess former är beroende av enzymers katalytiska verkan, därför kommer kunskapen om deras struktur och funktion att ha stor betydelse för förståelsen av olika biologiska fenomen. Karboanhydras (CA efter carbonic anhydrase på engelska; systematiskt namn: carbonate hydrolyase, EC ) är ett i naturen allmänt förekommande enzym, som har påträffats hos både växter, djur och vissa bakterier. Det upptäcktes 1932 av Meldrum och Roughton och har sedan dess isolerats framför allt ur de röda blodkropparna hos däggdjur, där enzymet förekommer i ovanligt hög koncentration (1-2 g per liter blodkroppar). Hos de flesta däggdjur förekommer karboanhydras i blodet i två former, s.k. isoenzymer. De har samma enzymatiska egenskaper, men skiljer sig i effektivitet och struktur. Den ena formen är högaktiv och brukar betecknas karboanhydras II, medan den andra är lågaktiv och betecknas karboanhydras I. Därutöver har ytterligare ett tiotal isoenzymer påträffats i andra vävnader hos däggdjur. Alla kända karboanhydraser från djurvärlden är strukturellt besläktade (homologa) med varandra och denna proteinfamilj brukar betecknas α-ca. En annan grupp av karboanhydras med annan strukturell uppbyggnad betecknas β-ca och dessa former finns i flera växter. Även en tredje form av karboanhydras, γ-ca, har påträffats hos ärkebakterier. Karboanhydras är ett zinkinnehållande enzym, där metalljonen är starkt bunden till varje proteinmolekyl. Denna metalljon är nödvändig för aktivitet. Utbyte av zinkjonen mot en koboltjon ger ett fortfarande katalytiskt aktivt enzym. Karboanhydras är dessutom ett mycket stabilt enzym, som bibehåller aktivitet under lång tid i ph-intervallet Det ansågs länge att karboanhydras endast katalyserade den reversibla hydratiseringen av CO 2, vilket sker med ett ovanligt högt k cat (10 6 molekyler CO 2 per sekund och enzymmolekyl). På senare år har man emellertid funnit att enzymet även katalyserar reaktioner hos andra karbonylsystem som hydratisering av aldehyder och hydrolys av estrar, framför allt p-nitrofenylacetat men även andra fenylestrar. Den reversibla hydratiseringen av CO 2 är emellertid den fysiologiskt betydelsefulla aktiviteten hos enzymet. Enzymaktiviteten inhiberas av envärda anjoner och av sulfonamider. Sulfonamidinhiberingen är mycket kraftig och specifik, men endast aromatiska och heterocykliska sulfonamider med en osubstituerad -SO 2 NH 2 -grupp är verksamma. Sulfonamiderna har mycket stor betydelse dels för studierna av karboanhydrasets fysiologiska funktioner och dels för studierna av karboanhydrasets aktiva centrum. Orsaken till inhibering är att hämmaren koordineras till metallatomen. Man kan av detta dra slutsatsen att zinkatomen är en verksam del av enzymets aktiva centrum. Röntgenkristallografiska undersökningar visar dessutom att metallen är bunden med en approximativ tetraedrisk koordination med kväveatomer i imidazolringarna, tillhörande tre histidinrester i proteinet, som tre av liganderna. Den fjärde liganden är en vattenmolekyl. Litt.: S. Lindskog: Pharmacol. Ther. 74 (1997) 1 Berg, Tymoczko, Stryer Biochemistry 6th ed., kap. 9.2.

2 MATERIAL Bovint CA (BCAII Sigma C mg) ca 5 mg/grupp Tris (Scharlau TRO423 reagent grade) HCl pa H 2 SO 4 pa pnpa (10 g Chemicon ICN) Mätkolvar 10 ml Konformade glasrör med gummiproppar ph-referenser (ph 5, 6, 7, 8, 9 ) NaOH pa DEAE-cellulosa (Whatman DE52 försvälld mikrogranulär anjonbytare, VWR , 500 g) HEPES (500 g fri syra ICN ) Glasull Kolonn Slang och propp Muff, klämmare och stativ Provrör och provrörställ Pasteurpipetter och nappar Amicon Ultra-4 (MILLIPORE UFC MWCO går snabbare) Skrivarpapper till Hitachi U2000 Eppendorfrör Spetsar (blå och gula)

3 PACKNING OCH EKVILIBRERING AV EN KOLONN FÖR JONBYTESKROMATOGRAFI SAMT PROVEKVILIBRERING Förberedelser som görs av lab.handledaren 1. Gör 0,08 M Tris-HCl buffert, ph 8,3 till kromatografi och ekvilibrering. Åtgång ca 250 ml 0,08 M Tris-HCl, ph 8,7 per tvåmannagrupp. Späd 130 ml av denna buffert till 0,01 M för ekvilibreringen. 2. Förekvilibrera DEAE-cellulosan så att den är nästan ekvilibrerad, annars kan ekvilibreringen ta flera dagar. Använd 0,2 M Tris- H 2 SO 4, ph 8,3, tills ph för eluatet överenstämmer med buffertens. Fortsätt sedan med 0,01 M Tris-HCl, ph 8,3 tills jonstyrkan för eluatet närmar sig ekvilibreringsbuffertens (uppskattas med konduktivitetsmätning). Vid kontroll av jonstyrka och ph och används 0,01 M Tris- HCl, ph 8,3, som referens. 3. Bered bovint karboanhydrasextrakt, ca 5 ml/grupp med koncentrationen 1 mg/ml. 4. Gör en 0,075 M stamlösning av p-npa, M=181,1 g/mol, i kall vattenfri aceton. Använd en torr mätkolv för att exakt kunna bestämma koncentrationen. Förvara lösningen kallt, mörkt och torrt. Lösningen ska vara färglös. 5. Regenerera använd jonbytarmassa. Använd stor sugkolv och Büchnertratt med två lager fallskärmsduk. Tvätta med följande under svag magnetomrörning varvat med sugfiltrering: a) 0,5 M HCl ca 30 minuter b) Avjonat vatten till neutralt ph c) 0,5 M NaOH ca 30 minuter d) Avjonat vatten till neutralt ph e) 0,2 M Tris-HCl, ph 8,3 Justera ph med 1 M Tris / 6 M HCl. Upprepa med 0,2 M Tris-buffert, ph 8,3 till stabilt ph. f) 0,01 M Tris-HCl, ph 8,3 Justera och upprepa enligt ovan till önskat ph och önskad jonstyrka. Förvara gelen i 0,2 % benzalkoniumklorid i kylskåp mellan kurserna. Introduktion Enzymet karboanhydras ska renas med hjälp av kromatografi på en DEAEcellulosapelare (DEAE=dietylaminoetyl). Jonbytaren består av ett olösligt fast material, som innehåller en kemiskt bunden laddad grupp (i detta fall -C 2 H 4 N + - (C 2 H 5 ) 2 H) och mobila motjoner. Motjonerna kan reversibelt bytas mot andra joner av samma laddning utan att den olösliga matrisen förändras. Vid ph 8,3 har karboanhydras en negativ nettoladdning (pi = 6,0) och kan bindas till jonbytaren på bekostnad av matrisens motjoner. Bindningen till jonbytaren är av jämviktskaraktär, och olika proteiner är bundna till pelaren med olika styrka, beroende på proteinets egenskaper. Proteiner kan fås att lossna från jonbytaren, och elueras från kolonnen,

4 genom att halten av fria motjoner ökas. Eftersom bindningens styrka varierar från protein till protein kan en separation baseras på denna egenskap. För jonbyteskromatografi krävs en väl packad och ekvilibrerad pelare, som måste färdigställas vid ett tidigt skede av denna laboration. En glaskolonn med dimensionerna 3,5 x 20 cm används. Packning av kolonn Cellulosasuspensionen ska vara rumstempererad när den hälls i kolonnen. I annat fall måste den avluftas i förväg under vakuum i sugkolv. Montera kolonnen lodrätt i stativ. Häll lite buffert i kolonnen och kontrollera att utloppet fungerar. Saknas bottenplatta kan istället glasull användas. Den bör då tryckas ned med en glasstav under det att lite ekvilibreringsbuffert hälls i kolonnen. Fortsätt att trycka ned glasullen under det att gelen hälls i kolonnen. Tillsätt cellulosan och låt den sedimentera utan avbrott tills kolonnen är fylld till 3-4 cm höjd. Utloppet hålls öppet under hela fyllningen. När cellulosan sedimenterat kan man lämpligen lägga på ett svagt tryck med hävert (med öppet utlopp) för att få en tätare packning. Ekvilibrering av jonbytaren Låt därefter ekvilibreringsbuffert (0,01 M Tris-HCl, ph 8,3) passera kolonnen. Denna buffert erhålls genom spädning av den beredda elueringsbufferten (0,08 M Tris-HCl, ph 8,3). Den förändring av ph som sker vid denna utspädning av bufferten är försumbar. Kontrollera att ph-värdet och jonledningsförmågan (konduktiviteten) för eluatet från pelaren överensstämmer med ekvilibreringssbuffertens (0,01 M Tris-HCl, ph 8,3). För att undvika att pelaren går torr under ekvilibreringen kan slangarna arrangeras som i figuren nedan (säkerhetsslinga).

5 Beredning av buffertar Att göra buffertar är ett vanligt förekommande moment vid biokemiskt laboratoriearbete. Av den anledningen är det viktigt att behärska en allmän strategi vid bufferttillverkning. Denna kunskap ska användas för att bereda buffertar inför momenten Uppmätning av enzymaktiviteten och Enzymaktivitetens ph-beroende. Allmän strategi vid bufferttillverkning Välj en buffertsubstans som har ett pk a nära det ph, som bufferten ska hålla konstant. Endast i närheten av pk a har bufferten buffertkapacitet och kan uppta eller avge vätejoner. Praktiskt sträcker sig detta ph-intervall ungefär ± 1 ph-enhet från pka-värdet. Om den valda buffertsubstansen är en bas titreras den med en syra, t.ex. H 2 SO 4, så att det önskade phvärdet erhålls. Utgår man istället från en syra som buffertsubstans sker ph-justeringen med en bas, t.ex. NaOH. 0,10 M Tris-H 2 SO 4, ph 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 Gör 550 ml per skift av bufferten med ph 8,5 och 100 ml av övriga. Fördela arbetet mellan lab.grupperna. Utförande: Som exempel ska här 100 ml 0,10 M Tris-H 2 SO 4 buffert, ph 7,5 tillverkas. Buffertsubstansen är i detta fall Tris, en bas (2-aminoetyl-1,3-propandiol), d.v.s. en amin med buffertjämvikten: R-NH 2 + H 2 O R-NH OH - med ett pk a omkring 8. Den har således god buffertkapacitet vid det önskade ph-värdet 7,5. Tris föreligger i fast form och ska först lösas i avjonat vatten. Eftersom slutvolymen ska vara 100 ml löses Tris i ca 80 ml vatten, så att utrymme lämnas till titreringen. 0,10 M Tris-H 2 SO 4 betyder att buffertsubstansen Tris ska hålla slutkoncentrationen 0,10 M. Alltså ska 0,10 mol/l x 0,1 l = 0,01 mol Tris vägas upp (M = 121,1 g/mol) och lösas i vattnet. Vattnets ph blir då något över 10. Lösningens ph titreras till ph 7,5 med H 2 SO 4, t.ex. 1M, under omröring. Sist i buffertens beteckning anges med vilken syra ph ska justeras. Titrering med HCl ger Tris- HCl. Slutligen justeras slutvolymen i mätglas med avjonat vatten till 100 ml. Bufferten förvaras i en märkt plastflaska i rumstemperatur. 0,10 M HEPES, ph 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 Gör 100 ml av vardera bufferten. Fördela arbetet mellan lab.grupperna. Utförande: I detta fall är buffertsubstansen en syra (4-(2-hydroxietyl)-1- piperazinetansulfonsyra), som titreras till önskat ph med NaOH, t.ex. 1M. Eftersom slutvolymen ska vara 100 ml löses HEPES i ca 80 ml vatten, så att utrymme lämnas till titreringen. Som i exemplet ovan ska slutlösningen, 100 ml, vara 0,10 M med avseende på HEPES och efter titreringen justeras volymen till 100 ml med avjonat vatten. Bufferten förvaras i en märkt plastflaska i rumstemperatur. Teoretisk uppgift: 0,10 M Na-fosfatbuffert, ph 6,9, volym 1 l Hur gör man denna buffert? Tänk efter och diskutera sedan med lab.handledaren.

6 KROMATOGRAFISK RENING AV BOVINT KARBOANHYDRAS II, BCA II Karboanhydrasprov Ett extrakt med bovint karboanhydras II, ca 5 ml med koncentrationen 1 mg/ml, som är partiellt renat från röda blodkroppar från koblod, erhålls för kromatografisk upprening. Följande initala reningssteg har redan utförts: 1. Hemolys av blodkropparna 2. Utfällning och bortcentrifugering av hemoglobin. Ekvilibrering av enzymextraktet Den slutliga reningen av BCA II görs med hjälp av DEAE-cellulosa, en anjonbytare, som är packad i en glaskolonn och ekvilibrerad med 0,01 M Tris-HCl, ph 8,3 enligt ovan. För att CA ska binda till jonbytaren måste ph-värdet i enzymextraktet justeras till 8,3 genom att 1 M Tris-bas (inte Tris-buffert) tillsätts droppvis under omrörning. En starkare bas, t.ex. NaOH, är olämplig att använda, då den orsakar lokal denaturering av proteinet. Jonstyrkan i extraktet måste vara densamma som i 0,01 M Tris-HCl, ph 8,3, eller lägre, för att enzymet ska binda in. Detta kontrolleras med en jonledningsförmågemätare. Om ledningsförmågan är för hög tillsätts avjonat vatten. Justering av ph och jonstyrka måste ofta upprepas några gånger. Bestämning av proteinkoncentration och sparande av prov för aktivitetsbestämning Vid beräkning av proteinkoncentration utgår vi från enzymet karboanhydras molära absorbans, eftersom karboanhydras är det dominerande proteinet både före och efter den kromatografiska separationen. Proteinkoncentrationen erhålls genom att beräkna koncentrationen i M med Lambert-Beers lag: A=ε x l x c, där ε = M -1 cm -1 och l = 1 cm. För att bestämma mängden protein i mg/ml används molvikten g/mol. Avläs absorbansen för det justerade extraktet vid 280 nm. Värdet bör ligga i intervallet 0,2-1 absorbansenhet. Späd minsta möjliga volym prov med vatten om proteinkoncentrationen är för hög (exakta volymer). Kasta det utspädda provet efter absorbansbestämning. Spara ca 0,3 ml av extraktet i ett Eppendorfrör i frysen. CA-aktiviteten i detta prov ska bestämmas vid ett senare tillfälle. Bestäm volymen för det extrakt, som ska appliceras på jonbytaren.

7 Separation på jonbytarkolonn Den fortsatta reningen av enzymlösningen görs med hjälp av jonbyteskromatografi på en pelare packad till ca 3 cm höjd med DEAE-cellulosa och ekvilibrerad med 0,01 M Tris-HCl buffert, ph 8,3. Skikta försiktigt den ekvilibrerade och rumstempererade enzymlösningen ovanpå jonbytarmassan utan att massan virvlas upp. Använd pasteurpipett, som förs runt kolonnens vägg. Applicera prov till en nivå ca 10 cm över gelytan. Om provvolymen är större, sker resten av provpåsättningen med hjälp av hävert, ev. med säkerhetsslinga för att inte riskera att kolonnen går torr. Samla eluatet från appliceringen i en separat bägare. Tvätta därefter gelen med en gelvolym 0,01 M Tris-HCl buffert, ph 8,3, för att avlägsna proteiner, som inte binder till gelen. Spara även tvätteluatet i en separat bägare. Eluera provet med 0,08 M Tris-HCl buffert, ph 8,3, med dropphastigheten 1-3 ml/min, så att provet kan elueras under lab.passet. Samla eluatet manuellt eller med fraktionssamlare i fraktioner om ca 3 ml. Påvisa i vilka fraktioner det finns protein genom att mäta ljusabsorptionen vid 280 nm, A 280, med spektrofotometer. Använd elueringsbuffert som referens. Häll tillbaka det avlästa provet i resp. provrör. Rådgör med lab.handledare om vilka fraktioner som ska sparas till nästa lab.tillfälle för aktivitetsmätning. Avsluta jonbyteskromatografin med att försiktigt skjuta ut jonbytarmassan i en bägare med vatten med hjälp av tryckluft. Avlägsna glasullen. UPPMÄTNING AV ENZYMAKTIVITETEN Princip Karboanhydras katalyserar inte bara hydratiseringen av CO 2, utan också ett flertal andra reaktioner såsom hydratisering av aldehyder och hydrolys av vissa estrar. Man kan därför bekvämt följa karboanhydrasaktiviteten genom att spektrofotometriskt bestämma koncentrationen av den p-nitrofenol, som frigörs då p-nitrofenylacetat, p-npa, används som substrat. O NO 2 O C CH 3 + H 2 O NO 2 OH + HO O C CH 3 CH 3 COO NO 2 H + -H + p-npa NO 2 O -

8 p-nitrofenolatjonen har ett absorptionsmaximum vid 400nm (ε = 18,1 mm -1 cm -1 ) medan p- NPA endast absorberar ljus av kortare våglängder. Eftersom p-nitrofenols pk a -värde är 7,14, är det emellertid endast en del av substansen som är joniserad vid ph-värden nära 7. För att undvika detta problem kan mätningen göras vid en våglängd, 348 nm, där fenol och fenolat har samma absorption, isosbestisk punkt. Därvid kan den molära absorptionen 5540 M -1 cm -1 användas. Eftersom lösligheten för p-npa är begränsad kan inte V max uppnås. I stället kan ett värde på k cat /K M bestämmas. v = k cat /K M [E][S]. Se Stryer Biochemistry 6th ed. sid Utförande Efter lokalisering av fraktionerna med protein genom uppmätning av A 280, ska enzymet karboanhydras påvisas. Detta utförs genom att den enzymatiska aktiviteten undersöks för proteintopparna. Här räcker det med mätning av ungefär varannan fraktion. För toppfraktionen beräknas k cat /K M. Vid detta tillfälle mäts även aktivet för extraktet. Aktivitetsmätningen utförs vid rumstemperatur och absorptionsförändringen vid 348 nm registreras spektrofotometriskt. Häll lite p-npa-lösning från mätkolven i ett konformat folieklätt glasrör försett med folieinlindad propp. Pipettera substratet från detta rör och förvara det i isbad. Det som blir över i röret kastas i vasken. Pipettera följande i en 1,5 ml plastkyvett: 1,25 ml 0,10 M Tris-H 2 SO 4, ph 8, μl enzym (utesluts vid mätning av spontanhydrolys). Blanda med hjälp av parafilm. Ta så mycket enzym att reaktionen går minst fyra gånger snabbare än spontanhydrolysen. Starta reaktionen genom tillsats av 20 μl 0,075 M p-npa. Blanda igen och påbörja mätning. Beräkna den verkliga reaktionshastigheten för den enzymkatalyserade reaktionen genom att först subtrahera hastigheten för spontanreaktionen från hastigheten för den enzymkatalyserade reaktionen, d.v.s. ΔA 348 /Δt prov - ΔA 348 /Δt spontanhydrolys. Reaktionshastigheten, v, uttryckt i μm/s och beräknas med hjälp av Lambert-Beers lag enligt: Δc v = Δt = ΔA Δt ε l Eftersom olika volym enzym används vid mätningarna, för att utslaget ska bli tillräckligt stort, måste esterasaktiviteten normeras till konstant provvolym, så att jämförelse mellan proverna kan göras. v divideras därmed med antalet μl enzym.

9 Rita ett kromatogram där A 280 (y 1 -axeln) och esterasaktivitet, normerat v (y 2 -axeln), avsätts mot fraktionsnummer (x-axeln). Välj skalor så att A och aktivitetskurvorna ungefär sammanfaller. Beräkna k cat /K M för toppfraktionen. Esterasaktiviteten bör här mätas tre gånger för att få ett tillförlitligt resultat att jämföra med litteraturvärde. Normalt uttrycks ett enzyms katalysförmåga i k cat, där k cat = V max / [E] tot, men här kan inte V max uppnås på grund av att substratet bara är måttligt lösligt. Därför bestäms istället en 2:a ordningens hastighetskonstant för reaktionen: k cat /K M (M -1 s -1 ) = v [ ExS ] [ ], ty hastigheten för reaktionen är v = k cat/k M [E][S]. [E] är enzymkoncentrationen i kyvetten, och [S] är substratkoncentrationen i kyvetten. v är i M/s. Slutkoncentrationen för p-npa i kyvetten är 1,18 mm, okorrigerat för volym tillsatt enzym. Om spädningseffekten vid enzymtillsatsen blir större än 3 % bör den beräknade p-npa-koncentrationen korrigeras. Toppfraktionen innehåller mest karboanhydras och ska användas för att senare bestämma aktivitetens ph-beroende. Om enzymet måste koncentreras för detta lab.moment görs det efter att aktiviteten för fraktionen mätts. Litteraturvärde: k cat /K M = 1075 M -1 s -1 (H. Steiner, B.-H. Jonsson och S. Lindskog Eur. J. Biochem. 59 (1975) ). Koncentrering av BCAII-lösningen (görs vid behov) För att undersöka hur olika ph-värden påverkar aktiviteten för BCAII, bör proteinkoncentrationen i toppfraktionen vara minst 0,5 mg/ml, vilket motsvarar A 280nm 1. Om koncentrationen är för låg koncentreras provet genom centrifugering i specialrör, Amicon Ultra-4 centrifugal filter devices. Filtreringsenheten består av ett inre rör med filter för det prov som ska koncentreras, och ett yttre konformat plaströr, som samlar upp filtratet. Båda rören är försedda med volymskala. Utförande Pipettera max 4 ml proteinlösning i det inre röret i filtreringsenheten. Skruva fast locket på det yttre röret och centrifugera i swinging out rotor vid max 4000 g i ca 10 minuter. Glöm inte att balansera rotorn. Skruva av locket, lyft upp det inre röret och avläs volymen. Centrifugera ev. ytterligare en stund till önskad koncentration. Sug försiktigt upp provet med automatpipett genom att föra pipetten från sida till sida utan att skada filtret. Skötsel av filtreringsenheten Centrifugera avjonat vatten i filtreringsenheten innan den ska användas första gången. Se till att filtret inte torkar. Förvara rören i kylskåp med 20 % etanol i både inner- och ytterrör.

10 ENZYMAKTIVITETENS ph-beroende. Princip Genom att undersöka enzymaktivitetens ph-beroende kan en hel del intressant information fås vad gäller enzymets verkningsmekanism. Ofta deltar bindande och katalytiska grupper under katalysprocessen, vilka har möjlighet att protoniseras eller deprotoniseras, d.v.s. att titrera. Inte sällan är det bara den protoniserade sura formen eller den deprotoniserade basiska formen, som är katalytiskt aktiv. Om detta är fallet, kommer aktivitetens ph-beroende att likna en titrerkurva. Ett diagram över karboanhydras aktivitet som funktion av ph finns i fig. 9.23, sid. 256, Stryer Biochemistry 6th ed. Om aktivitetens ph-beroende liknar en titrerkurva, kan man på goda grunder anta att en grupp i enzymet måste titrera för att ett aktivt enzym ska bildas. Från en sådan aktivitetskurva kan pk a för den katalytiska gruppen bestämmas. Genom att jämföra det erhållna värdet med de olika aminosyrornas pk a -värden kan förslag på potentiella katalytiska grupper ges. Sådana studier kan ge viktiga pusselbitar i lösandet av ett enzyms mekanism. I enzymet karboanhydras aktiva yta sitter en zinkjon koordinerad till tre His-ligander. Som fjärde ligand är en vattenmolekyl bunden. Se Stryer Biochemistry 6th ed., fig sid Zinkjonens roll är att agera som Lewissyra och därmed avsevärt reducera pk a för det bundna vattnet genom elektrostatisk interaktion. Genom det uppkomna elektronsuget försvagas bindningarna till vattnets väteatomer, varvid deprotonisering sker mycket lättare än normalt och det koordinerade vattnet förvandlas till en hydroxidjon. Denna hydroxidjon är en mycket starkare nukleofil än vad vatten är och kan effektivt attackera substratet CO 2. Genom denna reaktion bildas HCO 3 - och en H + avspaltas till mediet via en H + -acceptor i aktiva ytan (His-64). Därmed har CO 2 hydratiserats till "kolsyra". Under artificiella förhållanden attackeras istället p-nitrofenylacetat, så att en hydrolys av detta substrat erhålls. Härvid attackeras karbonylkolet nukleofilt av den zinkkoordinerade hydroxidjonen. Detta är basen för den nu allmänt accepterade "zinkhydroxidmekanismen" (Litt.: S. Lindskog in Zinc Enzymes 1983, pp ). Utförande HEPES- och Tris-buffertar, som täcker ph-området 5-9, är gjorda under tidigare lab.moment och renat karboanhydras från jonbyteskromatografin har koncentrerats till ca 0,5 mg/ml. Mät esterasaktiviteten som funktion av ph, börja med ph 9. Tillsätt samma volym enzym, som vid tidigare aktivitetsmätningar vid ph 8,5. Enzymkoncentrationen ska

11 vara densamma vid alla mätningarna. Mät även spontanreaktionen vid varje ph, eftersom den varierar med ph. Rita ett diagram med esterasaktiviteten (ΔA 348nm /Δt), korrigerad för spontanhydrolys, som funktion av ph. REDOVISNINGEN SKA INNEHÅLLA: Kortfattad beskrivning av jonbyteskromatografin. Primärdata från absorbans- och aktivitetsmätningar av enzymextrakt och av toppfraktion. Ett kromatogram där A 280 (y 1 -axeln) och esterasaktivitet, normerat v (y 2 -axeln), avsatts mot fraktionsnummer (x-axeln). Slutsatser om det preparerade enzymets renhet utifrån kromatogrammets utseende. Beräkningar av k cat /K M för toppfraktionen och jämförelse mellan detta och litt.värdet. Diagram med esterasaktiviteten (ΔA 348nm /Δt) som funktion av ph. pk a för den grupp i enzymet, som aktiviteten är beroende av. Beskrivning av vad som händer i karboanhydras aktiva yta när ph ändras, och vilken effekt detta får för katalysen.