MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) IFA testkit 32515

Transkript

1 MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) IFA testkit Immunofluorescerande antikroppstestkit för detektion och identifiering av Pneumocystis jirovecii (P. carinii) i luftvägsprover. ANVÄNDNINGSOMRÅDE MONOFLUO Pneumocystis jirovecii IFA testkit ska användas för detektion av Pneumocystis jirovecii (P. carinii)-cystor och - trofozoiter i prover från luftvägarna. ÖVERSIKT Pneumocystis jirovecii (P. carinii) är en encellig, eukaryot organism som finns i lungorna hos många däggdjur, inklusive människan. Pneumocystis-organismerna hos människor kallades ursprungligen P. carinii f. sp. hominis. Namnet på underarten skiljde då Pneumocystis-organismer hos människor från Pneumocystis-organismer hos andra däggdjur. Nyligen upptäcktes att Pneumocystis-organismerna hos människor var en specifik art, och de fick därför ett nytt namn, Pneumocystis jirovecii. 1 Organismen sprids genom luften och orsakar vanligtvis asymptomatisk infektion. Exponering under barndomen kan ge milda eller subkliniska fall där organismen ligger latent ända upp i vuxen ålder. Hos personer med nedsatt immunförsvar blir organismen opportunistisk och orsakar diffus, interstitiell pneumoni. 2,3 Individer som riskerar att få Pneumocystis jirovecii inkluderar prematura barn, personer med immundefekter (som AIDS), och de som får immunsuppressiv medicin, t.ex. kortikosteroider. Pneumocystis jirovecii är det vanligaste opportunistiska smittämnet hos AIDS-patienter, av vilka nästan 80 % har infektionen. 4,5,6,7 Morfologiska studier av organismen har påvisat tre former i livscykeln för Pneumocystis jirovecii: cystor, sporozoiter och 98

2 trofozoiter. De tjockväggiga cystorna (4-7 μm i diameter) innehåller vanligtvis åtta komma-formade sporozoiter, som sedan mognar till större,pleomorfa trofozoiter (2-8 μm i diameter) innan de kapslas in och upprepar cykeln. 2,7 Cystorna, med sina distinkt morfologiska egenskaper, associeras vanligtvis med förekomsten av Pneumocystis jirovecii. Snabb klinisk diagnos av Pneumocystis jirovecii är livsviktig eftersom organismerna snabbt infiltrerar lungvävnaden och orsakar dyspné, feber och hosta. 8 Tidig upptäckt kan påskynda relevant behandling och öka chansen för patientens överlevnad. 9,10 Diagnos görs numera med radiologisk teknik och identifiering av Pneumocystis jirovecii-cystor och trofozoiter utföres med histologisk färgning av luftvägsprover. Vanliga färgningsmetoder (toluidinblått O, Gomori s metenamin silvernitrat eller Giemsa) avslöjar cystväggar och/eller trofozoiter/sporozoiter. 7,11 Då dessa färgningar är ospecifika, kan det vara svårt att göra en riktig identifiering av organismen. En mer invasiv teknik för provinsamling, såsom bronkoalveolär lavage krävs ofta för att säkra förekomsten av Pneumocystis jirovecii. 12 Användning av ett direkt, fluorescens-antikroppsförfarande med inducerat sputumprov, bronksköljvätska eller bronkoalveolära lavageprover erbjuder en enkel, mycket specifik metod för detektion av Pneumocystis jirovecii. 13,14,15,16 De monoklonala antikropparna i MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) immunofluorescens-testkit är kemiskt kopplade till fluoresceinisotiocyanat (FITC). Detta ger ett mycket specifikt, direkt, immunofluorescerande reagens med en låg nivå av bakgrundsfluorescens. Förutom att binda till Pneumocystis jirovecii-cystor, binds de monoklonala antikropparna också specifikt till Pneumocystis jirovecii trofozoiter, sporozoiter och extracellulära matrix. Testkitet används för snabb identifiering av Pneumocystis jirovecii-cystor och -trofozoiter direkt i patientprover. TESTPRINCIP MONOFLUO Pneumocystis jirovecii färgningsreagens innehåller murin monoklonal antikropp märkt med fluoresceinisotiocyanat (FITC). Antikroppen reagerar med alla former av Pneumocystis jirovecii (cystor, sporozoiter och trofozoiter) och även med extracellulär matrix som finns i infekterade prover. 99

3 Objektglas bereds för mikroskopi från kliniska prover enligt beskrivningen i avsnittet: Beredning av kliniska prover före fluorescensfärgning. Efter fixering färgas objektglasen med färgningsreagens för MONOFLUO Pneumocystis jirovecii. Färgningsreagensen binds till varje Pneumocystis jiroveciiorganism som finns i provet. Efterföljande sköljning tar bort obundet reagens. Objektglasen monteras sedan med MONO- FLUO -monteringsmedium som bifogas i kitet. Monteringsmediet innehåller en anti quencher - som förlänger den tid under vilken objektglasen kan undersökas innan fluorescensen mattas av. Vid betraktande i fluorescensmikroskop lyser infekterade prover ljust äppelgröna. Färgade cystor ses som stora, runda till ovala strukturer som förekommer både enskilt och i kluster. Sporozoiter och trofozoiter kan också färgas, och syns som relativt små, halvmåneformade eller pleomorfa strukturer. Dessutom bör också den amorfa, extracellulära matrixen lysa starkt. Andra organismer och cellulärt material från luftvägsprover är motfärgade i rött till orange-rött eller guldgult utan den karaktäristiska fluorescensen hos Pneumocystis jirovecii-cystor. PRODUKTBESKRIVNING Tabell 1: Ingående material Förvara reagens vid 2-8 C. Objektglas bör förvaras vid 2-28 C. Komponent Innehåll Beredning R1 Pneumocystis jirovecii färgningsreagens* 1 droppflaska (2,2 ml) R2 Monteringsmedium 1 droppflaska (3,5 ml) R3 Objektglas för fluorescensmikroskopi 24 (två brunnar vardera) FITC-märkta monoklonala antikroppar (murina) Motfärgning (Evans Blue) Natriumazid** Proteinstabiliserad buffert Buffrad glycerol Formaldehyd*** Anti-quencher Objektglas för fluorescensmikroskopi Blanda försiktigt före bruk Klar att användas Torka med luddfri servett före användning. *Tillräcklig volym för färgning av 24 individuella testbrunnar. **0,001 % natriumazid. ***< 0,04 % formaldehyd. 100

4 NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL. Aceton, reagenskvalitet, (förvara i en tättförsluten behållare för att undvika vattenabsorbtion). Avjoniserat vatten eller kranvatten. Färgningsskålar med ställ för objektglas. Fuktkammare (t.ex. en täckt petriskål som innehåller en fuktad pappershandduk). Täckglas, 24 x 40 mm, nr 1. Pasteur-pipetter. Centrifug eller mikrofug. 15 ml centrifugrör eller 1,5 ml mikrofugrör. 37±1 C inkubator. Biologiskt säkerhetsskåp (rekommenderas). Immersionsolja av fluorescens-kvalitet, vid behov. Fluorescensmikroskop med X och X förstoring, utrustad med filtersystem för fluoresceinisotiocyanat (FITC). En stor uppsättning filter för avläsning av FITC kan köpas från olika tillverkare. Excitationsvåglängder för bredband ( nm) eller smalband ( nm) med en 515 nm dikromatisk spegel och ett 515 nm barriärfilter rekommenderas. Den smalbandiga excitationsvåglängden minskar bakgrundsfluorescens. Variationer i wattstyrka, intensitet och vinkling av glödlampan samt skillnader i belysningstyp och filter kan påverka testets tillförlitlighet. Kontrollobjektglas som innehåller Pneumocystis jiroveciiorganismer (se avsnittet Beredning av kontrollobjektglas). Pappershanddukar eller aspirationssystem. För inducerade sputumprover Ditiotreitol (DTT): Vätskeberedning 0,1 % (6,5x10-3 mol/l). Exempelvis Stat-Pak Sputolysin från Caldon Biotech; använd enligt bruksanvisning. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 101

5 FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Endast för in vitro-diagnostisk användning. Endast för professionellt bruk. 1. Detta test ska bara utföras av personal som har adekvat utbildning i hantering av prover som kan innehålla HIV-1. Objektglasen bör undersökas av personal som har erfarenhet av att avläsa immunofluorescensanalyser. 2. Hantera alla kliniska prover som potentiellt smittsamt material. 3. Handhavande som genererar aerosoler bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp. Allt material bör desinficeras efter användning eller innan det kastas. 4. Använd god laboratorieteknik vid hantering av prover eller reagens för MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) immunofluorescenstestkit. Det är ej tillåtet att äta, dricka eller röka i laboratoriet! Munpipettera ej! Tillämpa Standard og Universella försiktighetsåtgärder. Hantera dessa reagenser, allt humanblod och alla humanprov som om de kan överföra infektionssjukdom, i ett laboratorium med biologisk säkerhetsnivå 2, enligt riktlinjerna från gällande CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 (biologisk säkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier), WHO Laboratory Biosafety Manual 20 (Laboratoriet biosäkerhet Manual) eller motsvarande. Undvik kontamination av reagens. 5. Färgningsreagensen innehåller Evans Blue, som kan ge irritationer. Undvik att spilla eller stänka färgningsreagens på hud eller kläder. Spola rikligt med vatten på alla områden som kan ha kommit i kontakt med färgningsreagens. 6. Monteringsmediet omfattar 2 % formalin som innehåller 0,8 % formaldehyd, som kan förväntas vara cancerframkallande. Men befintliga data visar inte helt säkert att formaldehyd orsakar cancer vid de koncentrationer som används i detta kit (<1 %). Undvik att spilla eller stänka monteringsmedium på hud eller kläder. Spola rikligt med vatten på alla 102

6 områden som kan ha kommit i kontakt med monteringsmedium. 2% Formalin ( 0,8% Formaldehyde [HCHO]): VARNING H317* H317: Kan orsaka allergisk hudreaktion. P280: Använd skyddshandskar/skyddskläder/ ögonskydd/ansiktsskydd. P302 + P352: VID HUDKONTAKT: Tvätta med mycket tvål och vatten. P333 + P313: Vid hudirritation eller utslag: Sök läkarhjälp. 7. Färgningsreagens innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. För att undvika att azid lagrar sig bör rören spolas länge med vatten om reagenser hälls ut i avloppet. 0,1 % natriumazid (NaN 3 ): VARNING H303: Kan vara farligt vid förtäring. H313: Kan vara farligt vid hudkontakt. P312: Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Säkerhetsdatablad finns på bio-rad.com och på begäran. 8. Bortskaffa produkt- och förpackningsavfall i enlighet med alla tilllämpliga lokala, regionala och nationella bestämmelser. 9. Rengör alla återanvändbara saker noggrant. 10.Blanda färgningsreagens försiktigt före varje test. 11.Använd ett separat objektglas för varje patientprov för att förhindra eventuell korskontamination av Pneumocystis jirovecii-organismer. Varje objektglas bör också tvättas separat. 12.Objektglas bör beredas med hjälp av acetonfixering. Formalin- eller etanolfixerade objektglas rekommenderas inte för detta test. REAGENSSTABILITET OCH FÖRVARING Använd inte testet eller någon av dess komponenter efter sista förbrukningsdatum. Förvara färgningsreagens mörkt vid 2-8 C. Förvara reagens vid 2-8 C. Objektglas bör förvaras vid 2-28 C. Om de förvaras vid angivna temperaturer är både 103

7 öppnade och oöppnade reagenser stabila till angiven förbrukningstid. TESTFÖRFARANDE FÖR PNEUMOCYSTIS jirovecii Provtagning Kliniska prover bör insamlas färska med hjälp av standardmetoder för inducerat sputum, bronksköljvätska eller bronkoalveolärt lavage. 17,18 Provet bör bearbetas omedelbart. Spara en del av provet för eventuell odling. Beredning av Kliniska Prover före Fluorescensfärgning Inducerade sputumprover 1a.Sätt 2-3 ml sputum i ett 15 ml centrifugrör. Tillsätt lika stor volym ditiotreitolreagens. Vortexblanda röret och inkubera i 5-10 minuter vid 37 C eller 15 minuter i rumstemperatur (15-30 C). -ELLER- 1b.Om provet är för trögflytande för att enkelt kunna överföras till ett centrifugrör, tillsätt en lika stor volym ditiotreitolreagens direkt i insamlingskärlet, rör ordentligt så att det blandas och inkubera i 5-10 minuter vid 37 C eller 15 minuter i rumstemperatur (15-30 C). Överför till ett centrifugrör så snart som möjligt under inkubation och vortexblanda innan du fortsätter. 2. Tillsätt cirka 5-6 ml PBS ph 7,2, samma som för sputum plus DTT tillsammans, till röret och vortexblanda. 3. Centrifugera vid 1500 x G i fem minuter. 4. Dekantera eller aspirera supernatanten och lämna 0,5 ml eller mindre av pellet och supernatant i röret. Steg 2, 3 och 4 kan vid behov upprepas för att avlägsna alla spår av slem. 5. Resuspendera pelleten ordentligt. Tillsätt en droppe med pipett (cirka μl) på ett mikroskopobjektglas som medföljer testet. Fördela droppen jämnt över brunnen med sidan av pipettspetsen. Se till att inte repa objektglaset. Lufttorka. En objektglasvärmare med en temperatur på 37 C kan hjälpa till att torka provet. 104

8 6. Fixera i cirka 10 minuter i aceton. Objektglas kan bearbetas direkt eller frysas vid 20 C i upp till en månad före färgning. Bronksköljvätska och bronkoalveolära lavage-prover Ej mukösa prover såsom bronksköljvätska eller bronkoalveolära lavager kräver sannolikt inte mukolytiskt förfarande. För dessa prover kan protokollet starta med centrifugering, steg 3 ovan, i ett 15 ml centrifugrör eller 1,5 ml mikrofugrör. OBS: Alternativt kan cytospincentrifugering användas för beredning av objektglas med prover från inducerat sputum, bronksköljvätska eller BAL. 13 När cytospinförfarande följs bör kontroller utföras på samma sätt. Objektglas beredda med cytospincentrifug fixeras i 10 minuter i aceton och färgas enligt beskrivning nedan i avsnittet Fluorescensfärgningsförfarande. BEREDNING AV KONTROLLOBJEKTGLAS Ett positivt kontrollobjektglas bör ingå vid varje testtillfälle. Bronkialsköljvätska eller bronkoalveolära lavageprover är bäst lämpade som positiv kontroll. Valda prover bör först konfirmeras som positiva för Pneumocystis jirovecii genom histologisk färgning. Följ förfarandet som anges i avsnittet Beredning av kliniska prover före fluorescensfärgning. Efter acetonfixering kan objektglasen frysas vid 20 C i upp till ett år. Alternativt kan ett känt positivt prov användas som positiv kontroll. För att testet ska ha validitet måste kontrollobjektglaset färgas korrekt och tolkas enligt beskrivning i avsnittet; Utvärdering av testresultat. FLUORESCENSFÄRGNINGSFÖRFARANDE 1. Om objektglasen varit frysta ska de anta rumstemperatur innan färgningsförfarandet fortsätts. 2. Placera objektglaset i en fuktkammare. 3. Tillsätt tillräckligt med Pneumocystis jirovecii färgningsreagens i varje brunn innehållande prov (2-3 droppar) så att det täcker provet men ligger innanför kanten på brunnen. 4. Inkubera i minuter vid 37±1 C. Låt inte färgningsreagensen torka på objektglaset under förfarandet. 105

9 5. Ta bort överflödigt Pneumocystis jirovecii färgningsreagens genom att tömma objektglaset mot en ren pappershandduk eller genom aspiration. 6. Tvätta objektglaset genom att sätta det i ett ställ och skölja det med avjoniserat vatten eller kranvatten i en minut samtidigt som du rör det försiktigt. Ta bort överflödigt vatten genom att tömma objektglaset mot en ren pappershandduk eller genom aspiration. 7. Torka objektglaset noga genom lufttorkning eller med en objektglasvärmare vid 37±1 C. 8. Tillsätt en eller två droppar monteringsmedium på objektglaset och sätt på ett täckglas. Var försiktig så att inte luftbubblor bildas. 9. Undersök objektglasen inom 2-3 timmar efter färgning. Efter avläsning kan objektglasen förvaras mörkt över natten vid 2-8 C eller mörkt i upp till sex månader vid 20 C eller lägre. Objektglas som förvarats i kyla måste anta rumstemperatur före avläsning för att förhindra att kondensation skymmer provet. 10.För att negativa resultat ska ha validitet, kontrollera i ljusmikroskop att provceller finns på objektglaset. UNDERSÖKNING AV FÄRGADE OBJEKTGLAS Skanna varje brunn med 200X eller större förstoring. Om fluorescens noteras, använd 400X eller 630X (med immersionsolja) för att bekräfta färgmönstrens utseende enligt beskrivning i avsnittet; Utvärdering av testresultat. Konfirmera att provceller finns på varje objektglas efter fluorescensanalysen. UTVÄRDERING AV TESTRESULTAT 1. Prover som är infekterade med Pneumocystis jirovecii innehåller stora runda till ovala cystor, som finns både enskilt och i kluster, som färgas ljust äppelgröna. Två eller flera väldefinierade fluorescerande cystor måste observeras för att provet ska anses positivt. 2. Sporozoiter och trofozoiter kan också vara färgade. De uppträder som små halvmåneformade eller pleomorfa strukturer. Ljust färgad, amorf extracellulär matrix kan även finnas. Prover som endast innehåller ljust färgat amorft material eller typiska sporozoit- eller trofozoitformer bör leda 106

10 till att man direkt letar efter cystor innan en definitiv diagnos kan fastställas. Vid frånvaro av cystor bör provet anses misstänkt positivt för Pneumocystis jirovecii och ännu ett prov bör tas för färgning. 3. Andra organismer och cellulärt material från luftvägsprover bör vara motfärgat i rött till orange-rött eller guldgult. 4. Ett prov anses negativt om fluorescensegenskaperna enligt beskrivningen ovan ej observeras. 5. Ett negativt resultat på inducerat sputum bör verifieras med ett uppföljningsprov från bronksköljvätska eller bronkoalveolärt lavage. TESTETS BEGRÄNSNINGAR Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten för en Pneumocystis jirovecii-infektion hos patienten. Provinsamling och beredning är viktiga steg i testförfarandet. Insamling av prov vid en olämplig tidpunkt under sjukdomens förlopp, med en olämplig metod eller med olämplig hantering av provet, eller fel användning av reagenser kan göra att detektion Pneumocystis jirovecii uteblir. Diagnos bör fastställas tillsammans med kliniska symptom. Kör endast ett prov per objektglas. Var noga med att behandla, fixera, färga och tvätta varje prov separat för att förhindra att organismer från Pneumocystis jirovecii sköljs över till andra objektglas. För mycket slem i prover kan hindra adekvat färgning. Vissa tjocka sputumutstryk kanske inte färgas ordentligt. Var noga med att göra utstryk så tunna som möjligt. Icke-specifik ansamling av Pneumocystis jirovecii färgningsreagens kan ske om inte provet tvättas ordentligt. För att negativa resultat ska ha validitet, kontrollera i ljusmikroskop att provmaterial finns på objektglaset. Om bronksköljvätska eller bronkoalveolärt lavageprov är negativt, men patienten fortsatt uppvisar symptom associerade med luftvägssjukdom, bör andra etiologiska agens misstänkas och lämpliga diagnosförfaranden (inklusive odling) genomföras. 107

11 PRODUKTEGENSKAPER Tre laboratorier deltog i en klinisk studie för att utvärdera MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) immunofluorescens test. Kliniska prover insamlades från patienter som misstänktes ha en Pneumocystis jirovecii-pneumoni. Ett inducerat sputumprov togs från varje patient och testades parallellt med MONOFLUO (MF) och histologisk färgning (referensmetod). Två histologiska färgningar användes; Wright-Giemsa-färgning [Diff-Quik (DQ)] och toluidinblå O (TBO). Om sputumprovet var positivt med referensmetoden, betraktades resultatet indikera en infektion med P. jirovecii. Om resultatet med referensmetoden var negativt på sputumprov, insamlades och testades ett bronkoalveolärt lavage-prov (BAL). Om BAL var positivt, var patienten positiv för P. jirovecii. Om BAL var negativt, ansågs patienten negativ för P. jirovecii. Totalt 100 patienter ingick i analysen. De erhållna resultaten sammanfattas i tabell 2. Tabell 2: Patientresultat Plats 1&2 Plats 3 Prov DQ MF TBO MF Patienter positiva för P.jirovecii med inducerat sputumprov med BAL ** **Dessa sex var positiva med MONOFLUO -test på både sputumprov och BAL. BAL insamlades på sex patienter då TBO-resultatet på sputum var negativt. Antalet patienter klassade som positiva resp. negativa med MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) immunofluorescens test i jämförelse med referenstest visas i Tabell 3. Tabell 3: Jämförelse av resultat från histologisk färgning respektive MONOFLUO immunofluorescens test (inkluderar både inducerat sputum och BAL) Histologisk färgning + - Monofluo

12 Av 100 testade patienter, var 76 positiva för P. jirovecii och 24 var negativa för P. jirovecii enligt bestämning med histologisk färgning. MONOFLUO -testet identifierade alla 76 positiva patienter korrekt och var negativt på 23 patienter som var negativa för P. jirovecii. Ett inducerat sputumprov var negativt med både MONOFLUO -test och referenstestet. BAL från denna patient var negativ med referenstestet och positiv med MONO- FLUO -testet. Baserat på dessa kliniska data var produktegenskaperna för MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) immunofluorescens test: Känslighet = 100 % Specificitet = 95,8 % 109

13 KORSREAKTIVITET Följande bakterie- och svamp-species från odlingsisolat och från prover testades för korsreaktivitet med MONOFLUO Pneumocystis jirovecii (P. carinii) immunofluorescens test och befanns vara icke-reaktiva: Bakterier Acinetobacter calcoaceticus Actinomyces israelii Bacteroides spp. Bifidobacterium dentium Campylobacter sputorum Cardiobacterium hominis Corynebacterium ulcerans Eggerthella lenta Enterobacter cloacae Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Haemophilus spp. Klebsiella pneumonia Lactobacillus catenaformis Legionella pneumophila Leptotrichia buccalis Micrococcus luteus Moraxella lacunata Svamp Aspergillus niger Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Candida albicans Candida krusei Candida guillermondii Moraxella (Branhamella) catarrhalis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium kansasii Mycobacterium avium-intracellulare Neisseria spp. Nocardia asteroides Pepto streptococcus Proteus mirabilis Pseudomonas spp. Rothia dentocariosa Selenomonas sputigena Staphylococcus aureus Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus pneumoniae Streptococcus, Grupp A,B,C,F,G Treponema denticola Veillonella parvula Candida parapsilosis Candida pseudotropicalis Candida tropicalis Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Saccharomyces cerevisiae Torulopsis glabrata Trichosporon spp. 110

14 REFERENCES/BIBLIOGRAPHIE/REFERENCIAS/ LITERATUR/BIBLIOGRAFIA/REFERENCER/REFERENSER 1. Stringer JR, Beard CB, Miller RF, Wakefield AE: A New Name (Pneumocystis jiroveci) for Pneumocystis from Humans. Emerg Infect Dis 8(9): , Mills J: Pneumocystis carinii and Toxoplasma gondii infections in patients with AIDS. Rev Infect Dis 8(6): , Kovacs JA, Hiemenz JW, Macher AM, et al: Pneumocystis carinii pneumonia: A comparison between patients with the acquired immunodeficiency syndrome and patients with other immunodeficiencies. Ann Intern Med 100: , Posner D, Khan FA: Respiratory infections in AIDS: A comprehensive care approach. J Respir Dis pp 83-94, June Simone JW, Holland E, Johnson W: Fatalities during remission of childhood leukemia. Blood 39: , Gajdusek DC: Pneumocystis carinii-etiologic agent of interstitial plasma cell pneumonia of premature and young infants. Pediatrics 19: , Suffredini AF, Masur H: Pneumocystis carinii infection in AIDS, in Wormser GP, Stahl RE, Bottone EJ (eds): AIDS, Aquired Immune Deficiency Syndrome, and Other Manifestations of HIV Infection. Park Ridge, NJ, Noyes Publications, 1987, chap Walzer PD, Perl DP, et al: Pneumocystis carinii pneumonia in the United States. Epidemiologic, diagnostic, and clinical features. Ann Intern Med 80:83-93, Brenner M, Ognibene FP, et al: Prognostic factors and life expectancy of patients with acquired immunodeficiency syndrome and Pneumocystis carinii pneumonia. Am Rev Respir Dis 136: , Chaisson RE, Hopewell PC: Empiric diagnosis of pneumocystis pneumonia. JAMA 258(23):3385,

15 11.Chandra P, Delaney MD, Tuazon CU: Role of special stains in the diagnosis of Pneumocystis carinii infection from bronchial washing specimens in patients with the acquired immune deficiency syndrome. Acta Cytol 32(1): , Nieberg RK, Gong Jr: Diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia by bronchoalveolar lavage in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. Amer Clin Prod Rev 6:28-31, Kovacs JA, Ng VL, et al: Diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia: Improved detection in sputum with use of monoclonal antibodies. NEngl J Med 318(10): , Lim SK, Eveland WC, Porter RJ: Direct fluorescent-antibody method for the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonitis from sputa or tracheal aspirates from humans. Appl Microbiol 27(1): , Kovacs JA, Gill V, et al: Prospective evaluation of a monoclonal antibody in diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. Lancet 2(8497):1-3, July 5, Gill VJ, Evans G, et al: Detection of Pneumocystis carinii by fluorescent-antibody stain using a combination of three monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 25(10): , Bigby TD, Margolskee D, Curtis JL, Michael PF, Sheppard D, Hadley WK, Hopewell PC: The usefulness of induced sputum in the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. Am Rev Respir Dis 133: , Broaddus C, Dake MD, Stulberg MS, Blumenfeld W, Hadley WK, Golden JA, Hopewell PC: Bronchoalveolar lavage and transbronchial biopsy for the diagnosis of pulmonary infections in the acquired immunodeficiency syndrome. Ann Intern Med 102: , Medrano F, Montes-Cano M, Conde M, de la Horra C, Respaldiza N, Gasch A, Perez-Lozano MJ, Varela JM, Calderon EJ: Pneumocystis jirovecii in general population. Emerg Infect Dis 11(2):245-50,

16 20.World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual. 3rd ed. Geneva: World Health Organization, US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th ed. Washington, DC: US Government Printing Office, HHS Publication No. (CDC) December

17 Bio-Rad Laboratories For Customer Orders and Technical Service Call: BIO-RAD Website, Bio-Rad Laboratories Main Office, 4000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547, Ph. (510) , Fx. (510) Also in: Gladesville, Australia, Ph , Fx Vienna, Austria, Ph , Fx Nazareth, Belgium, Ph , Fx Rio de Janeiro, Brazil, Ph , Fx Montréal, Canada, Ph , Fx Shanghai, China, Ph , Fx Prague, Czech Republic, Ph , Fx Symbion Science Park, Denmark, Ph , Fx Espoo, Finland, Ph , Fx Marnes-la-Coquette, France, Ph Fx Munich, Germany, Ph. +49-(0) , Fx. +49-(0) Athens, Greece, Ph , Fx Quarry Bay, Hong Kong, Ph , Fx Budapest, Hungary, Ph , Fx Haryana, India, Ph , Fx Rishon Le Zion, Israel, Ph , Fx Milan, Italy, Ph , Fx Tokyo, Japan, Ph , Fx Seoul, Korea, Ph , Fx Mexico D.F., Mexico, Ph. 52(55) , Fx. 52(55) Veenendaal, The Netherlands, Ph , Fx Auckland, New Zealand, Ph , Fx Oslo, Norway, Ph , Fx Warsaw, Poland, Ph , Fx Amadora, Portugal, Ph , Fx Moscow, Russia, Ph , Fx Singapore, Ph , Fx Johannesburg, South Africa, Ph , Fx Madrid, Spain, Ph , Fx Sundbyberg, Sweden, Ph , Fx Reinach BL, Switzerland, Ph , Fx Bangkok, Thailand, Ph , Fx Hemel Hempstead, United Kingdom, Ph. +44-(0) , Fx. +44-(0) Revised July