Naturens läkemedel -Harmin mot cancer?

Transkript

1 Institutionen för Kemi och Biomedicin Examensarbete Naturens läkemedel -Harmin mot cancer? Isabell Berthelsen Huvudområde: Farmaci Nivå: C Nr: 2016:F27

2 1 Naturens läkemedel -Harmin mot cancer? Isabell Berthelsen Examensarbete i Farmaci 15hp Filosofie kandidatexamen Farmaceutprogrammet 180hp Linnéuniversitetet, Kalmar Handledare Kristina Nilsson-Ekdahl, professor Examinator: Christer Berg Inst. för Kemi och Biomedicin SE KALMAR Sammanfattning Harmin är en beta-karbolin som finns i naturen, till exempel i Peganum harmala och andra växter. Det har under lång tid använts traditionellt, bland annat mot olika cancerformer. I den här studien är tanken att undersöka om det finns vetenskapliga stöd för att harmin fungerar mot cancer och i så fall hur. För detta syfte har flera tidigare utförda studier på området undersökts. Harmin har i dessa kunnat visas ha en effekt på tumörutvecklingen, som blir signifikant mindre hos harminbehandlade celler än icke behandlade, utan att harmin för den sakens skull påverkar normala celler i samma utsträckning. Försöken har utförts in vitro och in vivo hos möss. Olika sätt att göra Harmin mer effektivt och mindre toxiskt undersöks också. Till exempel genom att koppla 2-amino-2deoxy-D-glukos eller metionin till harmin, så kan man få ett effektivt upptag i cancerceller som gör av med detta i högre utsträckning. Man kan även substituera med en formiat på R3 på molekylen, och därmed få en kraftig minskning i toxicitet. Verkningsmekanismerna för harmin har också undersöks och tros vara flera bl. a. en ökning av p53 (viktig för bl. a reparation av DNA ), en minskning av COX-2 (ett enzym som kopplats ihop med colon-cancer) samt en minskning av VEGF och andra faktorer för kärl-tillväxt. Mycket återstår dock att studera, bland annat biverkningar på lång sikt och jämförelser med de mediciner som finns på marknaden vore intressanta.

3 2 Abstract Harmine is a beta-carboline present in medical plants such as Peganum harmala that have been used traditionally as anticancer therapy. In this study, the aim was to examine if it really does have an effect on cancer and if so, mechanism of action. To do so several earlier studies on the subject have been examined. The result is promising but there is still a lot to study on the subject. Harmine really does inhibit tumour growth. It has been tested on both cellcultures and mice and has proven to decrease tumourgrowth significantly with little effect on normal cells. There have also been studies were harmine has been modified to be more efficient and less harmful. One way to make Harmine more effective is to put a 2-amino- 2deoxy-D-glucose on the molecule. Since the cancer cell uses a lot of energy for its growth a big proportion of the medicine will end up here. Another way is to attach a methionin-group to it. This is also taken up exccessively by the cancer cells. Substitution in different areas may reduce it s toxicity; Substitution with a formiat at R3 for example decreased its toxicity so that no side effects were seen in the mice in the study whereas harmine in large doses gave neurotoxic symptoms. Harmines antitumour activity seems to be due to several mechanisms of action. For example a higher level of p53 has been observed efter treatment with harmine. P53 has been called the guardian of the genome because of its role in preventing genome mutation. In some studies a decrease in vascular endothelial growth factor (VEGF) has also been seen. This is an important factor for the growth of new vessels toward the tumour-site. A reduction in COX-2 has also been seen. Inhibition of COX-2, for example by NSAID, is associated with lower risk for coloncancer. A fourth possible mechanism of action could be a decrease or inhibtion of CDKs/Cyklins wich are necessary for the cellcycle-progression. Although a promising substance, there is still a lot to study. It would be interesting to se comparations to established drugs on the market and also what the long term side effects of Harmine could be. The studies so far have only been done under a short period of time, i.e., weeks or months.

4 3 FÖRORD Det här arbetet omfattar ca 10 veckors arbete och ingår i Farmaceutprogrammet på Linné-universitetet. Det är gjort som en litteraturstudie där jag gått igenom de tidigare studier som jag hittat på ämnet. Tack till: Min handledare Kristina Nilsson Ekdahl Växjö Isabell Berthelsen

5 4 INNEHÅLLSFÖRTECKNING INTRODUKTION... 5 Kort om cancer orsaker och behandling....5 Om harmin... 6 Syftet med det här arbetet... 7 MATERIAL OCH METODER... 8 RESULTAT Harmin - effekt och eventuell verkningsmekanism....8 P Angiogenes Cox CDK...16 Derivat lead compounds Effektivisera Harmin med 2DG och Metionin 19 JKA97; en benzyliden-analog Eventuell Telomeras-effekt DISKUSSION Kan Harmin i sig orsaka tumörer?...28 Sammanfattning...29 SLUTSATS REFERENSER

6 5 INTRODUKTION Kort om Cancer orsaker och behandling Cancer innebär en oreglerad tillväxt av celler. 1 Dessa celler har slutat att svara på de signaler som normalt kontrollerar cellernas beteende och tillväxt och börjar därmed växa och dela sig på ett okontrollerat sätt. De kan även invadera andra organ och påverka deras funktion och sprida sig vidare runt om i kroppen. 1 Cancern kan utgå från alla olika celltyper i kroppen och det finns därmed över hundra olika sorters cancer. Man brukar dela in cancern i olika klasser beroende på var den uppstår som t.ex. carcinom, (malignitet hos epitelceller), sarcom (i bindväven; t ex muskler, brosk och senor), leukemier (cancer hos blodceller) och lymfom (cancer hos lymfceller) 1. De vanligaste cancrarna är bröst-, prostata-, lung-, och colon-cancer. Man skiljer på benign och malign cancer, där den benigna tenderar att stanna kvar på sitt ställe medans den maligna kan sprida sig (metastasera) i den omliggande vävnaden och dessutom via blod eller lymfa till andra delar av kroppen och därmed lätt blir väldigt allvarlig. 1 Utveckling från en normal cell till en cancercell sker ofta gradvis med nya mutationer (cell)generation för generation. Detta kan vara en anledning till att det ofta tar lång tid att utveckla cancer; coloncancer är t ex tio gånger vanligare i 50- årsåldern än i 30-årsåldern, och incidensen ökar ytterligare tio gånger mellan 50- och 70-årsåldern. 1 Det börjar alltså ofta med att en enda cell pga. av någon mutation börjar växa oreglerat och bildar massor av kloner, under delningen kanske en ny mutation sker hos någon av dessa kloner som ger just den klonen ett försprång. Därmed tar denna klon över på bekostnad av de andra tumörcellerna och på så vis kan cancern bli allt mer aggressiv med tiden. 1 Sådant som kan orsaka cancer kallas för carcinogener. 1 En välkänd carcinogen är t ex cigarettrök. Andra orsaker är strålning, kemikalier och virus. 1 Gemensamt för alla är att DNA skadas vilket kan leda till att diverse genuttryck förändras, om har otur är det en tillväxtreglerande gen som ändras, och man får cancer. 1 Normala celler är beroende av vissa tillväxtfaktorer som kommer utifrån. Ett exempel på en mutation som orsakar cancer kan då vara att cellen tillväxer oberoende av dessa eller börjar att tillverka sina egna tillväxtfaktorer. 1 En annan mutation kan innebära att cellen börjar tillverka proteaser som hjälper den att bryta ner omkringliggande vävnad så att den på så vis kan sprida sig vidare till andra delar av kroppen. 1 De kan också ofta tillverka egna tillväxtfaktorer för bildningen av nya blodkärl (angiogenes) för att bättre kunna försörja sig själva med syre och näring. 1 En sådan faktor är; vascular endothelial growth factor, (VEGF). 19 Ett annat exempel är tumörsuppressorn p53 som kan avstanna celltillväxt, aktivera reparation av DNA och initiera apoptos. 19 En mutation i genen för p53 skulle därmed kunna leda till cancer. Motsatt kan man tänka sig att ett läkemedel mot cancer skulle kunna öka nivåerna av p53 och därmed bekämpa tumörcellerna. Problemet är att en del cancerceller utvecklat en immunitet mot läkemedel som ökar p53 och därmed behövs andra verkningsmekanismer. 2 Många gånger kan det vara så med cancerläkemedel att de fungerar väl till en början, men att det finns en liten grupp celler som överlever eftersom de har någon slags skyddsgen som möjliggör detta, och de kan då sedan tillväxa och renderar läkemedlet verkningslöst. 1 Därför krävs flera angreppspunkter. I de kommande studierna

7 6 undersöks harmins olika eventuella verkningsmekanismer; utöver p53 möjligen bl. a minskning av angiogenes, hämning av CDK/cykliner (signalproteiner nödvändiga för cellcykeln och celldelningen) och påverkan på COX-2 (Ett enzym som bland annat blockeras av NSAID, där man sett minskad coloncancer hos långtidsanvändare). 3 Exempel på cancercell linjer som Harmin testas på i den här studien är HCT116 (Coloncancer) där en av mutationerna tros vara att den producerar för mycket TGFalpha, 4 en tillväxtfaktor som leder till celldelning, differentiering och tillväxt. 5 Ett annat exempel är SW480 (också coloncancer) som bl. a har mutationer i p53 och även uttryck av tillväxtfaktorn c-myc och andra oncogener 6. (En oncogen är en gen som normalt behövs för cellens överlevnad och delning men vid överuttryck alltså kan leda till cancer). Om harmin. Harmin (Figur 3 och 4) är en β-karbolin-alkaloid som finns i flera olika plantor, marint levande djur, insekter och däggdjur inklusive mänsklig vävnad och kroppsvätskor. Främst och i högst doser återfinns det ofta i växtriket; 7 Till exempel i Peganum harmala (Figur 1), harmelbuske, som växer i södra Asien och i mellanöstern samt implanterad i USA. 8 och Banisteriopsis caapi (Figur 2), en sydamerikansk klätterväxt. 9 Figur 1 Peganum.harmala Bild från wikimedia: Public domain Figur 2 Banisteriopsis caapi Bild från wikimedia. Skapare: wowbobwow12

8 7 Figur 3 och 4 Visar Harmins struktur Bilder från wikimedia. Skapare T v: public domain T h: Användare Giorgiogp2 Ämnet harmin isolerades ur Peganum harmala Det har visat flera olika farmakologiska aktiviteter, som antimikrobiella, antifungala, antiplasmodiska, cytotoxiska, antioxidanta, antimutagena, antigenotoxiska och hallucinogena egenskaper, samt tycks motverka cancer. 7 Harmin binder reversibelt till MAO-A och hämmar detta men påverkar ej MAO-B som bl.a. metaboliserar dopamin. 10 MAO-A metaboliserar monoaminer som serotonin, dopamin, melatonin, adrenalin, noradrenalin och psykedeliska droger som psilocybin, DMT och mescaline 11.Därför har B.Caapi ofta använts traditionellt av befolkningen i Amazonerna, i bl. a drinken Ayahusca, ihop med växter som innehåller DMT för att öka dess hallucinogena effekt. Det hindrar nedbrytning av DMT och DMT kan därmed utöva sin effekt i kroppen (DMT verkar agonistiskt på serotoninreceptorer och framkallar hallucinationer). 12 Harmin är även i sig hallucinogent genom att det ökar serotoninnivåerna. MAO-hämmare används även idag mot depression, där de nyare, som liksom Harmin enbart påverkar MAO-A, ger mindre biverkningar än de äldre som påverkar även MAO-B. (speciell tyramin-fri diet behöver t ex inte hållas lika restriktivt, mindre risk för hypertensiv kris mm). 13 Det har därför även gjorts viss forskning på harmin som medel mot depression. 14 Peganum Harmala har länge använts traditionellt som färgmedel, lusmedel, maskmedel mot hudinflammationer och tumörer, med mera. 8 På senare tid har flera studier utförts gällande Harmin och dess effekt mot cancer 10 samt även på andra områden som hjälp mot depression, 14 Alzheimers, 15 osteoporos 16 mm. Syftet med det här arbetet I den här studien vill jag främst titta på harmin och dess anti-cancerogena egenskaper. Det har gjorts ett flertal studier på området som jag har gått igenom för att titta på effekt och eventuella verkningsmekanismer. Det finns många muntliga vittnesmål om Ayahuasca som bot mot cancer liksom ett antal publicerade fallstudier, men inga regelrätta studier där man använt harmin eller derivat för att bota cancer. Jag har därför fokuserat på de studier som är gjorda på möss och cellkulturer.

9 8 MATERIAL OCH METODER Jag har för mitt arbete använt mig av artiklar som finns att hitta genom PubMed. Jag har försökt att välja ut artiklar som kunnat visa på resultat med statistisk signifikans (p<0,05 eller p<0,01) samt har använt sig av kontroller för att kunna jämföra resultatet. Enstaka fall-rapporter har inte tagits med. Vissa artiklar har varit mer utförliga än andra och jag valt att lägga lite mer fokus på dessa. Där så har varit tillåtet (creative commons) har jag tagit med tabeller och bilder från aktuella studier, i annat fall har jag själv gjort tabeller utifrån de resultat som presenterats. RESULTAT (RESULTS) Harmin - effekt och eventuell verkningsmekanism P53 I en studie från undersöktes Harmins effekt på endotelceller samt hur det påverkar bildningen av p53, vilket är ett protein som kallats genomets väktare; det kan bl.a. avstanna celltillväxt, aktivera reparation av DNA och initiera apoptos och andra viktiga proteiner i cellcykeln för att ta reda på eventuell verkningsmekanism. Man använde sig av HUVEC-celler; d.v.s. celler från endotel i vener i human navelsträng. MDM2 är ett protein som interagerar med p53 och minskar dess funktion. 17 Ett antal studier hade tidigare visat att genom att hämma p53-mdm2-bindningen så kunde man öka aktiveringen av p53 och därmed få mindre tumörtillväxt. 17 Man testade därför först harmins inverkan på MDM2-p53 hos HUVEC under 48 h med hjälp av co-immunoprecipitation assay (en teknik för att fånga upp protein ur en lösning med hjälp av dess antikroppar) med p53- och MDM2-antikroppar. Man kunde se att mängden MDM2 associerat med p53 minskade kraftigt med ökade mängder av harmin, detta trots att p53 ökade under försöket. Harmin tycktes alltså minska interaktionen mellan de båda. Fosforylering av p53 på olika områden som till exepel ser-15, 20 och 37 är involverad i regleringen av densamma. Det hindrar bindningen mellan p53 och MDM2 samt hindrar ubiquitinisering 17 (ubiquitin märker proteiner som ska brytas ner) av det. För att undersöka harmins effekt på fosforyleringen så undersöktes dessa tre områden med hjälp av western blot (Figur 5). Harmin ökade signifikant och dosberoende fosforyleringen på ser-37 och ser-15, men hade ingen större effekt på fosforyleringen av ser-20 i endotelcellerna. Man vet att fosforylering av p53 även sker på grund av DNA-skada. Man använde sig därför av comet-assay, en metod för att mäta mängden strand breaks, DNA-skada, hos cellerna för att undersöka om fosforyleringen berodde på detta men kunde inte se någon uppenbar skada.

10 9 Man tittade sedan på om uttrycket av proteinen p53 och MDM2 påverkades av harmin. Harmin ökade uttrycket av p53 men hade ingen större effekt på MDM2. Figur 5 Bild hämtad från studien 17. A) Efter behandling av HUVEC-cellerna med Harmin under 48 h, undersöktes p53-mdm2 med co-immunoprecipitation assay. Överst ses MDM2 bundet till p53. Nederst ses totalt MDM2 samt totalt p53 (B) HUVEC behandlades med harmin under 48 h. Fosforyleringen av p53 på ser-15, ser-20 och ser-37 uppskattades med western blot Man tittade även på p53-proteinets stabilitet genom att tillsätta CHX (cykloheximid, ett ämne som bl. a bildas av vissa bakterier) som hindrar proteinsyntsen. 17 Därmed bildas inga nya proteiner, och man kan mäta hur snabbt de gamla bryts ner. Efter 8 h så minskade p53 hos de celler i kontrollgruppen som man tillfört CHX, men hos de som fått Harmin (20 µm) kunde man inte se någon signifikant minskning. Harmin tycktes alltså ha en skyddande effekt på p53. En tidigare rapport 18 hade visat på att brytning av p53-mdm2-bindningen och fosforylering av p53 ledde till att p53 samlades i cellkärnan. Man undersökte därför cellkärna och cytoplasma med western-blot och kunde se att harmin gav en ackumulation av p53 i cellkärnan. När p53 samlas i cellkärnan kan de utöva sin effekt på transkriptionen. 17 Det påverkar bla p21 (P21 är ett protein som inhiberar G1-S/CDK-komplex, molekyler som är viktiga för övergången från G1 till S-fas), Survivin (som hindrar apoptos), CDC2, Cyklin B1 och CDK2 17 (även dessa viktiga för att cellcykeln ska fungera). I vilken mängd dessa gener uttrycktes vid närvaro av Harmin undersöktes därför (Figur 6). Man kunde se att mrna nivån för p21 ökade, medan den minskade för survivinin, CDC2, Cyklin B1 och CDK2 i dosberoende mängd. Figur 6 Bild från studien 17. Protein-expression av p21, cyklin B1, CDC2, cyklin A, CDK2, cyklin D1 och cyklin E hos HUVECs behandlade med harmin under 48 h

11 10 Angiogenes Man kunde även se att harmin ökade uttrycket av en annan av p53-proteinets målgener, TSP-1 och Bai1 som båda inhiberar angiogenes. Efter detta tittade man på apoptosen hos de celler celler som behandlats med harmin under 48 h jämfört med de som inte fått harmin (Figur 7A). Man använde sig av Annexin/PS-staining; annexin binder till PS (phosphtidylserine) hos celler som genomgått apoptos. Man såg då att 20 µm harmin ökade apoptos trefaldigt jämfört med kontrollgruppen. (15.45 % vs 5.34 %). Man studerade cellcyklen där cellerna i det här försöket tycktes stanna upp i G2/M fasen (Figur 7B). Proliferation (Figur C) och migration minskades även de i dosberoende mängd. Figur 7 Bild från studien 17 (A) Proportionen av apoptotiska celler ökade med harmin. Harmin inducerade klyvning av PARP och minskade expression av survivin and Bcl-2. Mängden klyvt PARP och expressions-nivåer av survivin and Bcl-2 hos harmin-behandlade HUVECs analyserades med western blot analys (B) Cell-cykel-fördelning hos HUVECs vid behandling med olika koncentration harmin. Cellerna behandlades med olika koncentrationer under 48 h, och cellcykeln analyserades sedan med flödescytometri. (C) Inhibition av tillväxt hos HUVECs av harmin, bedömd med MTS assay. Alla experiment utfördes med tillsats av harmin under 48 h. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.

12 11 Man testade ytterligare påverkan på angiogens med hjälp av rat thoracic aorta ring assay där man skivar ut och isolerar ringlika strukturer från en råttas aorta och odlar den under flera dagar (i det här försöket 7) för att se hur olika ämnen påverkar angiogenesen. Den genomsnittliga tillväxten av nya blodkärl var endast 30 % i harmin-gruppen jämfört med kontrollgruppen (Figur 8A). Man studerade även angiogenesen in vivo hos möss med corneal angiogenesis assay. Ämnet man vill studera -I det här fallet harmin (5 µg), läggs in i hornhinnan, där normalt inga blodkärl finns, tillsammans med VEGF som stimulerar kärltillväxt, och därmed är det enkelt att se ny kärltillväxt vid försökets slut. Harmin blockerade signifikant kärltillväxten hos mössen (Figur 8B-C). Figur 8 Bild från studien 17. A) Till vänster representativa bilder och till höger optisk densitet av utväxande mikrokärl från rat thoracic aorta rings i frånvaro samt närvaro av harmin. Mikrokärlens densitet i kontrollgruppen sattes till 100 %. (B) Representativa bilder av blodkärl hos kontrollgruppens ögon (till vänster) och harminbehandlade ögon (till höger). Svarta pilar indikerar blodkärl. (C) Kärllängden, clock number, och blodkärlens area hos kontroll och harmin-behandlade grupper. Dag 7 sövdes mössen och bilder på blodkärl hos kontroll och harmin-behandlade ögon togs (n = 10). *, P<0.05; **, P<0.01.

13 12 Man studerade sedan Harmins effekt på tumörtillväxt in vivo hos möss som inympats med lungtumörer. Efter 21 dagar hade den gruppen som fått harmin (30 mg/kg) avsevärt mindre tumörer än kontrollgruppen (Figur 9A). De som fått harmin hade samma kroppsvikt som den obehandlade gruppen vid försökets slut (Figur 9B). Med hjälp av antikroppar som binder in till endotelceller kunde man undersöka angiogenes hos djuren, och såg då att kärltillväxt hos de behandlade mössen var mycket mindre (Figur 9C). Figur 9 Bild från studien 17. A) Inhibition av tumörtillväxt hos harminbehandlade möss som inympats med mänsklig lungcancertumör. Bilder av solida tumörer hos kontroll och harminbehandlade möss visas (B) Storleken på tumören bedömdes i frånvaro samt i närvaro av harmin. C) Blodkärl till tumör hos kontroll och harmin-behandlade möss. Blodkärlen märktes med anti-vwf och anti-cd31 antikroppar. Svarta pilar indikerar blodkärl. D) Tillväxt-inhibition av A549 lung-cancer celler behandlade med harmin under 48 h, bedömt med MTS assay. (E) Kvantitativ data för A549 lungcancer-celler bedömt med migration assays. A549 lungcancerceller behandlades med harmin under 12 h och jämfördes med kontroll. *, P<0.05;**, P<0.01; ***, P<0.001 Figur 10 Bild från studien 17. En eventuell verkningsmekanism för att förklara harmins tumörminskande och angiogeneshämmande egenskaper. Harmin ökar aktiveringen av p53 och ökar ackumulation av stabilt p53 i cellkärnan. Det stabila p-53 nedreglerar dess målgeners uttryck, som t ex CDC2, cyclin B1, survivin och Bcl-2, vilket leder till att cellcykeln stannar av och apoptos hos HUVECs. Dessutom, p53uppreglerar p53 uttrycket av TSP-1 och Bai1. Alla dessa händelser ger minskad angiogenes och tumörtillväxt

14 Antal Kapillärer 13 Det finns fler studier som visar på minskad angiogenes. I en studie från använde man sig av 4-6 veckor gamla hanmöss som delades in i tre grupper om 8 möss vardera. För att stimulera angiogenes injicerades B16F-10-celler (hudmelanon hos mus 19 ) intradermalt i buken hos alla möss. Sedan fick en grupp behandling med harmin (10 mg/kg), en grupp behandlades med saltlösning och en behandlades med TNP 470 (30 mg/kg), som är en känd hämmare av angiogenes. Vid två tillfällen, efter 24 timmar och efter 9 dagar samlades blod upp från caudal-venen (i svansen), serumet separerades och med hjälp av ELISA-kit, en metod där man använder antikroppar och färgomslag för att identifiera olika ämnen, undersöktes olika cytokiner. Efter den nionde dagen avlivades även djuren och huden på buken dissekerades och rengjordes så att antalet kapillärer som växt ut mot tumören kunde räknas med mikroskop (Figur 11). Antalet nya kapillärer var signifikant mindre hos de möss som behandlats med harmin (51,32%) jämfört med kontrollen. Antalet nya kapillärer hos de harminbehandlade mössen var jämfört med 31.5 hos kontrollgruppen. De som fått TNP-470 visade en ännu mindre kärl-tillväxt med endast 3.33 nya kapillärer. Nybildning av kapillärer 31,5 15 Figur 11 Egen figur efter studiens 19 data. Antal kapillärer hos möss behandlade under 9 dagar med saltlösning, harmin, och TNP-470. P<0.001 jämfört med kontroll I den här studien mättes även cytokinerna IL-1β, IL-6, TNF-α och GM-CSF. Hos kontrollgruppen var dessa kraftigt ökade jämfört med normala nivåer. VEGF ökade likaså hos kontrollgruppen medans de hos de harmin-behandlade mössen inte alls ökade lika kraftigt. Man undersökte även IL-2 och TIMP, två ämnen som motverkar angiogenes. Dessa höjdes kraftigt vid behandling med harmin medan de minskade hos kontrollgruppen. Även kväve-oxid påverkar angiogenesen och därför mättes även den. Här såg man också att den var avsevärt lägre hos den harminbehandlade gruppen (23.21 µm) jämfört med den obehandlade gruppen (38.95 µm). Det normala värdet är µm. Man kontrollerade harmins toxicitet genom att tillsätta olika koncentrationer till HUVEC-celler in vitro. LD50, den dos varvid hälften av cellerna dör, visade sig vara 32.6 µg/ml (Figur 12). Inga toxiska effekter sågs på cellerna i doserna 0.5, 1 och 2 µg/ml och därför användes dessa koncentrationer under senare försök. 3,33 KONTROLL HARMIN TNP 470

15 Antal celler Cellöverlevnad % 14 Cellöverlevnad Harmin koncentration Figur 12 Egen figur efter studiens 19 data. Cellöverlevnad hos HUVECs efter 24 h behandling med Harmin i olika koncentrationer bedömdes med MMT assay Man undersökte också proliferation med Thymidine Incorporation Assay som mäter nybildning av DNA. Då man stimulerade HUVEC-celler med VEGF visades en väldigt hög proliferation hos kontrollgruppen jämfört med harminbehandlade celler. Hos de celler som behandlades med högsta dosen 2 µg/ml visades 64.8 % inhibition (Figur 13). Man tittade sedan på migration hos HUVEC-cellerna genom att skrapa bort en del av cellerna och alltså skapa en slags skada, där man sedan kunde mäta migration av nya celler in i detta område. VEGF tillsattes för att stimulera migrationen. De celler som behandlades med harmin µg/ml uppvisade väldigt mycket lägre migration (211, 110 och 19 migrerade celler) jämfört med de som inte behandlades. (397 migrerade celler). (Figur 13) Harmin minskade även invasionen då man undersökte hur många celler som tog sig igenom ett polykarbonat-lager. I den obehandlade kontrollen sågs 1903 celler under polykarbonatlagret jämfört med 1378, 986 och 335 celler för de som behandlats med harmin 0.5 µg/ml, 1 µg/ml och 2 µg/ml. Påverkan på invasion och migration ,5 986, ,5 18,8 KONTROLL 0,5 1 2 µg/ml Invaderande celler migrerande celler Figur 13 Egen figur efter studiens 19 data. Cellmigrationen till det skadade området som uppskattades med hjälp av cellräkning, och cellinvasionen som upskattades genom att räkna antalet celler som invaderat genom ett polykarbonatlager.

16 Relativt COX-2-uttryck 15 Man såg även en klart minskad tubformation (som krävs för angiogenes) hos celler som behandlats med 2 µg/ml jämfört med kontrollgruppen. Även i detta försök använde man sig av rat aortic ring assay för att undersöka kärltillväxt in vitro. Man tillsatte medium från B16F-celler och inkuberades med eller utan olika koncentrationer harmin. Man såg en kraftig minskning av mikro-kärl hos den grupp som behandlats med 2 µg/ml jämfört med den grupp som ej behandlats. Ännu större effekt såg man då man använde medium från B16F-celler som redan behandlats med harmin. Man undersökte förekomst av MMP, (som är enzym som bl.a. kan bryta ner extracellulär matrix och därmed spelar en roll vid migrationen) enkelt uttryckt genom att titta på nedbrytning av gelatin, och såg en klar ökning hos celler som ej behandlats med harmin. Cox-2 Man såg i samma studie 19 även en signifikant minskning av VEGF, inos (som ökar bildandet av kväveoxid) och COX-2-Rna hos celler behandlade med harmin. De låg på 45.2 %, 52.3 % och 15.3 % respektive jämfört med kontrollen. Även i en annan studie 20 där man använde BGC-823 och SGC-7901-celler (coloncancer) såg man en klart minskad COX-2-expression relativt till GAPDH (ett enzym som brukar utryckas i samma mängd hos de flesta celler och som därför ofta används som kontroll i western-blot) efter behandling med harmin. Detta även vid låga doser (Figur 14). Påverkan på COX-2-uttryck 1,2 1,1 0,95 0,78 0,85 0,6 0,7 0, Harmin koncentration µg/ml BGC-823 SGC-7901 Figur 14 Egen figur efter studiens 20 data. Cox-2-uttryck visas här relativt till GAPDH. Alla data visar medel från tre olika experiment. P<0.001 jämfört med kontroll

17 Levande celler (%) 16 CDK I en studie från tittade man på harmins effekt på Cdk1/cyklin B, Cdk2/Cyklin A och Cdk5/p25. Harmin visade sig inhibera alla dessa CDKs i dosberoende mängd. För att testa specifitet undersökte man effekten på ett antal andra olika kinaser, där låg eller ingen effekt sågs annat än vid mycket höga koncentrationer (över 250 µm jämfört med µm för de undersökta CDKs) IC50 visade sig variera beroende på hur stor mängd ATP-Mg2+ som tillsattes, vilket eventuellt skulle kunna tyda på att harmin binder kompetitivt till dess receptor på Cdk. Eftersom CDKs är väldigt viktiga för cellcykeln gick man vidare och undersöktes harmins effekt på proliferation hos tre olika cellinjer; HeLa (cervixcancer), MCF-7 (bröstcancer) och SW480 (colon-cancer). Alla celler behandlades med harmin i stigande koncentrationer. Harmin minskade proliferationen kraftig i dosberoende mängd (Figur 15), LD50 var 8, 15 och 22 µm. Som jämförelse testade man även harmin på Swiss 3T3 fibroblaster, som var i ett vilande stadium och alltså ej genomgick proliferation. De flesta celler var här levnadsdugliga även efter den högsta koncentrationen av harmin i 5 dagar Påverkan på cellöverlevnad Harmin (µm) HeLa MCF-7 SW480 Swiss 3T3 Figur 15 Egen figur efter studiens 21 data. Antiproliferation undersökt på tre olika cancercellinjer; HeLa, MCF-7 och SW480, samt vilande Swiss 3T3-fibroblaster. Dessa behandlades med olika koncentrationer Harmin under fem dagar innan överlevnad bedömdes med MTT assay. Varje försök upprepades fyra gånger. Under cellcykel är Cdk2 en viktig regulator för DNA-replikationen och övergång till S fas, 21 därför ville man titta på harmins effekt på DNA-replikation och använde sig då av [H]thymidine incorporation assay. (En radioaktiv thymidin inkorporeras här i nytt DNA och man kan därefter räkna mängden nytt DNA i cellerna) Man använde SW480-celler i den här delen av försöket och såg då att harmin starkt inhiberade inkorporationen av [H]thymidine i DNA. 50 % inhibition uppnåddes vid dosen 23 µm och i stort sett 100 % vid 75 µm.

18 % 17 Derivat 8 lead compounds I en kinesisk studie från undersöktes effekt men även toxicitet av harmin och åtta derivat (Figur visar ett par av dessa). Man kunde då se vilka grupper som kan bytas ut för att öka effekt och minska toxicitet. Tanken var att ta fram ett så kallat lead compound, ett ämne att arbeta vidare med och kanske hitta ytterligare förbättringar. Administration av dessa ämnen (7,5mg/kg) under 7 dagar gav tumörreduktion med ,5 % jämfört med kontrollgrupp hos möss som bar på Lewis lungcancer, sarkoma 180, eller HepA tumör, med högst verkan för derivat 8 följt av ämne 6 (Figur 16). Effekt och toxicitet , , ,8 31,5 19, , Ämne Toxicitet Tumörinhibition Figur 16 Egen figur efter studiens 22 data. Tumörinhiberande effekt och toxicitet vid behandling med harmin och dess derivat. Toxiciteten i denna tabell grundar sig på ämnets LD50 (inverterat) samt hur svåra neurotoxiska symptom som uppvisades. Svåra symptom gav tio poäng, medelsvåra 5 poäng och inga symptom 0 poäng. Alla ämnen utom nummer 2 och 5 gav dock ganska svåra till svåra neurotoxiska symptom; Darrningar, ryckningar, hoppningar och lemmar som krampaktigt vred sig utåt. Särskilt då vid den högre doseringen då man skulle fastställa LD50 för de olika ämnena (den dos av vilken 50 % av försöksdjuren dör, vilket här var upp till 100 mg/kg). Med ämne 2 blev mössen istället trötta och visade minskad aktivitet men visade inga av de allvarligare symptomen som de som fått de andra ämnena gjorde. Med ämne 5 sågs ingen neurotoxisk påverkan i de doser som testades. Med SAR-analys (studier av hur man kan förbättra ett ämnes egenskaper genom att ändra dess kemiska eller tredimensionella struktur) kunde man se att genom att koppla en formiatjon på R3 på harmins tricykliska kolskelett (vilket gjordes på ämne 2-5), så tycktes man kunna minska dess neurotoxicitet. Substitution med en kort aryleller alkylgrupp på R9 (ämne 3-9) tycktes däremot öka den tumörminskande effekten.

19 18 Figur 17 Harmin Figur 18 Här visas de områden man undersökte substituering på; R1, R3, R7 och R9 Figur 19 Ämne 5. Substitution med en formiat på R3 gjorde detta ämne klart mindre toxiskt medan arylgruppen på R9 ökade den tumörminskande effekten Figur 20.Ämne 6 var effektivt tack vare metylsubstitution på R9 med hade högre toxicitet då ingen substitution på R3 gjordes. Figur 21 Ämne 8. Även det effektivt men ganska toxiskt då ingen skyddande formiatgrupp substituerats på R3 Egna figurer enligt studiens 22 data. Ämne 1, 6, 7 och 8 användes sedan för ett försök där man undersökte apoptos och visade sig inducera apoptos in vitro hos HepG2-celler (40 µg/ml av vartdera ämnet i 48 h) med 25,8, 55,34, 3,60 och 43,63 % respektive jämfört med 1,07 % för kontrollcellerna. Högst effekt var alltså även här för ämne 6 och 8. Man kunde även se en ökad mängd celler som befann sig i G2-M-fasen och en minskad mängd i G1 fasen, vilket kan tyda på att de stannat i cellcykeln. Med western blotting analys kunde man se att ämne 6 helt och hållet hindrade genexpression av Bcl-2 medan ämne 1 och 8 gav minskning med 40 och 60 %. Bcl-2 är en oncogen som är anti-apoptotisk och starkt förknippad med tumörbildning då den överproduceras. 22 Ämne 1,6,7 och 8 ökade även uttrycket av dödsreceptorn Fas med %. Däremot var uttrycket av Bax (Bcl-2 associerat protein, apoptotiskt 16 ) och p53 oförändrat i HepG2-celler i den här studien när man behandlade med dessa ämnen.

20 Cellöverlevnad (%) Cellöverlevnad (%) 19 Effektivisera Harmin med 2DG och metionin I en kinesisk studie från ville man göra harmin mer effektiv genom att koppla på en 2-amino-2deoxy-D-glukos (2DG) på harmin. 2DG, som är en glukosanalog, kan tas upp av cellen via GLUT-1-receptorn. Dock är den annorlunda i sin struktur då den saknar en hydroxylgrupp på position 2 och bryts då ej ner utan fosforyleras och stannar sedan kvar inuti cellen utan att kunna brytas ner. Eftersom tumörceller är extremt energikrävande har 2DG visat sig kunna avsevärt öka upptaget i just dessa celler och därmed ge en ökad effekt. Man tillverkade fyra derivat, ämne #1 med etyl och #2 med phenylpropyl på position nio på harmin, samt ämne #1 och #2 som var samma men med en 2DG kopplad till position 7. Eftersom ämne #2 och # 2 visade sig klart mer effektivt gick man vidare med detta och jämförde det i olika koncentrationer med harmin och 5-FU (ett känt cancerläkemedel) på cancer-cellinjen HepG2 och på den normala cellinjen L02. Ämnena #2 och # 2 gav i stort sett ingen påverkan på överlevnaden hos L02 cellerna, vilket 5-FU gjorde. När det gällde HepG2-cellerna var ämne 2 klart mest effektivt; Vid den högsta dosen sågs kring 10 % överlevnad hos HepG2 medan den med 5-FU var över 80 % och med ämne #2 (utan 2DG) ca 70 % (Figur 22-23). Cellöverlevnad HepG2 Cellöverlevnad L , Koncentration µm Harmin #2' 5-FU #2 6, Koncentration µm Harmin #2' 5-FU #2 Figur 22 och 23 Egna figurer enligt studiens 23 data. Cellöverlevnaden beräknad med MTT assay vid behandling med harmin, ämne 2, ämne 2 och kontroll i olika koncentrationer i 52 h. (n=5) I en annan studie 24 även den från Kina publicerad år 2014 studerades också harmin och derivat för att kunna få fram ett ämne med hög terapeutisk effekt och låg toxicitet. Man hade i tidigare studier (som i studien ovan) kunnat se att 2-amino- 2deoxy-D-glukos (2DG) och även metionin 25 kunde ge högre affinitet för cancerceller jämfört med vanliga celler. Detta då cancercellerna har väldigt hög omsättning av energi. Hur 2DG verkar för bättre precision nämndes i det förra stycket. När det gäller metionin är det en svavelhaltig aminosyra som har flera viktiga roller i metabolismen, t ex som den första aminsyran (som startkodonet kodar för) proteinsyntesen. Den transporteras via LAT1- och LAT2-receptorer som uttrycks i extra hög grad hos maligna celler. 24 Maligna celler är ofta mycket mer beroende av metionin för tillväxt än friska celler. 24

21 20 Av dessa anledningar valde man 2DG och metionin att koppla på harmin för att få ett ämne med högre specificitet för maligna celler och därmed färre biverkningar (Figur 24-25). Man hade tidigare sett att hydrofila stora/skrymmande grupper vid R2 och R9 på harmin kunde öka dess cytotoxiska aktivitet, även så på R7, där metoxigruppen i vanliga fall troddes bidra till den neurotoxiska effekten. Med en lång kolkedja här hade ingen neurotoxisk effekt alls setts i tidigare studier. 24 I denna studie satte man 2DG eller metionin på position 7, en fenylpropyl på position 9 (C9H11) och en benzyl på position 2 på harminringen. Figur 24 och 25 Figurer från studien 24. Ämne 1 med 2DG på position 7, fenylpropyl på position 9, och benzyl på position 2, samt ämne 2 med metionin på position 7, fenylpropyl på position 9 och benzyl på position 2 kopplat på harmin. Man testade först de båda ämnena på fem humana cancercell-linjer (SMMC-7221, HuH7, HepG2, LOVO, MCF-7). Den vanliga harmin-molekylen och 5-FU användes som kontroller. 2DG-Har-01 visade starkare aktivitet än kontrollerna på LOVO och SMMC-7721 celler. MET-harmin-02 visade starkare aktivitet på alla cell-linjer, särskilt på SMMC-7721 och HuH7 (Figur 26A-E). Dessutom så visade sig de båda derivaten inte alls lika toxiska för normala mänskliga leverceller som harmin och 5-flourouracil (Figur 26F). Man gick vidare och undersökte kolonibildning av celler behandlade med MET-Har-02 och Harmin, båda visade sig minska kolonibildningen vid koncentrationen 5 µm, även om Met-Har-02 visade högre effekt. (Figur 26 G) Vid koncentrationen 10 µm sågs ingen koloni när koncentrationen av MET-Har-02 ökades till 10 µm.

22 21 Figur 26 Hämtad från studien 24. Antitumör-effekt och cytotoxicitet för 2DG-Har-01 och för MET- Har02. A: HepG-2-celler, B: Huh7-celler, C: LOVO-celler, D: SMMC-7721-celler, E: MCF-7-celler och F: L02 (normala leverceller) vid inkubation i olika koncentrationer under 52 h G och H: Visar antalet kloner vid behandling med olika koncentrationer Harmin och Met-har-02. (n=5) under 7 dagar Man antog att den tumörminskande effekten berodde på ökad apoptos. Genom märkning av celler (m h a Annexin V och P1) kunde man se de celler som befann sig i tidig apoptos och sen apoptos samt nekrotiska celler. Efter behandling med MET- Har-02 i en koncentration av 7,5 µm i 24 h sågs en ökning av apoptos med 21 %. Inte ens vid en koncentration av 15 µm harmin sågs en högre apoptos än 7 %. Efter dessa inledande försök gick man vidare och testade på möss som hade fått inympat S180-tumörer. Sedan behandlades mössen med antingen 2DG-Har-01, MET-Har-02, harmin, 5-flourouracil eller saltlösning och följdes under 16 dagar. Av alla behandlingar visade sig MET-Har-02 effektivast med 67,86 % mindre tumörvolym än de som behandlats med saltlösning. 2DG-Har-01 visade på 42,84 % minskning och harmin på 30,93 % mindre än de som behandlades med saltlösning (Figur 27A). Tumörvolym för 5-flourouracil-gruppen nämns inte här. På bilder av tumörerna efter försökets slut kunde man dock se stora skillnader (Figur 27B). Kroppsvikten hos mössen som fått saltlösning började minska efter den åttonde dagen; ett tecken på tumörbördan. För de som behandlats med 2DG-Har-01 och MET-Har-02 ökade kroppsvikten under behandlingen. En lätt minskning av kroppsvikten sågs dock i slutet av försöksperioden (Figur 27C). Ingen mus som behandlades med 2DG-Har-01 dog under det 16 dagar långa experimentet, 1 (10 %) mus dog av de som fått MET-Har-02, 2 av de som fått harmin och hela 7 av de som

23 22 fått saltlösning (Figur 27D). Inte heller här nämns dock hur det gick för gruppen som fått 5-flourouracil. Man gjorde även om testet med möss som bar på MCF-7-tumörer, fast då gick man enbart vidare med Met-Har-02, som jämfördes med harmin och saltlösning. Här visade MET-Har-02 på en 63,5 % mindre tumör vid försökets slut efter 21 dagar än de som fått saltlösning. De möss som hade fått harmin hade 35 % mindre tumörvolym än de som fått saltlösning (Figur 27E). Kroppsvikten hos de som behandlats med MET-Har-02 låg något under de som fått saltlösning. (Figur 27EF) I MET-Har-02-gruppen levde 8 försöksdjur efter 21 dagar, 7 st. i harmingruppen, men bara 1 av de som fått saltlösning (Figur 27G). Man gjorde även en patologisk undersökning av tumörvävnaden. Där såg man klart störst förändringar för MET- Har-02-gruppen, med flest döda celler i tumörens centrum samt mindre volym av de omgivande cellerna. Figur 27 Hämtad från studien 24. Antitumöreffekt in vivo för 2DG-Har-01 och MET- Har-02 på möss bärande på S180 och MCF- 7-tumörer. A: Tumörvolym hos möss med S180-tumörer vid olika behandlingar; 2DG- Har-01, MET-Har-02, harmin och koksalt. (n=10) B: Bilder på tumörer av möss med S180-tumörer i olika grupper; 2DG-Har-01, MET-Har-02, harmin och koksalt) C: Kroppsvikt hos mössen med S180-tumörer efter de olika behandlingarna. D: Överlevnadsstatistik hos mössen med S180- tumörer efter de olika behandlingarna. E: Tumörvolym hos möss med MCF-7-tumörer vid olika behandlingar; MET-Har-02, harmin och salin. (n=10) F: Kroppsvikt hos mössen med MCF-7-tumörer efter de olika behandlingarna. G: Överlevnadstatistik för mössen med MCF-7-tumörer efter de olika behandlingarna. H: Bilder från histologisk undersökning av de olika grupperna Man gjorde även toxicitetsstudier där mössen injicerades med både 2DG-Har-01 och MET-Har-02 i doser av 10, 50, 100, 200 och 500 mg/kg. Inga tecken på neurotoxicitet syntes, såsom ryckningar, skakningar, kramper, död. De möss som fick 100 mg harmin/kg visade omedelbart på neurotoxiska symtom. I slutet av försöket vägdes även mössens lever, och man kunde då se signifikant ökad levervikt hos de som behandlats med harmin, dock ej hos de båda derivaten mer än en lätt

24 23 ökning av leverns volym hos de som fått MET-Har-02. Man kontrollerade även AST, ALT, CK och BUN medans de levde. (Dessa är markörer för dålig funktion/sönderfall av hjärta, lever, njure, muskler mm). De som behandlats med harmin visade en markant ökning. Endast en lätt ökning sågs med MET-Har-02. Vid patologisk undersökning av organen kunde man inte se någon uppenbar skada på hjärta och lungor medan levern endast för de som behandlats med harmin uppvisade svullnad. Hos njurar såg man lite patologisk skada för både harmin och MET-Har- 02-gruppen, men de som hade behandlats med harmin hade värre skador än de som fått MET-Har-02. Man tycks alltså ha skapat ett mycket mer potent och mindre toxiskt ämne än harmin. Det hade varit intressant att se dessa i jämförelse med 5- flourouracil vilket de endast visade på bilden med tumörstorlekarna. Det hade varit intressant att kunna jämföra ett etablerat läkemedel i de andra delarna av studien också. JKA97; en benzyliden-analog I en kinesisk studie 26 från 2012 undersöktes ämnet JKA97 (Figur 28), en syntetiskt framställd benzyliden-analog till harmin, gällande effekt mot bröstcancerceller och vilka eventuella faktorer som den verkar igenom. Figur 28 Hämtad från studien 26. JKA97. Man studerade JKAs effekt på tre olika bröstcancercell-stammar; MCF7 ( P53 wildtype, som producerar normalt p53), MCF7 ( p53 knockdown där man slagit ut p53-produktionen) och MDA-MB-468 ( p53-mutant där p53 finns men ej fungerar korrekt). Dessa tre stammar utsattes för olika koncentrationer av JKA97 (0, 1, 2.5, 5, 10, 25 och 50 µm) under 72 timmar, efter vilket cellöverlevnaden bestämdes (Figur 29). IC50-värden på mindre än 20 µm uppmättes ( µm). MDA-MB-468 och MCF7 p53 KD tycktes känsligare än MCF7. Figur 29 Hämtad från studien 26. Koncentrationer JKA som behövdes för 50 % tillväxtinhibition jämfört med kontroll JKA97 inhiberade även proliferation, en effekt som var dosberoende. Man såg signifikant antiproliferation-effekt hos samtliga tre cellinjer. Vid en koncentration av 20 µm så inhiberades 35 % av proliferationen hos MCF7, 35 % av MDA-MB-468 och 45 % av p53kd (Figur 30).

25 24 Figur 30 Hämtad från studien 26. Antiproliferation-effekt vid behandling av JKA på olika bröstcancerceller de utsattes för olika koncentrationer under 48 h. (Jämfört med kontroll) p<0.05 JKA97 inducerade även apoptos hos bröstcancerceller, där alla tre celltyper visade på en signifikant (p<0.05) ökad apoptos efter att ha utsatts för en koncentration av 20 µm av ämnet. Apoptosen ökade 3.9-faldigt hos MCF7-cellerna, 5-faldigt hos MDA- MB-468-cellerna, och 4.2-faldigt hos MCF7KD-cellerna (Figur 31). Figur 31 Hämtad från studien 26. Påverkan av behandling med JKA97 under 24 h på apoptos hos olika bröstcancer-celler vid olika koncentrationer. (Jämfört med kontroll) p<0.05 Man kunde även se att cellcykeln tycktes avstanna, där fler celler tycktes stanna i G1-fasen (Figur 32-34). 5 µm JKA97 gav en signifikant ökad (p<0.05) mängd celler i G1-fasen hos alla tre cellslag. 20 µm gjorde att en majoritet av cellerna stannade upp i G1-fasen. (p<0.05) Figur Hämtade från studien 26. JKAs effekt på cellcykeldistributionen hos de olika bröstcancercellerna. Dessa utsattes för olika koncentrationer av JKA under 24 h samt jämfördes med kontroll. (n=3) p<0.05 För att kunna avgöra om ämnet även kan bekämpa cancerceller in vivo, så gavs JKA97 till s.k. nude mice vilket är en speciellt framtagen laboratoriemus som saknar tymus vilket ger ett försämrat immunsystem, vilket man använder sig av då man vill t.ex. ympa in tumörer för att studera olika ämnens verkan på dessa. Fenotypen saknar kroppsbehåring. Man hade hos dessa möss planterat in tumörer av MCF7 eller MDA-MB-468. Den högsta dosen av JKA97 (25mg/kg) hindrade hos MCF7 tumörtillväxten med 60 % (p<0.05) då den mättes vid den 18e dagen. Den låga dosen (5 mg/kg) ledde också till signifikant tumör-tillväxt med 50 % mindre

26 25 tillväxt (p<0.05). Hos MDA-MB-468 var den låga dosen på 5 µm och minskade tumörtillväxten med 42 % och den höga dosen på 10 µm och hindrade tillväxten med 52 %. (Figur 35) Det var ingen signifikant skillnad i kroppsvikt på behandlad och icke behandlad mus, ej heller några uppenbara skador på organen vid obduktion. Figur 35 Hämtad från studien 26. Anticancer-effekt in vivo vid behandling av bröstcancer-celler med jka97. A1: Tumörmassan hos möss med MCF7-tumörer vid behandling med JKA97 5 eller 25 mg/kg fem dagar i veckan i 18 dagar jämfört med kontroll. B1: Tumörmassan hos möss med MDA-MB-468- tumörer vid behandling med JKA97 i koncentrationen 5 eller 10 mg/kg fem dagar i veckan i 18 dagar, jämfört med kontroll. A2: Visar förändringen i kroppsvikt hos mössen med MCF7-tumörer under försökets gång. B2 Visar förändringen i kroppsvikt hos mössen med MDA-MB-468-tumörer under försökets gång. A3: foto som visar tumörstorlek på mössen med MCF7-tumörer vid försökets slut. B3: foto som visar tumörstorlek på mössen med MDA-MB-468-tumörer vid försökets slut. Man gick sedan vidare för att undersöka eventuella verkningsmekanismer, där man undersökte i hur hög grad olika proteiner uttrycktes som ingick i cellcykeln. Alla tre cellinjer behandlades med olika koncentrationer av JKA97 i 24 timmar. Man kunde då se en dosberoende ökad expression utav p21, medan cyklin D1, CYKLIN E och E2F1 (en transkriptionsfaktor) minskade. Den ökade expressionen av p21 skedde även hos de celler som inte kunde uttrycka p53 (MCF7 p53 knockdown) och JKA97 tycks därför inte beroende av de ökade nivåerna av p53 för att utöva sin effekt.

27 Kolonier / Eftersom p53 har en nyckelroll för att förhindra tumörer men även på sätt och vis kan orsaka dem då proteinet är muterat och ej kan fylla sin roll, som är fallet i flera olika cancerformer, är det alltid intressant att undersöka läkemedel som verkar oberoende av p53. Colon-cancer är till exempel ofta kopplat till en felaktig funktion hos p53 och läkemedel som verkar genom p53 blir därmed ineffektiva 27. I en annan studie från ville man därför visa att JKA97 kan ha effekt även oberoende av p53. Man undersökte effektivitet och verkningsmekanismer. Till att börja med inkuberades HCT116-celler (cellinje från mänskligt coloncarcinom) i 14 dagar och utsattes för olika doser utav JKA97. JKA-97 visade sig hindra tillväxten på HCT116-cellerna i dosberoende mängd. Vid 5 µm hade endast 20 % av antalet kolonier utvecklats jämfört med i kontrollgruppen (Figur 36). Påverkan på kolonibildning ,625 1,25 2, JKA 97 (µm) 600 Figur 36 Egen figur utifrån studiens 27 data. HCT116-celler odlades under 14 dagar och utsattes för olika koncentrationer av JKA97 (0-10 µm) Antalet kolonier räknades under mikroskop i slutet av försöket. (n=6) p<0.05 Man gick sedan vidare med försök in vitro. HCT116-celler injicerades subkutant i sidorna på nude mice för att ge tumörtillväxt. 14 dagar senare var tumören ca 0.05 cm 3. Totalt 32 möss delades då in i två grupper; En kontrollgrupp och en grupp som fick behandling med JKA97. Mössen behandlades sedan med saltlösning eller med JKA97 5 dagar i veckan i 5 veckor. Tumören hos de som fick behandling ökade endast till ca 0,12 cm 3, medan den hos kontrollgruppen ökade till ca 0.4 cm 3 (Figur 36).

28 Tumörvolym (cm 3 ) 27 Effekt på tumörvolym 0,38 0,41 0,27 0,05 0,16 0,09 0,1 0,11 0, Dagar efter cellinplantat HCT116 HCT116 + JKA97 Figur 36 Egen figur utifrån studiens 27 data. Nude mice behandlades med JKA97 en gång per dag 5 dagar i veckan under 14 dagar. Sedan jämfördes tumörvolymen med kontrollgruppens. (n=16) Man använde sig sedan av cell TUNEL assay, en metod för att färga ändterminalen på nukleinsyror och därmed upptäcka celler där DNA fragmenterats, alltså celler som gått i apoptos. I kontrollgruppen var den 2.53 % medan den i den behandlade gruppen ökat till %. Detta tydde alltså på att den avstannande tumörtillväxten berodde på en signifikant ökad apoptos snarare än hämmad tillväxt. Man gjorde sedan en cellodling under 24 timmar där cellerna behandlades med JKA97. Mer än 29.2 % av cellerna genomgick apoptos. Förekomst av caspas 3 och PARP (Poly ADP-ribose polymerase; liksom caspase 3 är det involverat i apoptosen) undersöktes med Western blot. Man såg då en klart ökad förekomst av dessa protein. Man behandlade sedan även cellerna med en Caspase-hämmare som visade sig minska apoptosen, vilket tydde på att Caspase-aktivering var en del av det apoptotiska svaret på JKA97. Eftersom HCT116-celler normalt producerar p53 27 ville man kontrollera om JKA-97 kunde verka utan detta protein, och använde sig därför sedan av HCT116-celler som var muterade och ej kunde bilda detta protein. Det var då ingen signifikant skillnad i apoptos mellan de som kunde bilda proteinet och de som inte kunde det. Man undersökte även levercarcinom-linjer med och utan p53 på liknande sätt, och även där ökade apoptosen oberoende av p53. Man undersökte även betydelsen av PUMA (ett apoptotiskt protein som ökar i närvaro av p53) genom samma försök, där apoptosen ökade lika mycket oberoende av om PUMA var närvarande eller ej. Samma försök med cell-linjer som inte kunde producera BAX (också ett apoptotiskt protein som leder till frisättning av cytokrom c och caspaser vilket leder till apoptos) visade däremot en utebliven apoptos. Den ökade klyvningen av Caspase 3 och PARP uteblev likaså. Detta tycktes alltså tyda på att BAX var kritiskt för funktionen av JKA97. Denna studie motsäger egentligen inte den förra där man ju såg kraftigt ökad p21-expression, det finns studier som visar att en överexpression av p21 ger en induktion av BAX och därmed ökar apoptosen. 28

29 28 Eventuell Telomeras-effekt Vid varje celldelning förkortas kromosomen, något som i de flesta av kroppens celler inte kan kompenseras. När telomererna (kromosomens ändar) blir tillräckligt korta tros cellen få svårt att replikera sig med bibehållen funktion och detta bidrar då till vårt åldrande. I könscellerna finns ett enzym kallat telomeras som reparerar telomererna under celldelningen, vilket gör att telomerförkortningen inte förs vidare till avkomman. Även i cancerceller har man sett en ökad förekomst av telomeras, något som då kan göra att de kan dela sig obehindrat. I en studie utförd ville man undersöka om harmin kunde ha påverkan på telomeras, då man sett att andra DNA-interkalerande karboliner eftersom även harmin interkalerar med DNA kan inhibera telomeras. Detta studerades på MCF-7-celler (bröstcancerceller) Man kunde där se en signifikant minskad telomeras-aktivitet då 20 µm harmin tillförts cellerna. Efter 96 h var % inhiberat jämfört med kontroll. Även i denna studie kunde man visa på en klar ökning av p53 och p21. Man såg även en ökning av fosforylerat H2AX. Detta är en histon som visat sig bli fosforylerad som ett svar på DNA-skada 29. Den tros sedan göra DNA mindre kompakt och därmed underlätta för reparerande enzymer. DISKUSSION Kan Harmin i sig orsaka tumörer? Det finns studier som visat att -karboliner kan vara mutagena då de kan interkalera med DNA 30. Man har även kunnat se att harmin signifikant ökade kromosonavvikelser i ett försök med V79 lungfibroblaster hos hamster 31. Kromosonavvikelserna tros bero på Harmins förmåga att interkalera med DNA. Många studier är dock gjorda på -karboliner och fritt DNA 31. I en studie från undersöktes detta vidare då man undersökte DNA-skador orsakade av harmin och 9- metyl-harmin på V79-celler under UV-strålning. DNA-skadorna i cellerna visade sig 5 gånger mindre jämfört med fritt DNA. De skador som uppträdde var främst modiefierade puriner (t ex 8-oxo-7,8-dihydroguaninine) som lättare kan repareras 31, endast ett fåtal single-strand break och inga cyklobutane pyrimidin-dimerer sågs. (en typ av DNA-skada som ofta ger mutation) Det man såg hos kommande generationer var främst små kärnor och minskad proliferation. Det kan nämnas att det också finns studier som tvärtom pekar på att harmine skyddar mot mutationer genom att verka som antioxidant gjordes en studie 33 där man använde sig av friska celler från människa (CCD18Lu) samt tre tumörcellslinjer (HeLa, C33A och SW480). Man såg ej några tecken på genotoxiska effekter i denna studie, endast ökad apoptos och nekros vid högre doser, i högst grad dock för tumörcellslinjerna. Fler studier behövs helt klart för att undersöka detta både in vivo och in vitro under längre tider än de som utförts hitills.

30 29 Sammanfattning Cancer är en sjukdom som beror på mutationer hos cellen som leder fram till en oreglerad celldelning och överlevnad 1. En strategi hos cancerläkemedel bör därför kunna vara att återta kontrollen över denna cellreglering. Här har harmin exempelvis visat sig kunna uppreglera p53 samt öka dess funktion 17,18. P53 är viktigt för att det kan aktivera enzymer som reparerar DNA, det kan även stoppa en cell med felaktigt DNA i cellcykeln och påskynda dess apoptos. P53 är därmed en viktig tumörsuppressor 17. Dock så har cancerceller ibland genom mutationer utvecklat ett skydd mot p Därmed blir då mediciner som verkar genom p53 verkningslösa, vilket gör att det är intressant med flera olika angreppsätt. I studierna som här gåtts igenom kan man även se en effekt på bl. a VEGF som krävs för angiogenesen 19, det vill säga för att försörja tumören med allt det syre och den näring den behöver. Man har även kunnat se en minskning av COX-2 19,20, som tidigare satts samman med en minskad risk för colon-cancer 3. Påverkan på cykliner och CDK som är viktiga för progression av cellcykeln har också kunnat påvisas 21. Harmin har i flera av studierna som gåtts igenom visat signifikant effektivitet mot cancerceller både in vitro och in vivo (hos möss). Det har även visat sig selektivt på så vis att det inte skadar normala celler i samma utsträckning. Dess effektivitet har dessutom visats kunna ökas genom att koppla på antingen en 2-amino-2deoxy-D-glukos (2DG) eller en metionin till harmin 23. Detta beror på cancercellens höga metabola aktivitet, som gör att harmin med dessa molekyler kopplade till sig tas upp mer av cancercellerna än av friska celler 23. Man har även kunnat minska harmins toxicitet genom att koppla en formiat till R3 på molekylen, så att mössen under studien inte uppvisade några biverkningar, medan harmin och vissa andra derivat gav svåra neurotoxiska symptom i högre doser 22. Det finns dock mycket kvar att utröna, till exempel så finns det studier som påpekat att beta-karboliner i sig själva är carcinogena då de kan interkalera med DNA 29. Det vore intressant att se studier utförda under längre tid för att kunna se långtidsbiverkningar samt jämförelser med de läkemedel som används idag SLUTSATSER De slutsatser som kan dras är att harmin är ett intressant ämne som klart visar att det har kapacitet att hindra tumörtillväxt och att det verkar finnas flera olika verkningsmekanismer men att det finns mycket kvar att forska på. Exempelvis harmins biverkningar på lång sikt och effekt. Det hade varit önskvärt att göra en jämförelse med harmins tumörreducerande effekt och de läkemedel som används idag. De studier som utförts har varit ganska korta (veckor till månader) och det är därmed svårt att jämföra effekt på sikt. Fler studier krävs.

31 30 REFERENSER 1. Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; The Development and Causes of Cancer. Available from: 2 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; Cancer Treatment: Present and Future.Available from: 3. Wang D, Dubois RN. The role of COX-2 in intestinal inflammation and colorectal cancer. Oncogene. 2010;29(6): HCT116-cells. (läst ) 5. TGFA transforming growth factor alpha [ Homo sapiens (human) ] ypes (läst ) 6 SW480 [SW-480] (ATCC CCL-228) aspx?geo_country=se#characteristics (Läst ) 7. Patel K, Gadewar M, Tripathi R, Prasad SK, Patel DK. A review on medicinal importance, pharmacological activity and bioanalytical aspects of beta-carboline alkaloid ''Harmine''. Asian Pac J Trop Biomed. 2012;2(8): Peganum Harmala. (Läst ) 9. Banisteropsis Caapi. ( ) 10. Gerardy J. Effect of moclobemide on rat brain monoamine oxidase A and B: comparison with harmaline and clorgyline. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1994;18(4): Monoamine oxidase (Läst ) 12. Ayahuasca. ( ) 13. Reversible inhibitor of monoamine oxidase A (Läst ) 14. Moloudizargari M, Mikaili P, Aghajanshakeri S, Asghari MH, Shayegh J. Pharmacological and therapeutic effects of Peganum harmala and its main alkaloids. Pharmacogn Rev. 2013;7(14): Filali I, Bouajila J, Znati M, Bousejra-El Garah F, Ben Jannet H. Synthesis of new isoxazoline derivatives from harmine and evaluation of their anti-alzheimer, anti-cancer and anti-inflammatory activities. J Enzyme Inhib Med Chem. 2015;30(3): Yonezawa T, Hasegawa S, Asai M, Ninomiya T, Sasaki T, Cha BY, et al. Harmine, a β-carboline alkaloid, inhibits osteoclast differentiation and bone resorption in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 2011;650(2-3): Dai F, Chen Y, Song Y, Huang L, Zhai D, Dong Y, et al. A natural small molecule harmine inhibits angiogenesis and suppresses tumour growth through activation of p53 in endothelial cells. PLoS One. 2012;7(12):e Chen D, Zhang Z, Li M, Wang W, Li Y, Rayburn ER, et al. Ribosomal protein S7 as a novel modulator of p53-mdm2 interaction: binding to MDM2, stabilization of p53 protein, and activation of p53 function. Oncogene. 2007;26(35): Hamsa TP, Kuttan G. Harmine inhibits tumour specific neo-vessel formation by regulating VEGF, MMP, TIMP and pro-inflammatory mediators both in vivo and in vitro. Eur J Pharmacol. 2010;649(1-3): Zhang H, Sun K, Ding J, Xu H, Zhu L, Zhang K, et al. Harmine induces apoptosis and inhibits tumor cell proliferation, migration and invasion through down-regulation of cyclooxygenase-2 expression in gastric cancer. Phytomedicine. 2014;21(3):

32 Song Y, Kesuma D, Wang J, Deng Y, Duan J, Wang JH, et al. Specific inhibition of cyclin-dependent kinases and cell proliferation by harmine. Biochem Biophys Res Commun. 2004;317(1): Chen Q, Chao R, Chen H, Hou X, Yan H, Zhou S, et al. Antitumor and neurotoxic effects of novel harmine derivatives and structure-activity relationship analysis. Int J Cancer. 2005;114(5): Wang A, Chen Y, Chen WR, Gu Y. Novel 2DG-based harmine derivatives for targeted cancer therapy. Biophotonics and Immune Responses 2013:8(7): Li S, Wang A, Gu F, Wang Z, Tian C, Qian Z, et al. Novel harmine derivatives for tumor targeted therapy. Oncotarget. 2015;6(11): Mahounga DM, Shan L, Jie C, Du C, Wan S, Gu Y. Synthesis of a novel L-methyl-methionine-ICG-Der-02 fluorescent probe for in vivo near infrared imaging of tumors. Mol Imaging Biol. 2012;14: Yang X, Wang W, Qin JJ, Wang MH, Sharma H, Buolamwini JK, et al. JKA97, a novel benzylidene analog of harmine, exerts anti-cancer effects by inducing G1 arrest, apoptosis, and p53-independent up-regulation of p21. PLoS One. 2012;7(4):e Luo W, Liu J, Li J, Zhang D, Liu M, Addo JK, et al. Anti-cancer effects of JKA97 are associated with its induction of cell apoptosis via a Bax-dependent and p53-independent pathway. J Biol Chem. 2008;283(13): Khan KH, Kim WH, Choi KH (1999) P21 promotes ceramide induced apoptosis and antagonizes the antideath effect of Bcl-2 in human hepatocarcinoma cells. Exp Cell Res 253: Zhao L, Wink M. The β-carboline alkaloid harmine inhibits telomerase activity of MCF-7 cells by downregulating htert mrna expression accompanied by an accelerated senescent phenotype. PeerJ. 2013;1:e de Meester C. Genotoxic potential of beta-carbolines: a review. Mutat Res. 1995;339(3): Boeira JM, da Silva J, Erdtmann B, Henriques JA. Genotoxic effects of the alkaloids harman and harmine assessed by comet assay and chromosome aberration test in mammalian cells in vitro. Pharmacol Toxicol. 2001;89(6): Moura DJ, Richter MF, Boeira JM, Pêgas Henriques JA, Saffi J. Antioxidant properties of beta-carboline alkaloids are related to their antimutagenic and antigenotoxic activities. Mutagenesis. 2007;22(4): Jiménez J, Riverón-Negrete L, Abdullaev F, Espinosa-Aguirre J, Rodríguez-Arnaiz R. Cytotoxicity of the beta-carboline alkaloids harmine and harmaline in human cell assays in vitro. Exp Toxicol Pathol. 2008;60(4-5):381-9.

33 Kalmar Tel Lnu.se 32