Bestämning av totalkolesterol, HDL-kolesterol samt triglycerider i blodet

Transkript

1 Bestämning av totalkolesterol, HDL-kolesterol samt triglycerider i blodet Biomedicinsk vetenskap II för receptarier VT 2011 maria.liljeqvist@molbiol.umu.se sofie.ekestubbe@molbiol.umu.se christopher.andersson@molbiol.umu.se

2 Bakgrund Fetter är en grupp organiska föreningar av många olika strukturer, som generellt brukar delas in i tre grupper; triglycerider, fosfolipider och steroler (bl.a. kolesterol) (fig 1). Den största delen av kroppsfettet utgörs av triglyceriderna, de s.k. neutrala fetterna. De bildar depåfett, en energireserv i kroppen. Fosfolipider ingår i cellmembranet och andra membran, och kallas då för strukturfett. Sterolerna har många olika uppgifter i kroppen, t.ex. som strukturfett i cellmembranet, steroidhormon, vitamin D, etc. A B C Fig 1. A) Triglycerid med tre olika fettsyror. B) Fosfolipid, R1 och R2 representerar fettsyror och X representerar en av flera olika polära grupper som kan sitta på fosfatgruppen. C) Triglycerider Triglyceriderna är estrar av glycerol och tre fettsyror (fig 1A) och oftast är de tre fettsyrorna olika. De vanligaste förekommande fettsyrorna är de mättade fettsyrorna palmatinsyra (C16:0), stearinsyra (C18:0), och den omättade oljesyran (C18:1). Fettet i födan (i huvudsak triglycerider) bryts ner av lipas från bukspottkörteln (pancreas) till fria fettsyror och monoglycerider. I närvaro av gallsalter bildas aggregat av fettsyror, s.k. miceller, vilket underlättar tranporten genom tarmslemhinnan. Triglycerider bildas igen i epitelceller från de upptagna fettsyrorna och monoglyceriderna. Triglyceriderna inkorporeras tillsammans med kolesterol, fosfolipider och protein till kylomikroner i tarmepitelcellerna. I blodet angrips triglyceriderna i kylomikronerna av lipoproteinlipas och bryts ner till fria fettsyror och glycerol. Fria fettsyror kan tas upp i fettväv och lever och lagras som triglycerid. Eftersom fett (9,3 kcal/g) har mycket högre energivärde än både kolhydrater och proteiner (4,1 kcal/g) är det den lämpligaste lagringsformen för energireserv. Hos däggdjur är den huvudsakliga platsen för lagring av triglycerider i fettcellers cytoplasma. Små droppar av triglycerider sammankopplade till en stor droppe kan uppta största delen av cellens volym.

3 Fettcellerna är specialiserade till att syntetisera och lagra triglycerider samt mobilisera dem till fria fettsyror som med hjälp av transportprotein, t.ex. albumin, transporteras till andra vävnader med blodet. halten i blodet (kvoten mellan HDL och total kolesterol), se nedan, har ansetts vara en stor riskfaktor för åderförkalkning, men nu tror man också att triglycerider i blodet har stor betydelse. Flera faktorer påverkar triglyceridnivån i blodet, t.ex. så är nivån generellt högre hos rökare, medan idrottande personer har lägre nivå. (fig 1C), som är utgångsämne (precursor) vid syntes av stereoidhormoner och gallsalter, är en viktig komponent i cellmembraner. Ämnet är en normal beståndsdel i animala vävnader men har hittills ej kunnat påvisas hos växter., liksom övriga plasmalipider, är inte lösliga i vatten och kan således inte förekomma i ren form. Lipiderna transporteras därför tillsammans i specifika lipoproteiner. Ytan består av delvis vattenlösliga fettmolekyler, fosfolipder, kolesterol och proteiner. Lipoproteinets kärna utgörs av vattenolösliga substanser, triglycerider och kolesterolester. Det finns flera olika arter av lipoproteiner och de har alla sin karaktäristiska densitet och brukar indelas i 5 klasser (tabell 1). Sammansättning (%) Storlek (nm) protein kolesterol triglycerid fosfolipid ursprung kylomikroner tarm VLDL (very low density lipoprotein) lever och tarm IDL (intermediate density lipoprotein) VLDL LDL (low density lipoprotein) VLDL HDL (high density lipoprotein) 7, Tabell 1. De olika typer av lipoproteiner och deras sammansättning. lever och tarm Kroppen, främst levern, kan syntetisera kolesterol från acetyl-coenzyma (även substrat till citronsyracykeln) via ett stort antal steg. Den egna syntesen ger 1,5-2 g kolesterol per dag. Vi får även i oss kolesterol med maten, främst från ägg och djurfett (normalt intag per dag är 0,5-1 g). en med födan absorberas snabbt i tunntarmarna och det mesta av kolesterolen inkorporeras i kylomikroner som bildas i tarmepitelcellerna. Via lymfan transporteras kolesterolen i kylomikronerna till blodet. Efter en måltid kan blodet mjölkfärgas av kylomikronerna. Genom inverkan av lipoproteinlipaser, som sitter i kapillärernas endotel, bryts triglycerider i kylomikronerna ner till fria fettsyror och glycerol. Återstoden av kylomikronerna metaboliseras i levern. VLDL (Very Low Density Lipoprotein) bildas i levern men omvandlas snart till LDL (Low Density Lipoprotein) via ett mellansteg kallad IDL (Intermediate Density Lipoprotein). LDL är den huvudsakliga bäraren av kolesterol till kroppens olika celler. upptas av cellerna genom endocytos. Cellerna använder kolesterolen till membranmaterial eller som utgångsämne till olika synteser. Överskottskolesterol transporteras bort med hjälp av HDL (High Density Lipoprotein). En mindre del inkorporeras på nytt i VLDL, men det mesta utsöndras med gallan.

4 Under många år har man sökt det kausala sambandet mellan kolesterol och arteroskleros (åderförkalkning, kolesterolinlagring i kärlvägg). Det har varit svårt att fastställa några säkra samband mellan totalkolesterolmängd i blod och arteroskleros. Det tycks istället vara så att mängden HDL i blod har den största betydelsen. Höga halter av HDL verkar vara ett bra skydd mot arteroskleros. HDLs roll som skyddande faktor anses vara förenad med dess förmåga att transportera bort överskottskolesterol från vävnad. Några faktorer som påverkar kolesterolhalten kan ses i tabell 2. Totalkolesterol + - Arv Thyroidhormoner Fettrik mat Estrogener Obehandlad diabetes Fleromättade fettsyror HDL-kolesterol + - Kön (Kvinna) Fetma Motion Rökning Klofibtat (farmaka) Tabell 2: Några orsaker till ökning eller minskning av total- eller HDL-kolesterol Så fungerar reagensen I båda reagenserna så är alla kemikalier och enzymer redan färdigblandade i röret. Enzymet som katalyserar reaktionen står i parantes i mindre storlek. reagens: ester + H 2 O (kolesterolesterase) kolesterol + fri fettsyra + O 2 (kolesteroloxidas) kolest-4-en-3-on + H 2 O 2 H 2 O aminophenazon + fenol (peroxidas) 4-(p-benzoquinon-monoimino)-phenazone + 4H 2 O (färgad produkt där intensiteten i är proportionell mot koncentrationen kolesterol) Fällningsreagens: Gör att kylomikroner, VLDL och LDL fäller ur medan HDL är kvar i lösning Triglycerider Triglyceridreagens Triglycerider + 3H 2 O (lipoprotein lipase) glycerol + 3 fria fettsyror Glycerol + ATP (glycerokinase) glycerol-3-fosfat + ADP glycerol-3-fosfat +O 2 (glycerolfosfatoxidas) dihydroxyacetonfosfat + H 2 O 2 H 2 O aminophenazone + 4-klorophenol (peroxidas) 4-(p-benzoquinon-monoimino)-phenazone + 2 H 2 O + HCl (färgad produkt där intensiteten i är proportionell mot koncentrationen triglycerider)

5 Utförande: Blod kan vara smittat så när ni hanterar blod måste ni ha handskar på er. Tänk också på att inte röra er i ansiktet med handskarna (helst inte alls inne på lab, oavsett om ni har handskar på er). Det finns slemhinnor (ögon, näsa, mun m.m.) där patogener lättare kan infektera och kemikaler göra mycket större skada, än om det bara hade varit hudkontakt. ÄT INTE PÅ LAB! Dagen innan: Försökspersonen i varje grupp bör ha fastat i 12 timmar innan första blodprovet tas. D.v.s. om du är försöksperson, ät inget efter ca kl 21 kvällen innan. På morgonen: Ingen frukost för försökspersonen innan första blodprovet. Efter första blodprovet så har vi ordnat frukost åt honom/henne. Försökspersonerna får exempelvis äta antingen omelett, pizza eller en sallad. Första blodprovet tas precis innan försökspersonernas frukost (tid 0), därefter tas blodprov 30 min, 60 min, 120 min och 180 min efter att försökspersonen ätit upp sin frukost. (se tabell nedan). För HDL-kolesterol tas bara ett blodprov vid tid 0 (innan frukost). Vid varje provtagningstidpunkt kommer ni att analysera mängden triglycerider och totalkolesterol. För detta behövs ca 20 μl plasma / tidpunkt (10 μl totalkolesterol, 10 μl - triglycerider). Vid den första tidpunkten behövs däremot 120 μl plasma för att även HDL kolesterol ska mätas (100 μl HDL, 10 μl totalkolesterol, 10 μl - triglycerider). Försök därför ta ca 60 μl blod för varje tidpunkt ( μl för den första). Om ni inte får ut 120 μl plasma vid första tidpunkten så går det bra att poola den plasma ni får över för alla tidpunkter och använda den för en HDL-mätning. Använd alltså10 μl plasma till totalkolesterol, 10 μl plasma till triglycerid för varje tidpunkt och samla ihop resten till en HDL-kolesterol. Att ta blodprov: Det är en bra idé att först värma upp händerna med varmt vatten och se till att ni är varma (ta en promenad i en trappa t.ex.) så att det blir ett bättre blodflöde. Torka av fingerspetsen med sprit, Stick med mikrolansetten. Stick på sidan av fingret, några millimeter från nageln. Undvik pekfingret och lillfingret då det finns nerver där som man kan träffa. Fånga upp blodet i ett av uppsamlingsrören. Ta av det gröna locket och och sätt på en av de medföljande näbbarna innan ni börjar samla blod. Sätt på det gröna locket igen och vänd röret 10 gånger. Mer att tänka på: Ytlig skinn punktering leder till ett dåligt blodflöde Stryk bort de 2-3 första bloddropparna som innehåller mycket koaguleringsfaktorer Tryck inte för hårt. Låt blodet komma tillbaka i fingret genom att släppa upp trycket.

6 Protokoll: Blod tas i fingret med hjälp av en microlancet och samlas upp i speciella bloduppsamlingsrör, sätt på korken på röret och vänd röret 10 gånger. Den ljusgula fasta fasen i botten på röret ska inte lösas upp För över blodet till 1,5 ml eppendorfrör med pipett. Undvik att stoppa ned pipettspetsen i den ljusgula fasta fasen i botten på uppsamlingsröret. Det ska alltså inte lösas upp. Se till att märka eppendorfröret så ni vet vems det är och vad ni har i den. Centrifugera 2 min, 6000 rpm, MYCKET VIKTIGT ATT JÄMVIKTA RÖREN För över plasman till ett nytt 1,5 ml eppendorf rör med pipett. Efter centrifugering ska ni ha plasman i överfasen, en vitaktig mellanfas och de röda blodkropparna i underfasen. Om ni får med röda blodkroppar i plasman, centrifugera igen och för över plasman till ytterligare ett eppendorfrör. Se till att märka eppendorfröret så ni vet vems det är och vad ni har i den. Ställ proverna på is tills att prover för alla tidpunkter är samlade. Saker att göra i väntan på nästa provtagning: Märk tydligt upp alla rör som ni kommer att behöva Fundera på hur ni ska skriva er labbrapport Bestämning av triglycerid koncentration Blanda i en kyvett: 1 ml triglycerid-reagens och 10 μl plasma. 5 tidpunkter = 5 kyvetter totalt. En grupp måste göra en blank med 1ml triglyceridreagens och 10 μl H2O. Blanda ordentligt med pipett och sätt sedan på parafilm på kyvetten. Inkubera minst 10 min i RT (rumstemperatur), max en timma. Mät absorbansen på spektrofotomotern vid 500 nm, Använd reagenslösning med H2O ist för plasma som blank. (det räcker om en grupp gör en blank) Triglyceridkoncentrationen beräknas enligt följande: C = 760 x Abs500nm (mg/100 ml) C = 8,66 x Abs500nm (mmol/liter)

7 Bestämning av totalkolesterol koncentration (väldigt lik triglycerid-koncentration mätningen) Blanda i en kyvett: 1 ml kolesterol-reagens och 10 μl plasma. 5 tidpunkter = 5 kyvetter totalt. En grupp måste göra en blank med 1ml kolesterolreagens och 10 μl H2O. Inkubera minst 10 min i RT (rumstemperatur), max en timma. Mät absorbansen på spektrofotomotern vid 500 nm, Använd 1ml reagenslösning med 10 μl H2O ist för plasma som blank. (det räcker om en grupp gör en blank) Totalkolesterol koncentrationen beräknas enligt följande: C = 14,9 x Abs500nm (mmol/liter) Bestämning av HDL-kolesterol koncentration Blanda 200 μl fällningsreagens, 50 μl dest. vatten och 100 μl plasma. Det är alltså bara ett prov för HDL-kolesterol. Inkubera minst 10 min i RT (rumstemperatur) Centrifugera 10 min, 4000 rpm. JÄMVIKTA RÖREN För över 100 μl av den klara överfasen till en kyvett. Tillsätt 1 ml kolesterol-reagens (samma som ni använde för totalkolesterol mätningen), blanda. Inkubera minst 20 min i RT (rumstemperatur), max en timme Mät absorbansen på spektrofotomotern vid 500 nm, Använd 1ml reagenslösning ul H2O som blank. (det räcker om en grupp gör en blank) HDL-kolesterol koncentrationen beräknas enligt följande: C = 5,61 x Abs500nm (mmol/liter) Efter mätningarna: Dela med er av era resultat till de andra grupperna Hur skiljer sig era resultat från deras, diskutera. Tid (min) Konc. triglycerider Konc. totalkolesterol Konc. HDL-kolesterol 0 30 xxxxxxxxxxxxxxxxxx 60 xxxxxxxxxxxxxxxxxx 120 xxxxxxxxxxxxxxxxxx 180 xxxxxxxxxxxxxxxxxx

8 Rapport: Försök att ta upp endast det mest centrala i er bakgrund/introduktion. Försök att skriva rapporten kortfattad och relevant. Presentera era värden i grafer, och det ska alltså vara värden från alla labgrupper (se till att ni tar del av alla gruppers resultat innan ni går för dagen). Diskutera förväntade och/eller oväntade resultat. Ange eventuella felkällor och avvikelser från labhandledningen. Riktvärden (european atherosclerosis society): Triglycerider Triglycerider mmol/l mg/dl Lipid metabolism disorder <5,18 <200 nej <2,26 <200 5,18 7, Ja, om HDL är <0,9 mmol/l (35 mg/dl) >7,77 >300 ja >2,26 >200