artus CMV QS-RGQ Kit handbok

Transkript

1 December 2010 artus CMV QS-RGQ Kit handbok Version 1 24 Kvantitativ in vitro-diagnostik För användning med QIAsymphony SP/AS och Rotor-Gene Q-instrument SV QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R SV Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prov- och analysteknik QIAGEN är den ledande leverantören av innovativ prov- och analysteknik, vilken möjliggör att isolera och upptäcka innehållen i valfritt biologiskt prov. Våra avancerade produkter och tjänster av hög kvalitet garanterar framgång från prov till resultat. QIAGEN skapar standarder i: Rening av DNA, RNA och proteiner Nukleinsyra- och proteinanalyser mikrorna-forskning och RNAi Automation av prov- och analysteknik Vårt uppdrag är att möjliggöra för dig att uppnå utomordentlig framgång och genombrott. För mer information, besök

3 Innehåll Satsinnehåll 5 Symboler 5 Förvaring 6 Avsedd användning 6 Begränsningar av produktanvändning 6 Teknisk hjälp 7 Säkerhetsinformation 7 Kvalitetskontroll 8 Introduktion 9 Princip 9 Information om patogen 9 Prestandaegenskaper 10 Arbetsflöde 17 Utrustning och reagenser som användaren ska tillhandahålla 22 Viktiga anmärkningar 24 Allmänna försiktighetsåtgärder 24 Insamling, förvaring och transport av prov 24 Så här kommer du i gång med QIAsymphony SP/AS-instrument 26 Förberedelse av provmaterial 29 Preparera blandningar av bärar-rna (CARRIER) och AVE-buffert (AVE) för plasmaprover 29 Använda en intern kontroll 29 Analyskontrolluppsättningar och analysparameteruppsättningar 31 Fleranalyskörningar 31 Utbyten av nukleinsyror 32 Förvaring av nukleinsyror 32 Inställning av tröskel för PCR-analysen 32 Kvantifiering 32 Protokoll DNA-isolering på QIAsymphony SP 34 Analysinställningar på QIAsymphony AS 42 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010 3

4 PCR och dataanalys på Rotor-Gene Q 48 Felsökningshandbok 59 Litteraturhänvisningar 65 Beställningsinformation 66 4 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

5 Satsinnehåll artus CMV QS-RGQ Kit (24) Katalognr Antal reaktioner 24 Blå CMV RG Master 3 x 300 μl Gul CMV Mg-Sol* 600 μl Röd CMV QS 1 (1 x 10 4 kopior/μl) 200 μl Röd CMV QS 2 (1 x 10 3 kopior/μl) 200 μl Röd CMV QS 3 (1 x 10 2 kopior/μl) 200 μl Röd CMV QS 4 (1 x 10 1 kopior/μl) 200 μl Grön CMV IC 1000 μl Vit Vatten (PCR-grad) 1000 μl Handbok 1 * Magnesiumlösning. Kvantifieringsstandard. Intern kontroll. Symboler <N> Innehåller reagenser som räcker för <N> tester Använd före In vitro-diagnostisk medicinsk apparat Katalognummer Lot-nummer Materialnummer artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010 5

6 Komponenter Innehåller Antal Temperaturbegränsningar Lagenlig tillverkare Konsultera bruksanvisningen Viktig anmärkning Förvaring Komponenterna i artus CMV QS-RGQ Kit, måste förvaras vid 20 C och är stabil fram till det utgångsdatum som anges på etiketten. Upprepad tining och frysning (>2 x) ska undvikas, eftersom detta kan minska analysens prestanda. Avsedd användning artus CMV QS-RGQ Kit är ett in vitro-nukleinsyraamplifieringstest för kvantifiering av cytomegalovirus (CMV) DNA i human EDTA-plasma eller humant EDTA-helblod. Denna diagnostiska testsats använder sig av polymeraskedjereaktion (PCR) och är konfigurerad för användning med QIAsymphony SP/AS- och Rotor-Gene Q-instrumenten. artus CMV QS-RGQ Kit är avsedd för användning i samband med klinisk redovisning och andra laboratoriemarkörer för sjukdomsprognos. Begränsningar av produktanvändning Alla reagenser kan användas exklusivt i in vitro-diagnostik. Produkten ska endast användas av personal som har fått specialinstruktioner och som har utbildats i in vitro-diagnostiska förfaranden (EN375). Användarhandboken måste följas strikt för att uppnå optimala resultat för PCR. Var noga med att uppmärksamma de utgångsdatum som är angivna på asken och på etiketterna för alla komponenter. Använd inte utgångna komponenter. 6 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

7 Även om det i sällsynta fall kan uppkomma mutationer inom virusgenomets i hög grad bevarade områden, vilka täcks av satsens primrar och/eller sökfragment, kan dessa kvantifieras i underkant eller kan befintligheten av virus i dessa fall missas att upptäckas. Därför granskas analysens giltighet och prestanda med jämna mellanrum. Teknisk hjälp På QIAGEN är vi stolta över vår kvalitet och tillgängligheten av teknisk support. Våra tekniska tjänsteavdelningar är bemannade med erfarna vetenskapsmän med bred praktisk och teoretisk expertis i prov- och analysteknik samt i användningen av QIAGEN-produkter. Om du har några frågor eller stöter på några svårigheter vad gäller artus CMV QS-RGQ Kit eller QIAGEN-produkter i allmänhet, får du gärna kontakta oss. QIAGEN-kunder är huvudkällan till information om avancerad eller specialiserad användning av våra produkter. Denna information är till hjälp för andra vetenskapsmän såväl som för forskarna på QIAGEN. Därför uppmuntrar vi dig att kontakta oss, om du har någraförslag gällande produktprestanda eller nya ansökningar och ny teknik. Teknisk hjälp och mer information: se vårt tekniska supportcenter på eller ring en av QIAGEN:s tekniska supportavdelningar eller lokala återförsäljare (se baksidan eller besök Säkerhetsinformation När du arbetar med kemikalier ska du alltid ha på dig en laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon. Om du vill ha mer information, hänvisas till tillämpliga materialsäkerhetsdatablad (MSDSs). Dessa finns tillgängliga online i ett lättsamt och komprimerat PDF-format på där du kan hitta, titta på och skriva ut materialsäkerhetsdatabladen för varje QIAGEN-sats och satskomponent. Säkerhetsinformation för QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit: se Handbok för QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Se QIAsymphony DNA Handbook för säkerhetsinformation för QIAsymphony DNA Mini Kit. Säkerhetsinformation om instrument: se användarhandboken för respektive instrument. Kassera prov- och analysavfall enligt lokala säkerhetsregler. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010 7

8 Akutinformation dygnet runt Medicinsk akutinformation på engelska, franska och tyska kan erhållas dygnet runt från: Giftinformationscentret i Mainz, Tyskland Tel: Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGENs ISO-certifierade kvalitetshanteringssystem testas varje lot av artus CMV QS-RGQ Kit mot förutbestämda specifikationer för att garantera följdriktig produktkvalitet. 8 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

9 Introduktion artus CMV QS-RGQ Kit utgör ett system som är klart att användas för upptäckt av CMV-DNA som använder sig av polymeraskedjereaktion (PCR) på Rotor- Gene Q-instrument med provberedning och analysinställningar tillsammans med QIAsymphony SP/AS-instrument. CMV RG Master innehåller reagenser och enzymer för den specifika amplifieringen av 105 bp-regioner av CMVgenomet, och för direkt upptäckt av den specifika amplikonen i fluorescenskanalens Cycling Green av Rotor-Gene Q. Dessutom innehåller artus CMV QS-RGQ Kit ett andra heterologt amplifieringssystem för att identifiera eventuell PCR-inhibition. Denna upptäcks som en intern kontroll (IC) i fluorescenskanalens Cycling Yellow av Rotor-Gene Q. Detektionsgränsen av det analytiska CMV PCR har inte reducerats. Externa positiva kontroller (CMV QS 1 4) medföljer, vilka gör det möjligt att fastställa andelen virus-dna. Mer information: se Kvantifiering, sidan 32. Princip Patogen organism upptäckt av polymeraskedjereaktion (PCR) baserar på amplifieringen av specifika regioner i den patogena organismens genom. I realtids-pcr upptäcks den amplifierade produkten via fluorescerande färgämnen. Dessa är vanligtvis kopplade till sökfragment av oligonukleotider, vilka binder specifikt till den amplifierade produkten. Om du övervakar fluorescensintensiteterna under PCR-körningen (det vill säga i realtid) kan du upptäcka och kvantifiera den ackumulerande produkten utan att behöva öppna reaktionsrören på nytt efter PCR-körningen.* Information om patogen Humant cytomegalovirus (CMV) påträffas hos infekterade personer i blod, vävnader och i så gott som alla sekretoriska vätskor. Överföring kan ske oralt, sexuellt, via blodtranfusion eller organtransplantation, intrauterint eller perinatalt. Infektion med CMV leder ofta till en asymptomatisk infektion, följt av ett livslångt fortbestånd av viruset i kroppen. Om symptom uppträder, vare sig hos tonåringar eller vuxna, liknar de dem som förekommer i mononukleos med feber, svag hepatit och allmänt lätt sjukdomstillstånd. Svåra fall av CMVinfektion har framför allt observerats hos personer med infekterad intrauterin och patienter med immunbristsjukdom. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010 9

10 Prestandaegenskaper Analytisk sensitivitet plasma Den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen (sensitivitetsgräns) utvärderas för artus CMV QS-RGQ Kit med hjälp av CMV-positiva kliniska prover i kombination med extraktionen av QIAsymphony SP. Den analytiska sensitiviteten med hänsyn till reningen av artus CMV QS- RGQ Kit fastställdes med hjälp av spädningsserier av CMV-virusmaterial från 1000 till nominellt 0,316 CMV kopior/ml spetsade i kliniska plasmaprover. Dessa användes för att extrahera DNA med användning av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit i kombination med Cellfree1000-protokollet (extraheringsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl). Var och en av de 10 spädningarna analyserades med artus CMV QS-RGQ Kit under 4 olika dagar i 4 körningar med 8 replikat vardera. Resultaten fastställdes genom en probitanalys. En grafisk illustration av probitanalysen visas i figur 1. Den analytiska detektionsgränsen avseende rening av artus CMV QS-RGQ Kit i kombination med Rotor-Gene Q är 42,5 kopior/ml (p = 0,05). Detta innebär att det finns en 95-procentig sannolikhet att 42,5 kopior/ml kommer att upptäckas % Proportioner Proportions , ~ 42, kopior/ml copies/ml (95%) %) (29,4 70,2 ( kopior/ml) copies/ml) log (dos) (dose) Figur 1. Probitanalys: plasma, CMV (Rotor-Gene Q). Analytisk sensitivitet med hänsyn till reningen (plasma, med användning av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit) för artus CMV QS-RGQ Kit på Rotor-Gene Q. 10 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

11 Specificitet plasma Specificiteten för artus CMV QS-RGQ Kit garanteras först och främst genom valet av primrar och prober, samt genom valet av strikta reaktionsvillkor. Primrarna och proberna kontrollerades beträffande eventuella homologier i alla sekvenser som publicerats i genbaser genom sekvensjämförande analys. Därmed säkerställs att alla relevanta genotyper kan detekteras. Dessutom utvärderades specificiteten med hundra olika negativa plasmaprover av CMV. Dessa alstrade inga signaler med de CMV-specifika primrar och prober som ingår i CMV RG Master. Potentiell korsreaktivititet i artus CMV QS-RGQ Kit testades med hjälp av den kontrollgrupp som anges i tabell 1 (nedan). Ingen av de testade patogenerna har varit reaktiv. Inga korsreaktiviteter visade sig med blandade infektioner. Tabell 1. Tester av kits specificitet med potentiellt korsreaktiva patogen Kontrollgrupp Humant herpesvirus 1 (herpes simplex-virus 1) Humant herpesvirus 2 (herpes simplex-virus 2) Humant herpesvirus 3 (Varicellazoster virus) Humant herpesvirus 4 (Epstein- Barr virus) CMV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Yellow) Humant herpesvirus 6A + Humant herpesvirus 6B + Humant herpesvirus 7 + Humant herpesvirus 8 (Kaposis sarkom-associerat herpesvirus) + Hepatit A-virus + Hepatit B-virus + Hepatit C-virus + Humant immunbristvirus 1 + Tabell fortsätter på nästa sida. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

12 Tabell 1. Fortsättning Kontrollgrupp CMV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Yellow) Humant T-cell leukemivirus 1 + Humant T-cell leukemivirus 2 + Västra Nilen-virus + Enterovirus + Parvovirus B19 + Linjärt område plasma Det linjära området med hänsyn till reningen av artus CMV QS-RGQ Kit fastställdes genom att analysera en spädningsserie med CMV-virusmaterial med intervallet 1,00 x 10 8 kopior/ml till 3,16 x 10 1 kopior/ml i plasma. Reningen utfördes i replikat (n = 4 för koncentrationer 1,00 x 10 7 kopior/ml; n = 8 för koncentrationer <1,00 x 10 7 kopior/ml) med användning av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit i kombination med Cellfree1000- protokollet (extraktionsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl). Vart och ett av proven analyserades med hjälp av artus CMV QS-RGQ Kit. Det linjära området med hänsyn till reningen av artus CMV QS-RGQ Kit fastställdes genom att täcka koncentrationer från 7,94 x 10 1 kopior/ml till 1,00 x 10 8 kopior/ml för plasma (figur 2, sidan 13). Robusthet plasma Genom verifiering av robustheten går det att fastställa den totala felfrekvensen av artus CMV QS-RGQ Kit. För att verifiera robustheten spetsades 100 CMVnegativa prover av plasma med 130 kopior/ml av CMV (ungefär en tre gånger så stor koncentration av den analytiska sensitivitetsgränsen). Efter extrahering på QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit i kombination med Cellfree1000_DSP-protokollet för plasma (extraheringsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl) analyserades proverna med artus CMV QS-RGQ Kit. Dessutssutom utvärderades robustheten i den interna kontrollen genom rening och analys av de hundra spetsade plasmaproverna. Inhibitioner observerades inte. Således är robustheten i artus CMV QS-RGQ Kit 99 %. 12 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

13 10 log 10 log uppskattad 10 estimated koncentration concentration (kopior/ml) (copies/ml) y = 1,0521x x ,3653 R 2 = , log 10 log nominell 10 nominal koncentration concentration (kopior/ml) (copies/ml) Figur 2. Linjärt område för artus CMV QS-RGQ Kit (plasma). Beräkning av det linjära området. Den raka linjen fastställdes genom en linjär regression av log 10 -beräknade koncentrationer jämfört med log 10 -nominella koncentrationer. Ekvationen för regressionslinjen är inkluderad i figuren. Analytisk sensitivitet helblod Den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen (sensitivitetsgräns) utvärderas för artus CMV QS-RGQ Kit med hjälp av CMV-positiva kliniska prover i kombination med extraktionen av QIAsymphony SP. För helblod fastställdes den analytiska sensitiviteten med hänsyn till reningen av artus CMV QS-RGQ Kit med hjälp av spädningsserier av CMV-virusmaterial från 1000 till nominellt 3,16 CMV-kopior/ml spetsade i humana helblodsprover. Dessa användes för att extrahera DNA med användning av QIAsymphony DNA Mini Kit i kombination med VirusBlood200-protokollet (extraheringsvolym: 200 μl, elueringsvolym: 60 μl). Var och en av de 8 spädningarna analyserades med artus CMV QS-RGQ Kit under 3 olika dagar i 6 körningar med 11 replikat vardera. Resultaten fastställdes genom en probitanalys. En grafisk illustration av probitanalysen visas i figur 3. Den analytiska detektionsgränsen avseende rening av artus CMV QS-RGQ Kit i kombination med Rotor-Gene Q är 164,55 kopior/ml (p = 0,05). Detta innebär att det finns en 95-procentig sannolikhet att 164,55 kopior/ml kommer att upptäckas. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

14 1.0 95% 0.8 Proportioner Proportions , ~ 164, copies/ml kopior/ml (95%) %) ( ,01 636,34 kopior/ml) copies/ml) log log (dos) (dose) Figur 3. Probitanalys: helblod, CMV (Rotor-Gene Q). Analytisk sensitivitet med hänsyn till reningen (helblod, med användning av QIAsymphony DNA Mini Kit) för artus CMV QS- RGQ Kit på Rotor-Gene Q. Specificitet helblod Specificiteten för artus CMV QS-RGQ Kit garanteras först och främst genom valet av primrar och prober, samt genom valet av strikta reaktionsvillkor. Primrarna och proberna kontrollerades beträffande eventuella homologier i alla sekvenser som publicerats i genbaser genom sekvensjämförande analys. Därmed säkerställs att alla relevanta genotyper kan detekteras. Dessutom utvärderades specificiteten med 100 olika CMV-negativa helblodsprover. Dessa alstrade inga signaler med de CMV-specifika primrar och prober som ingår i CMV RG Master. Potentiell korsreaktivititet i artus CMV QS-RGQ Kit testades med hjälp av den kontrollgrupp som anges i tabell 1 (se sidan 11). Ingen av de testade patogenerna har varit reaktiv. Inga korsreaktiviteter visade sig med blandade infektioner. Linjärt område helblod Det linjära området med hänsyn till reningen av artus CMV QS-RGQ Kit fastställdes genom att analysera en spädningsserie med CMV-virusmaterial med intervallet 5,00 x 10 7 till 1,00 x 10 2 i helblod. Reningen utfördes i replikat (n = 4 för koncentrationer 1,00 x 10 7 kopior/ml; n = 8 för koncentrationer <1,00 x 10 7 kopior/ml) med användning av QIAsymphony DNA Mini Kit i kombination med VirusBlod200-protokollet (extraktionsvolym: 200 μl, 14 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

15 elueringsvolym: 60 μl). Vart och ett av proven analyserades med hjälp av artus CMV QS-RGQ Kit. Det linjära området med hänsyn till reningen av artus CMV QS-RGQ Kit fastställdes genom att täcka koncentrationer från 1,00 x 10 3 kopior/ml till 5,00 x 10 7 kopior/ml för helblod (figur 4). log 10 uppskattad koncentration (kopior/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y y = 1,0514x x 0, R 2 R= 2 = 0, log log 10 nominell 10 nominal koncentration concentration (kopior/ml) (copies/ml) Figur 4. Linjärt område för artus CMV QS-RGQ Kit (helblod). Beräkning av det linjära området. Den raka linjen fastställdes genom en linjär regression av log 10 -beräknade koncentrationer jämfört med log 10 -nominella koncentrationer. Ekvationen för regressionslinjen är inkluderad i figuren. Robusthet helblod Genom verifiering av robustheten går det att fastställa den totala felfrekvensen av artus CMV QS-RGQ Kit. För att verifiera robustheten spetsades 100 CMVnegativa prover av plasma med 500 kopior/ml av CMV (ungefär en tre gånger så stor koncentration av den analytiska sensitivitetsgränsen). Efter extrahering med QIAsymphony DNA Mini Kit i kombination med VirusBlood200-protokollet för helblod analyserades proverna med artus CMV QS-RGQ Kit. Dessutom utvärderades robustheten på den interna kontrollen genom rening och analys av de 100 spetsade helblodsproverna. Inhibitioner observerades inte. Således är robustheten i artus CMV QS-RGQ Kit 99 %. Precision Precisionsuppgifterna för artus CMV QS-RGQ Kit gör det möjligt att fastställa analysens totala varians. Den totala variansen består av intraanalysvariabiliteten (variabilitet för flera provresultat med samma koncentration inom ett experiment), interanalysvariabiliteteten (variabilitet för artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

16 flera analysresultat alstrade på olika instrument av samma typ av olika operatörer inom ett laboratorium) och interbatchvariabiliteten (variabilitetet för flera analysresultat med hjälp av olika batcher). De uppgifter som erhölls användes för att fastställa standardavvikelsen, variansen, variationskoefficienten för den specifika sjukdomalstraren och den interna kontrollen för PCR. Analytiska precisionsdata i artus CMV QS-RGQ Kit (utan hänsyn tagen till reningen) samlades in med hjälp av kvantifieringsstandarden för den lägsta koncentrationen (QS 4; 10 kopior/μl). Tester utfördes med åtta replikat. Precisionsdata beräknades med utgångspunkt från C T -värdena i amplifieringskurvorna (C T : tröskelcykel, se tabell 2 nedan). Dessutom fastställdes precisionsdata för kvantitativa resultat i kopior/μl med hjälp av motsvarande CT-värden (tabell 3, sidan 17). Baserat på dessa resultat är den totala statistiska spridningen för ett av de givna proven med nämnd koncentration 1,21% (C T ) eller 14,38 % (koncentration) och 1,93 % (C T ) för upptäckten av den interna kontrollen. Dessa värden bygger på slutsumman för alla enskilda värden av de fastställda variabiliteterna. Tabell 2. Precisionsdata på underlag av C T -värdena Intraanalysvariabilitet: CMV QS 4 Intraanalysvariabilitet: Intern kontroll Interanalysvariabilitet: CMV QS 4 Interanalysvariabilitet: Intern kontroll Interbatchvariabilitet: CMV QS 4 Interbatchvariabilitet: Intern kontroll Total varians: CMV QS 4 Total varians: Intern kontroll Standardavvikelse Varians Variationskoef ficient (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 16 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

17 Tabell 3. Precisionsdata på grundval av kvantitativa resultat (i kopior/μl) Intraanalysvariabilitet: CMV QS 4 Interanalysvariabilitet: CMV QS 4 Interbatchvariabilitet: CMV QS 4 Total varians: CMV QS 4 Standardavvikelse Varians Variationskoef ficient (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Reproducerbarhet Med hjälp av reproducerbarhetsdata är det möjligt att regelbundet utvärdera artus CMV QS-RGQ Kit och att göra en effektivitetsjämförelse med andra produkter. Dessa data erhålls vid deltagande i etablerade kunskapsprogram. Korskontamination Frånvaro av korskontamination mellan prover i hela arbetsflödet bevisades genom korrekt detektion av alla kända positiva och negativa prover i växlande positioner (schackrutigt mönster) för valda artus QS-RGQ-system. Arbetsflöde QIAsymphony RGQ-arbetsflödet startar med rening av nukleinsyror från humana plasma- eller helblodsprover på QIAsymphony SP-instrumentet. De eluerade substanserna, vilka innehåller renade nukleinsyror, från provberedningsförfarandet överförs till QIAsymphony AS-modulen, vilken därefter utför analysinställningar (figur 5). Analyserna överförs därefter till Rotor-Gene Q för PCR och dataanalys (figur 6). På sidorna ges en översikt av arbetsflödet. Om du vill ha mer information, hänvisas till de utförliga protokollen i denna handbok (sidorna 34, 42 och 48). artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

18 Figur 5. Enkel automatisering på QIAsymphony SP/AS-instrument. Prover, reagenser och konsumtionsvaror laddas i relevanta lådor. Provberedning och analysinställningar automatiseras därefter helt på QIAsymphony SP/AS-instrumenten. Figur 6. Överföring av proven till Rotor-Gene Q. Efter provberedning och analysinställningar laddas reaktionerna i Rotor-Gene Q:s 72-brunnsrotor för analys av PCR i realtid. 18 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

19 QIAsymphony RGQ-arbetsföde översikt QIAsymphony SP Ladda lådan Waste (avfall). Placera elueringsstället i lådan Eluate (Eluerad substans). Oberoende drift Integrerad drift Placera elueringsstället i skåra 1. Placera elueringsstället med adapter, inklusive överföringsramen i skåra 1. Ladda lådan Reagents and Consumables (reagens och förbrukningsmaterial). Ladda lådan Sample (prov). Definiera en körning/batch med provberedningens användargränssnitt. Starta protokollet. När provbearbetningen är klar tar du antingen bort elueringsstället från lådan Eluate, (oberoende drift) manuellt, eller överför elueringsstället direkt till QIAsymphony AS via överföringsmodulen (integrerad drift). Oberoende drift Integrerad drift Tag bort elueringsstället från skåran på pekskärmen, öppna därefter lådan Eluate (eluat) och tag bort elueringsstället manuellt. Tryck på Transfer (överför) för att överföra elueringsstället från QIAsymphony SP till QIAsymphony AS. Ladda ned QIAsymphony SP-resultatfilen. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

20 QIAsymphony AS Växla till ananalysinställningarnas användargränssnitt i pekskärmen. Starta analysdefinitionen. Oberoende drift Integrerad drift Tryck på New (Ny). Ett meddelande visas, vilket frågar dig om du vill använda elueringsstället som ett provställ. Tryck på Yes för att bekräfta. Definiera en analyskörning. De skärmar som visas på pekskärmen vägleder dig steg för steg genom analysdefinitionen. Ladda lådorna Eluate and Reagents samt Assays (Analyser) med lämpliga prover, reagenser och konsumtionsvaror. Skärmen Loading Information (Ladda information) ger dig utförlig information. Alternativt kan du trycka på Queue (Kö) och ladda ned informationsfilen. Starta analyskörningen. När körningen är klar tar du bort analyserna. Tryck på Remove (Tag bort) och tag därefter bort analysstället/analysställen från lådan Assays. Överför analysstället (analysställen) till Rotor-Gene Q. Ladda ned QIAsymphony AS-resultatfilen och cyklerfilen. Överför cyklerfilen till Rotor-Gene Q. 20 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

21 Rotor-Gene Q Välj eller skapa en temperaturprofil. Klicka på Start Run (starta körning). När körningen är klar analyserar du resultaten. Underhåll Utför lämpliga underhållsförfaranden för QIAsymphony SP/AS och Rotor-Gene Q enligt instrumentets användarhandböcker. Se avsnitt 8 i QIAsymphony SP/AS User Manual General Description (QIAsymphony SP/AS användarhandbok Allmän beskrivning) och avsnitt 9 i Rotor-Gene Q User Manual användarhandbok. De ger dig mer specifikationer om de underhållsförfaranden som måste utföras dagligen, regelbundet och varje vecka. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

22 Utrustning och reagenser som användaren ska tillhandahålla När du arbetar med kemikalier ska du alltid ha på dig en laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon. Om du vill ha mer information, hänvisas till tillämpliga materialsäkerhetsdatablad (MSDSs), vilka kan erhållas från produktleverantören. Pipetter (justerbara)* och sterila pipettspetsar med filter Vortex-blandare* Bordscentrifug* med rotor för 2 ml reaktionsrör med en centrifugeringskapacitet på 6800 x g För provberedning QIAsymphony SP-instrument (kat.nr )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (kat. nr ) för plasmaprover eller QIAsymphony DNA Mini Kit (kat. nr ) för helblodsprover Adaptrar för QIAsymphony SP: Elueringsmikrorörställ QS (avkylningsadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ) Rörinföring 3B (införing, 2,0ml v2, provbärare (24), Qsym, kat.nr ) Konsumtionsvaror för QIAsymphony SP: Provberedn.patroner, 8-brunnars, (kat.nr ) 8-stavars skydd (kat.nr ) Filterspetsar, 1500 μl (kat.nr ) Filterspetsar, 200 μl (kat.nr ) Elueringsmikrorör CL (kat.nr 19588) Spetsavfallspåsar (kat.nr ) Mikrorör 2,0 ml typ H eller mikrorör 2,0 ml typ I (Sarstedt, kat. nr och , för användning med prover och interna kontroller * Förvissa dig om att du har kontrollerat och kalibrerat instrumenten enligt tillverkarens rekommendationer. 22 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

23 För analysinställning QIAsymphony AS-instrument (kat.nr )* Adaptrar och reagenshållare för QIAsymphony AS: Reagenshållare 1 QS (avkylningsadapter, reagenshållare 1, Qsym, kat.nr ) Reagenshållare 2 QS (avkylningsadapter, reagenshållare 2, Qsym, kat.nr ) RG-testremserör 72 QS (avkylningsadapter, RG-testremserör 72, Qsym, kat.nr ) Konsumtionsvaror för QIAsymphony AS: Testremserör med lock, 0,1 ml (kat.nr ) Rör, koniska, 2 ml, Qsym AS (kat.nr ) eller mikrorör 2,0 ml, typ I (Sarstedt, kat.nr , Rör, koniskt, 5 ml, Qsym AS (kat.nr ) eller rör med platt bas från PP (Sarstedt, kat.nr , Reagensflaskor, 30 ml, Qsym AS (kat.nr ) Elueringsmikrorör CL (kat.nr 19588) Filterspetsar, 1500 μl (kat.nr ) Filterspetsar, 200 μl (kat.nr ) Filterspetsar, 50 μl (kat.nr ) Spetsavfallspåsar (kat.nr ) För PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument* Rotor-Gene Q programversion 2.02 eller högre * Förvissa dig om att du har kontrollerat och kalibrerat instrumenten enligt tillverkarens rekommendationer. Kontrollera om produkten är tillgänglig. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

24 Viktiga anmärkningar Allmänna försiktighetsåtgärder Var alltid noga med följande: Använd sterila pepiettspetsar med filter. Håll om möjligt rör stängda under manuella åtgärder och undvik kontamination. Tina alla komponenter noggrant vid rumstemperatur (15 25 C) innan du startar en analys. När komponenterna är tinade, blandar du dem (pipettera upprepade gånger upp och ned eller genom pulsvortex-blandning) och centrifugera kort. Kontrollera att det inte finns något skum eller några bubblor i reagensrören. Blanda inte komponenter från kit med olika lotnummer Kontrollera att de nödvändiga adaptrarna har förkylts till 2 8 C. Arbeta snabbt och håll PCR reagenser på is eller i kylblocket innan du laddar dem. Fortgå kontinuerligt från en del i arbetsflödet till nästa. Överskrid inte en timmes överföringstid mellan varje modul (QIAsymphony SP till QIAsymphony AS till Rotor-Gene Q). Insamling, förvaring och transport av prov Alla prover måste behandlas som potentiellt infektiöst material. Enbart följande provmaterial är tillåtna, där följande regler och särskilda instruktioner om insamling, transport och förvaring strikt har iakttagits. Den interna utvärderingen av artus CMV QS-RGQ Kit har utförts med humana EDTA-plasmaprover och humana EDTA helblodsprover. Annat provmaterial har inte utvärderats. Använd endast den rekommenderade DNA-isoleringssatsen (se Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP, sidan 34) vad beträffar provberedning. Om du använder vissa provmaterial måste du strikt iaktta speciella instruktioner om insamling, transport och förvaring. Insamling av prov Varje tappning av blod skadar blodkärl (artärer, vener och kapillärer). Använd endast harmlöst och sterilt material. Det finns lämpliga engångsförpackningar för tappning av blod. Använd inte kapillärnålar för venpunkturer. Tappa 24 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

25 venblod på lämpliga ställen i armvecket, på underarmen eller på handens baksida. Blod måste tappas med standardprovinsamlingsrör (röd hätta, Sarstedt eller motsvarande rör från annan tillverkare). Tappa en volym motsvarande 5 10 ml EDTA-blod. Rör ska blandas ovanför huvudet direkt efter blodinsamling (åtta gånger, rör inte om). Prover från hepariniserade människor får inte användas (se Störande substanser plasma och Störande substanser helblod nedan). Provförvaring För plasma måste helblod separeras i plasma- och cellulära komponenter genom centrifugering under 20 minuter vid x g inom sex timmar. Den isolerade plasman måste överföras i sterila polypropylen rör. Analysens sensitivitet kan minska om du fryser proven som ett rutinförfarande eller förvarar dem under en längre tid. Provtransport Provmaterial ska rutinmässigt transporteras i en splitterfri transportbehållare. På så sätt undviker du att en infektion uppstår på grund av läckande prov. Transportera proven enligt lokala och nationella instruktioner för transport av patogen material.* Proven måste levereras inom sex timmar. Vi rekommenderar inte att du förvarar proven på insamlingsplatsen. Du kan leverera proven via post, om du följer de lagenliga instruktionerna för transport av patogen material. Vi rekommenderar provtransport via bud. Blodproven måste transporteras kylförvarade (2 8 C), och den separerade plasman djupfryst ( 15 till 30 C). Störande substanser plasma Förhöjda nivåer av albumin ( 6 g/dl), bilirubin ( 30 mg/dl) och lipider ( 1 g/dl triglycerid), såväl som hemolytiska prover ( 2 g/dl hemoglobin) påverkar inte systemet. Heparin påverkar PCR. Prover som har insamlats i rör innehållande heparin som antikoagulant får inte användas. Prover från hepariniserade patienter får inte heller användas. * International Air Transport Association (IATA). Föreskrifter om farligt gods. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

26 Störande substanser helblod Förhöjda nivåer av bilirubin ( 30 mg/dl), lipider ( 1 g/dl triglycerid) och humant genomt DNA ( 3 μg/ml) påverkar inte systemet. Heparin påverkar PCR. Prover som har insamlats i rör innehållande heparin som antikoagulant får inte användas. Prover från hepariniserade patienter får inte heller användas. Så här kommer du i gång med QIAsymphony SP/ASinstrument Stäng alla lådor och huvar. Sätt på QIAsymphony SP/AS-instrumenten och vänta tills skärmen Sample Preparation (provberedning) visas och initieringen har slutförts. Logga in på instrumentet (lådorna låses upp). Ladda reagenspatroner (RC) i lådan Reagents and Consumables (reagenser och konsumtionsvaror). Reagenser för rening av nukleinsyror ligger i en innovativ reagenspatron (RC) (se figur 7). Varje tråg i reagenspatronen (RC) innehåller en speciell reagens, till exempel magnetiska partiklar, lysbuffert, tvättbuffert, eller elueringsbuffert. Reagenspatroner (RC) som använts till en del kan stängas på nytt med återanvändbara tätningsremsor för senare användning, vilket förhindrar uppkomsten av avfall på grund av överblivna reagenser mot slutet av reningsförfarandet. Piercing lid (PL) Enzyme rack (ER) Slots for screw caps from enzyme tubes Reuse Seal Strip Magnetic-particle trough Frame with reagent troughs Reagent cartridge holder Figur 7. Kassera reagenspatron (RC). Reagenspatronen (RC) innehåller alla reagenser som behövs för reningsprocessen. 26 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

27 Innan du startar förfarandet, måste du kontrollera att magnetpartiklarna är helt resuspenderade. Tag bort magnetpartikeltråget från reagenspatronramen, vortex-blanda det kraftfullt under minst tre minuter och byt ut det i reagenspatronramen före den första användningen. Placera reagenspatronen (RC) i reagenspatronhållaren. Placera enzymstället (ER) i reagenspatronhållaren. Innan du använder reagenspatronen (RC) den första gången, placerar du instickslocket (PL) på reagenspatronen (RC) (figur 8). Instickslocket (PL) är vasst. Var försiktig när du placerar det i reagenspatronen (RC). Kontrollera att du placerar instickslocket (PL) på reagenshållaren (RC) i rätt riktning. När du har tagit bort magnetpartikeltrågskyddet och öppnat enzymställrören (skruvlock kan förvaras i skåror avsedda för detta ändamål, se figur 5), laddar du därefter reagenshållaren (RC) i lådan Reagents and Consumables. Piercing lid (PL) Figur 8. Enkel inställning av arbetsbord med reagenspatroner (RC). Reagenspatroner (RC) som använts till en del kan förvaras tills de behövs igen, se Storage (Förvaring) i Handbok för QIAsymphony DSP Virus/Pathogen eller QIAsymphony DNA Handbook. Ladda plastartiklar i lådan Reagents and Consumables. Provberedningspatroner, 8-stavars skydd (båda förinställda i enhetsaskar) och kasserbara filterspetsar (200 μl spetsar i blå ställ, 1500 μl spetsar i svarta ställ) laddas in i lådan Reagents and Consumables. Kontrollera att du har tagit bort skydden på enhetsaskarna innan du laddar askarna i lådan Reagents and Consumables. Spetsar har filter, vilket hjälper att förhindra korskontamination. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

28 Spetsställskåror i QIAsymphony SP-arbetstabellen kan fyllas med valfri typ av spetsställ. QIAsymphony SP identifierar typ av spetsar som laddats under inventarieskanningen. Fyll inte spetsställ eller enhetsaskar på nytt med provpreparerade patroner eller 8-stavars skydd innan du startar ännu en protokollkörning. QIAsymphony SP kan använda spetsställ och enhetsaskar som är något använda. Ladda lådan med Waste Provpreparerade patroner och 8-stavars skydd som används under en körning ställs på nytt i tomma enhetsaskar lådan Waste (avfall). Kontrollera att lådan Waste innehåller tillräckligt med tomma enhetsaskar för plastavfall som alstrats under protokollkörningen. Kontrollera att du har tagit bort skydden på enhetsaskarna innan du laddar askarna i lådan Waste. Om du använder askar med 8-stavars skydd för att samla in förbrukade provpreparerade patroner och 8-stavars skydd, måste du kontrollera att du har tagit bort askens avståndsbricka. En påse för förbrukade filterspetsar måste fästas på framsidan av lådan Waste. Systemet kontrollerar inte, om det finns en avfallspåse. Konmtrollera att spetsavfallspåsen har fästs ordentligt innan du startar protokollkörningen. Användarhandböckerna som medföljer instrumentet ger mer information. Töm spetspåsen när du har kört maximalt 96 prover, så att det inte anhopas för många spetsar. En avfallsbehållare samlar in flytande avfall som alstrats under reningsförfarandet. Lådan Waste kan endast stängas, om avfallsbehållaren finns på plats. Kassera det flytande avfallet enligt lokala säkerhets- och miljöregler. Autoklavera inte den fyllda avfallsflaskan. Töm avfallsflaskan när du har bearbetat maximalt 96 prover. Ladda lådan med Eluate Ladda det krävda elueringsstället i lådan Eluate. Använd Elution slot 1 (elueringsskåra 1) med motsvarande avkylningsadapter. Placera elueringsstället med adpter, inklusive överföringsramen i skåra 1 för att få ett integrerat arbetsmoment. Inventarieskanning Innan du startar en körning kontrollerar instrumentet att tillräckligt med konsumtionsvaror för batchen/batcherna i kön har laddats i motsvarande lådor. 28 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

29 Förberedelse av provmaterial QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit är lämpligt för användning med humana plasmaprover, och QIAsymphony DNA Mini Kit är lämpligt för användning med humana helblodsprover. Undvik skumbildning i eller på proven. Prover ska bringas i jämvikt till rumstemperatur (15 25 C) innan du startar körningen. Preparera blandningar av bärar-rna (CARRIER) och AVEbuffert (AVE) för plasmaprover Bärar-RNA (CARRIER) måste användas vid användning av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit. Om du vill bereda en bärar-rna- (CARRIER) moderlösning, tillsätter du 1350 μl buffert AVE (AVE), (tillhandahålls i ampuller á 2 ml) i det rör som innehåller 1350 μg frystorkad bärar- RNA (CARRIER) för att erhålla en lösning á 1 μg/μl. Lös bärar-rna (CARRIER) noggrant, dela den i lagom stora alikvoter och förvara vid 2 8 C i upp till två veckor. Beräkna volymen för bärar-rna (CARRIER)-blandning per rör Minimivolymen av bärar-rna (CARRIER)-buffert-AVE (AVE)-blandning måste inkludera tillräckligt stor extra volym för att ta med den vätskeförlust i beräkningen som beror på pipettering och avdunstning. Se tabell 4, om du vil veta mer om de volymer du kan använda tillsammans för analys med artus CMV QS-RGQ Kit. Rör som innehåller bärar-rna (CARRIER)-buffert-AVE (AVE) och intern kontrollblandningar är placerade i en rörbärare. Den rörbärare som innehåller bärar- RNA (CARRIER)-buffert AVE (AVE)-blandning(ar) måste placeras i provlådans skåra A. Upp till åtta rör av blandningen kan användas per batch, och upp till 24 rör kan användas per körning av fyra batcher. Använda en intern kontroll En intern kontroll (CMV IC) levereras tillsammans med artus CMV QS-RGQ Kit. Detta gör att användaren både kan kontrollera DNA-isoleringsförfarandet och kontrollera om det finns en möjlig inhibition av PCR. Om CMV och EBV ska analyseras i samma PCR-körning på Rotor-Gene Q (se Fleranalyskörningar, sidan 31) ska CMV IC användas för samtliga prover och inte EBV RG IC som ingår i artus EBV QS-RGQ Kit. Samma CMV IC ska också användas för analysinställning för PCR-kontrollerna (steg 13 i analysinställningsprotokollet, sidan 44). artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

30 QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit eller QIAsymphony DNA Mini Kit i kombination med artus CMV QS-RGQ Kit kräver att den interna kontrollen (CMV IC) förs in i reningsförfarandet för att övervaka effektiviteten av provförberedelse och analys nedströms. För plasmaprover måste interna kontroller tillsättas med en blandning av bärar- RNA (CARRIER) och AVE-buffert (AVE), och den totala volymen av blandningen av intern kontrollbärar-rna (CARRIER) och AVE- buffert (AVE) förblir 120 μl. För helblodsprover måste interna kontroller spädas med ATE-buffert. En total volym av 60 μl intern kontroll-ate-buffertblandning tillsätts per prov. För denna ansökan tillsätter du den interna kontrollen i isoleringen enligt tabell 4. Denna framställer ett tillägg av den interna kontrollen i isoleringen vid ett förhållande på 0,1 μl per 1 μl elueringsvolym. Vi rekommenderar att du preparerar färska blandningar för varje körning precis innan användning. Tabell 4. Förberedelse av intern kontroll-bärar-rna (CARRIER) Plasmaprover Helblodsprover Komponent Volym (μl) Volym (μl) Stammar från bärare av RNA (CARRIER) 5 0 Intern kontroll* 9 9 Buffert-AVE Buffert-ATE 0 51 Slutlig volym per prov (exklusive dödvolym). Total volym för n prover (n x 120) (n x 60) * Beräkningen av andelen intern kontroll bygger på de inledande elueringsvolymerna (90 μl). Ytterligare tomvolym beror på vilken typ av provrör som används. Fyll inte mer än 1,92 ml /motsvarande högst 13 eller 26 prover. Denna volym specificeras för mikrorör 2,0 ml typ H och mikrorör 2,0 ml typ I, Sarstedt kat.nr och ). Intern kontrollblandning motsvarande ytterligare tre prover (dvs 360 μl) krävs (denna volym specificeras för mikrorör 2,0 ml typ H och mikrorör 2,0 ml typ I, Sarstedt kat.nr och ). Intern kontrollblandning motsvarande ytterligare fyra prover (dvs 240 μl) krävs (denna volym specificeras för mikrorör 2,0 ml typ H och mikrorör 2,0 ml typ I, Sarstedt kat.nr och ). 30 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

31 Analyskontrolluppsättningar och analysparameteruppsättningar Analyskontrolluppsättningar är kombinationen av ett protokoll plus extra parametrar, till exempel intern kontroll, för provrening på QIAsymphony SP. En förvald analyskontrolluppsättning har förinstallerats för varje protokoll. Om CMV och EBV ska analyseras i samma PCR-körning på Rotor-Gene Q (se Fleranalyskörningar nedan) ska lämplig CMV-analyskontrollset användas för provrening. Analysparameteruppsättningar är kombinationen av en analysdefinition med ytterligare parametrar definierade, till exempel replikaträkning och antal analysstandarder, för analysinställningar på QIAsymphony AS. Fleranalyskörningar I vissa fall är det möjligt att analysera ett enstaka prov för mer än en patogen i samma PCR i QIAsymphony RGQ-arbetsflödet. Detta kallas för en fleranalyskörning. Flera krav måste vara uppfyllda för en fleranalyskörning. artus CMV QS-RGQ Kit kan användas med artus EBV QS-RGQ Kit (kat.nr ) i en fleranalyskörning om följande krav är uppfyllda. Provpreparering i QIAsymphony SP För rening av prover som ska testas för CMV och EBV med användning av samma eluat ska CMV IC användas för samtliga prover och inte EBV RG IC som ingår i artus EBV QS-RGQ Kit. Använd lämpligt CMV-analyskontrollset för provrening. Analysinställningar på QIAsymphony AS För lämplig kvantifiering samt för att få giltig information från den interna kontrollen måste den interna kontroll som ställs in för båda analyserna motsvara den som användes vid provprepareringen (CMV IC). Använd CMV IC från samma lot för både provberedning och analysinställning för PCRkontrollerna (steg 13 i analysinställningsprotokollet, sidan 44). Använd inte CMV IC med ett annat lotnummer. PCR på Rotor-Gene Q På grund av skillnader i flourescensintensiteten när man använder två olika analyser vid fleranalyskörningar är det nödvändigt att utföra en artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

32 förstärkningskalibrering för varje artus-detektionssystem för sig innan PCRkörningen startas (steg 9 15 i PCR-protokollet, sidorna 52 55). Utbyten av nukleinsyror Eluerade substanser preparerade med bärar-rna (CARRIER) kan innehålla många fler bärar-rna (CARRIER) än målnukleinsyror. Vi rekommenderar att du använder kvantitativa amplifieringsmetoder för att fastställa utbyten. Förvaring av nukleinsyror För korttidsförvaring upp till 24 timmar rekommenderar vi en förvaring av nukleinsyror vid 2 8 ºC. För långtidsförvaring över 24 timmar rekommenderar vi förvaring vid 20 ºC. Inställning av tröskel för PCR-analysen Optimal tröskelinställning för en viss kombination av Rotor-Gene Q-instrument och artus QS-RGQ Kit ska fastställas empiriskt genom att testa varje enskild kombination, då detta är ett relativt värde som beror på det övergripande diagnostiska arbetsflödet. Som utgångspunkt kan tröskeln ställas in på ett preliminärt värde av 0,04 för analysen av den första PCR-körningen, men detta värde ska finjusteras genom komparativ analys av följande körningar i arbetsflödet. Tröskeln ska ställas in manuellt strax över bakgrundssignalen från de negativa kontrollerna och negativa proverna. Det genomsnittliga tröskelvärde som beräknas genom dessa experiment kommer sannolikt att fungera för de flesta av de kommande körningarna, men användaren måste inte desto mindre granska det genererade tröskelvärdet regelbundet. Tröskelvärdet ligger oftast inom området 0,03 0,05 och ska rundas av till högst tre decimaler. Kvantifiering Kvantifieringsstandarderna (CMV QS 1 4) i artus CMV QS-RGQ Kit behandlas som tidigare renade prover och samma volym används (20 μl). Om du vill framställa en standardkurva på Rotor-Gene Q-instrument, måste du använda alla 4 kvantifieringsstandarder och definiera dessa i dialogrutan Edit Samples (Redigera prover) på Rotor-Gene Q-instrumentetsom standarder med de specificerade koncentrationerna (se instrumentanvändarhandboken). 32 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

33 Kvantifieringsstandarderna definieras som kopior/μl. Följande ekvation måste användas för att omvandla de fastställda värdena med hjälp av standardkurvan till kopior/ml provmaterial: Resultat (kopior/ml) = Resultat (kopior/μl) x inledande elueringsvolym (90 μl)* Provvolym (ml) Principiellt ska den inledande provvolymen fyllas i ekvationen ovan. Tag hänsyn till denna när provvolymen har förändrats före extraktionen av nukleinsyran (till exempel reducering av volymen genom centrifugering eller ökning av volymen genom att tillsätta den volym som krävs för isoleringen). * Beräkningen baserar på de inledande elueringsvolymerna (90 μl). artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

34 Protokoll: DNA-isolering på QIAsymphony SP QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (QIAGEN, kat.nr ) är validerat för viral DNA-rening från human plasma och QIAsymphony DNA Mini Kit (QIAGEN, kat.nr ) är validerat för viral DNA-rening från humant helblod för användning med artus CMV QS-RGQ Kit. Allmän information om protokollen visas i tabell 5. Tabell 5. Allmän protokollinformation Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit QIAsymphony DNA Mini Kit Provmaterial Plasma Helblod Provvolym (inklusive överskottsvolym) Protokollnamn 1200 μl 300 μl Cellfree1000_V4_DSP * VirusBlood200_V4* Förvald analyskontrolluppsättning ACS_Cellfree1000_V4 _DSP artus CMV* ACS_VirusBlood200_V4 _ artus_cmv* Elueringsvolym 60 μl 60 μl Nödvändig programversion Version 3.1 eller högre Version 3.5 eller högre * V4 eller högre, beroende på vilken programversion som används. För fleranalyskörningar där både CMV och EBV ska analyseras i samma PCR ska lämpligt CMV-analyskontrollset användas för provrening. Viktiga saker att tänka på innan du startar Kontrollera att du vet hur du manövrerar QIAsymphony SP/ASinstrumenten. De användarhandböcker som medföljer instrumenten innehåller driftinstruktioner. Innan du startar förfarandet läser du Viktiga anmärkningar, sidorna Innan du använder reagenspatronen (RC) för första gången kontrollerar du att bufferterna QSL2 och QSB1 i patronen (RC) inte innehåller någon utfällning. Vid behov avlägsnar du de tråg som innehåller bufferterna QSL2 och QSB1 från reagenspatronen (RC) och inkuberar under trettio minuter vid 37 C med sporadiska omskakningar för att lösa upp 34 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010

35 precipitatet. Ersätt trågen i korrekta positioner. Om du redan har stuckit igenom reagenspatronen (RC), kontrollerar du att trågen är tätade med återanvändbara tätningsremsor och inkuberar hela reagenspatronen (RC) under trettio minuter vid 37 C med sporadiska omskakningar i ett vattenbad.* Försök att undvika kraftiga omskakningar av reagenspatronen (RC) eftersom det kan bildas skum, vilket kan ge upphov till problem med att upptäcka vätskenivån. Alla komponenter i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit har visat sig vara stabila ombord på QIAsymphony SP/AS-instrumenten under minst den normala tid som krävs för att bearbeta 96 prover. Gör följande innan du startar Preparera alla nödvändiga blandningar, inklusive blandningar som innehåller bärar-rna (CARRIER) och interna kontroller precis innan du startar. Mer information finns i Preparera blandningar av bärar-rna (CARRIER) och AVE-buffert (AVE) för plasmaprover, sida 29 och i Använda en intern kontroll, sida 29. Kontrollera att du har placerat instickslocket (PL) på reagenspatronen (RC), och att du har tagit bort locket på det magnetiska partikeltråget. Om du använder en reagenspatron (RC) som redan har brukats en del, kontrollerar du att du har tagit bort de återanvändbara tätningsremsorna. Innan du startar förfarandet, måste du kontrollera att magnetpartiklarna är helt resuspenderade. Vortex-blanda tråget som innehåller de magnetiska partiklarna kraftfullt under minst tre minuter före första användningen. Innan du laddar reagenspatronen (RC) tar du bort skyddet från det tråg som innehåller de magnetiska partiklarna och öppnar enzymrören. Kontrollera att enzymstället har bringats i jämvikt med rumstemperatur (15 25 C). Kontrollera att du har placerat instickslocket (PL) på reagenspatronen (RC). Om du använder en reagenspatron som redan brukats en del, kontrollerar du att du har tagit bort de återanvändbara tätningsremsorna. Om prover är streckkodade, ställer du in proven i rörbäraren så att streckkoderna pekar mot streckkodsläsaren inuti lådan Sample (prov) till vänster om QIAsymphony SP. Förfarande 1. Stäng alla lådor och huvar på QIAsymphony SP/AS-instrumenten. * Förvissa dig om att du har kontrollerat, underhållit och kalibrerat instrumenten regelbundet enligt tillverkarens rekommendationer. artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/

36 2. Sätt på instrumenten och vänta tills skärmen Sample Preparation (provberedning) visas och initieringen har slutförts. Strömbrytaren sitter nedtill i det vänstra hörnet på QIAsymphony SP. 3. Logga in på instrumenten. 4. Kontrollera att lådan Waste har preparerats korrekt (se tabell 6) och skanna inventariet i lådan Waste, inklusive spetsrännan och det flytande avfallet. Byt spetsavfallspåse vid behov. Tabell 6. Preparera lådan Waste Enhetsaskhållare 1 4 Avfallspåshållare Flaskhållare för flytande avfall Tomma enhetsaskar Sätt in avfallspåse Töm och installera flaska för flytande avfall 5. Ladda det krävda elueringsstället i lådan Eluate. Använd endast Elution slot 1 med tillhörande avkylningsadapter (Cavkylningsadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ). Placera elueringsstället med adpter, inklusive överföringsramen i skåra 1 för att få ett integrerat arbetsmoment. 6. Ladda nödvändig(a) reagenspatron(er) (RC) och konsumtionsvaror i lådan Reagents and Consumables (se tabeller 7 och 8). Beroende på inställningarna kan antalet givna filterspetsar skilja sig från de siffror som visas på pekskärmen. 36 artus CMV QS-RGQ Kit handbok 12/2010