Handbok för QIAamp DSP Virus Kit

Transkript

1 November 2016 Handbok för QIAamp DSP Virus Kit 50 QIAamp DSP Virus Kit är ett generiskt system som använder QIAamp-teknik för isolering och rening av virala nukleinsyror från humana plasma- eller serumprover för in vitro-diagnostiska procedurer. För in vitro-diagnostisk användning QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, Tyskland R Sample & Assay Technologies

2 Varumärken: QIAGEN, QIAamp, artus, MinElute (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche Group); RealArt (artus GmbH); Eppendorf (Eppendorf AG). Registrerade namn, varumärken osv. som används i detta dokument, även när de inte uttryckligen har markerats som sådana, får inte betraktas som oskyddade i lag. PCR-processen täcks av de amerikanska patenten 4,683,195 och 4,683,202 och motsvarande utländska som ägs av Hoffmann-La Roche AG QIAGEN, med ensamrätt.

3 Innehåll Kitinnehåll 4 Symboler 6 Förvaring 7 Kvalitetskontroll 7 Användningsområde 7 Begränsningar för produktanvändning 8 Varningar och försiktighet 8 Inledning 10 Princip och utförande 12 Viktiga anmärkningar 17 Viktigt att tänka på före start 17 Bereda RNA 18 Förvara prover 18 Förbereda reagenser och buffertar 18 Eluera virala nukleinsyror 21 Utbyte av och kvalitet på virala nukleinsyror 21 Montera vakuumsystemet QIAvac 24 Plus 22 Protokoll Isolering och rening av virala nukleinsyror från plasma och serum 25 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016 3

4 Kitinnehåll QIAamp DSP Virus Kit Katalognr Antal provpreparat 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute Columns with Wash Tubes (WT) (QIAamp MinElute -kolonner med tvättrör) (2 ml) 50 EXT ET VC Column Extenders (Kolonnförlängare) (3 ml) Elution Tubes (Elueringsrör) (1,5 ml) VacConnectors (Vakuumanslutningar) LT Lysis Tubes (Lyseringsrör) (2 ml) 50 WT Wash Tubes (Tvättrör) (2 ml) 50 AL Lysis Buffer* (Lyseringsbuffert*) 33 ml AW1 Wash Buffer 1* (Tvättbuffert 1) (koncentrat) AW2 Wash Buffer 2 (Tvättbuffert 2) (koncentrat) 19 ml 13 ml AE PS Carrier Elution Buffer (Elueringsbuffert) (lila lock) Protease Solvent (Proteaslösningsmedel) Carrier-RNA (Bärar-RNA) (röda lock) 4 x 2 ml 4,4 ml 310 QP QIAGEN Protease 1 flaska CD 1 Handbok 1 4 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

5 * Innehåller guanidinhydroklorid. Inte kompatibel med desinfektionsmedel med blekmedel. Varningar och försiktighet finns på sidan 8. Innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Resuspensionsvolym 4,4 ml. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016 5

6 Symboler 50 Kitet innehåller reagens för 50 provpreparat Se information i handboken Använd före Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialnummer Komponenter Volym Temperaturbegränsningar Vid ankomst Laglig tillverkare Viktig anmärkning Byt handskar efter protokollsteg med denna markering Öppna vid leverans. Förvara QIAamp Mini Spin-kolonner vid 2 8 C GTIN-artikelnummer (Global Trade Item Number) Skriv ner aktuellt datum efter tillsats av etanol i flaskan Tillsats Innehåller Frystorkad Rekonstituera i Etanol Guanidinhydroklorid Maleinsyra Subtilisin Leder till 6 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

7 Förvaring QIAamp MinElute-kolonner ska förvaras vid 2 8 C vid ankomsten. Alla buffertar kan förvaras i rumstemperatur (15 25 C). Frystorkat bärar-rna kan förvaras vid rumstemperatur fram till utgångsdatumet. Bärar-RNA kan endast lösas upp i elueringsbuffert (AVE). Upplöst bärar-rna ska omedelbart tillsättas till lyseringsbuffert (AL) enligt beskrivningen på sidan 19. Denna lösning ska beredas färsk, och är hållbar vid 2 8 C i upp till 48 timmar. Oanvända delar av bärar-rna upplöst i elueringsbuffert (AVE) ska frysas i alikvoter vid 20 C. Frystorkat QIAGEN Protease (QP) kan förvaras vid rumstemperatur fram till utgångsdatumet utan försämrad prestanda. Rekonstituerat QIAGEN Protease (QP) är hållbart i upp till 1 år vid förvaring i 2 8 C, men endast fram till utgångsdatumet. Rekonstituerad tvättbuffert 1 (AW1) och rekonstituerad tvättbuffert 2 (AW2) är hållbara i upp till 1 år vid förvaring i rumstemperatur, men endast fram till utgångsdatumet. Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGENs certifierade totala kvalitetshanteringssystem testas varje batch av QIAamp DSP Virus Kit mot förbestämda specifikationer för att garantera konstant produktkvalitet. Användningsområde QIAamp DSP Virus Kit är ett generiskt system som använder QIAamp-teknik för isolering och rening av virala nukleinsyror från human plasma eller serumprover för in vitro-diagnostiska syften. Ett diagnostiskt resultat genererat med provberedningsproceduren tillsammans med en efterföljande diagnostisk NAT-analys bör tolkas med hänsyn tagen till andra kliniska undersökningar eller laboratorieundersökningar. Produkten är avsedd för användning av professionella användare som laboratoriepersonal och läkare utbildade i molekylärbiologiska tekniker. Den är utformad för användning med en nedströmsapplikation som använder enzymatisk amplifiering eller annan enzymatisk modifiering av DNA eller RNA följt av signaldetektion eller amplifiering. De isolerade och renade virala nukleinsyrorna kan användas vid kvalitativa (t.ex. blodscreening) såväl som kvantitativa (t.ex. övervakning av virusbelastning) diagnostiska NAT-analyser. För att minimera avvikelser i diagnostiska resultat, ska produkten användas med en intern kontroll och positiva och negativa kontroller under hela Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016 7

8 processen för provberedning, och provamplifiering och -detektion enligt den nedströmsanalys som används. Produkten är utformad för att användas med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus eller ett likvärdigt vakuumsystem. Begränsningar för produktanvändning Kitet är inte avsett att användas med blod, vävnad, benmärg eller odlade celler. Kitet är inte heller avsett för isolering och rening av nukleinsyror från bakterier, svampar eller parasiter. Prestandan för kitet när det gäller isolering och rening av virala nukleinsyror från andra cellfria kroppsvätskor, såsom urin och ryggmärgsvätska, har inte utvärderats. Varningar och försiktighet Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Ytterligare information finns i aktuella säkerhetsdatablad (SDS). Dessa är tillgängliga online i praktiskt och kompakt pdf-format på där du kan hitta, granska och skriva ut säkerhetsdatablad för alla kit och kitkomponenter från QIAGEN. OBS! Tillsätt inte blekmedel eller sura lösningar till provberedningsavfallet. Lyseringsbuffert (AL) och tvättbuffert 1 (AW1) innehåller guanidinhydroklorid som kan bilda mycket reaktiva föreningar i kombination med blekmedel. Om vätska med dessa buffertar spills ut ska rengöring utföras med lämpliga laboratorierengöringsmedel och vatten. Om den spillda vätskan innehåller potentiellt smittsamma ämnen ska ytorna först rengöras med laboratorierengöringsmedel och vatten och därefter med 1 % (v/v) natriumhypoklorit. Om buffertflaskorna är skadade eller läcker ska man använda handskar och skyddsglasögon när flaskorna kastas för att undvika personlig skada eller skada på andra. QIAGEN har inte testat vätskeavfallet som genereras av QIAamp DSP Virusproceduren avseende rester av smittsamt material. Det är mycket osannolikt att det flytande avfallet är kontaminerat med smittsamt restmaterial men det kan inte fullständigt uteslutas. Därför måste det flytande avfallet anses vara smittsamt och ska hanteras och kastas i enlighet med lokala säkerhetsbestämmelser. 8 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

9 Nedanstående faro- och skyddsangivelser gäller för komponenter i QIAamp DSP Virus Kit. AL-buffert Innehåller: guanidinhydroklorid; maleinsyra. Varning! Kan vara skadligt vid förtäring eller inandning. Irriterar huden. Orsakar allvarlig ögonirritation. Kan orsaka allergisk hudreaktion. Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Nedstänkta kläder tas av och tvättas innan de används igen. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. AW1-buffert Innehåller: guanidinhydroklorid. Varning! Skadligt vid förtäring eller inandning. Irriterar huden. Orsakar allvarlig ögonirritation. Vid obehag, kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Innehållet/behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. Nedstänkta kläder tas av och tvättas innan de används igen. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. QIAGEN Protease Innehåller: Subtilisin. Fara! Orsakar lindrig hudirritation. Orsakar allvarliga ögonskador. Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. Inandas inte damm/rök/gaser/dimma/ångor/sprej. Innehållet/behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. Vid besvär i luftvägarna: Kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. VID INANDNING: Vid andningsbesvär, flytta personen till frisk luft och se till att han eller hon vilar i en ställning som underlättar andningen. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Använd skyddshandskar/skyddskläder/ögonskydd/ansiktsskydd. Använd andningsskydd. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016 9

10 Inledning QIAamp DSP Virus Kit använder en väletablerad teknik för samtidig isolering och rening av viralt DNA och RNA. QIAamp DSP-virusproceduren kombinerar de selektiva bindande egenskaperna hos ett kiselbaserat membran med minimala elueringsvolymer på 20 µl eller 60 µl. Det linjära intervallet för QIAamp DSP-virusproceduren har fastställts för HIV- RNA och HBV-DNA i flera diagnostiska nedströmsanalyser (tabell 1, figur 1 och 2). Tabell 1. Diagnostiska nedströmsanalyser i vilka det linjära intervallet för QIAamp DSP-virusproceduren har testats Analys Realtids-RT-PCR för HIV-RNA TaqMan -analys och COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR -test Kit Realtids-PCR för HBV-DNA TaqMan-analys och COBAS AMPLICOR HBV MONITOR -test 10 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

11 Linjärt intervall för QIAamp DSP-virusproceduren med TaqMan-analyser A loggresultat IU/ml loggresultat IU/ml B y = 1,0042x + 0,0832 R 2 = 0,9974 logginmatning IU/ml y = 0,9725x + 0,0982 R 2 = 0,9984 logginmatning IU/ml Figur 1. Det linjära intervallet för QIAamp DSP-virusproceduren vid 60 µl elueringsvolym fastställdes med TaqMan-analyser för A HIV-RNA och B HBV-DNA. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

12 Linjärt intervall för QIAamp DSP-virusproceduren med COBAS AMPLICOR MONITOR-tester A loggresultat IU/ml y = 1,0098 x R 2 = 0,9982 logginmatning IU/ml B loggresultat IU/ml y = 0,8839x R 2 = 0,984 logginmatning IU/ml Figur 2. Det linjära intervallet för QIAamp DSP-virusproceduren vid 60 µl elueringsvolym fastställdes med COBAS AMPLICOR MONITOR-tester för A HIV-RNA och B HBV-DNA. Förfarandet är lämpligt att använda med plasma eller serum; båda kan innehålla citrat eller EDTA. Prover kan vara färska, frystorkade eller frysta, förutsatt att de inte har frysts ned och tinats upp mer än en gång. Proceduren kan användas för isolering av viralt RNA och DNA från ett brett urval av RNAoch DNA-virus. Proceduren är utformad för att undvika risken för korskontamination mellan prover och möjliggör säker hantering av potentiellt smittsamma prover. Proceduren är mycket väl anpassad för simultan behandling av flera prover. Virala nukleinsyror elueras i elueringsbuffert (AVE), bruksfärdigt för amplifieringsreaktioner eller förvaring vid 20 C. Princip och utförande QIAamp DSP-virusproceduren består av 4 steg: 12 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

13 Lysering av viruspartiklarna i provet Bindning av de virala nukleinsyrorna i lysatet till membranet i en QIAamp MinElute-kolonn Tvättning av membranet Eluering av de virala nukleinsyrorna från membranet Proceduren utförs med QIAamp MinElute-kolonner på ett vakuumgrenrör. Provvolym Detektionsgränsen (DL) och kvantifieringsgränsen (QL), enligt ICH-riktlinjerna 2QA och 2QB, har fastställts för QIAamp DSP-virusproceduren (med en inledande provvolym på 500 µl och elueringsvolymer på 20 µl och 60 µl) med olika diagnostiska nedströmsanalyser (tabell 2 och 3). Tabell 2. Detektionsgräns för QIAamp DSP-virusproceduren Analys Elueringsvolym 95 % cutoff artus RealArt HBV DNA 20 µl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 µl 24,31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manuell HIV RNA 60 µl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 µl 4,73 IU/ml (n=192) Tabell 3. Kvantifieringsgräns för QIAamp DSP-virusproceduren Analys QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml <70 % (n=88) TaqMan HIV RNA COBAS AMPLICOR HIV RNA COBAS AMPLICOR HBV DNA COBAS AMPLICOR HCV RNA 52 IU/ml <60 % (n=88) 100 IU/ml <60 % (n=88) 30 IU/ml <60 % (n=88) 700 IU/ml <60 % (n=66) Lysering av viruspartiklar Prov lyseras under denatureringsförhållanden vid förhöjda temperaturer. Lysering utförs i närvaro av QIAGEN Protease (QP) och lyseringsbuffert (AL), som tillsammans säkerställer inaktivering av RNaser. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

14 Bindning av nukleinsyror till QIAamp MinElute-kolonnmembranet Först tillsätts etanol till lysaten för att optimera bindningen av viralt DNA och RNA till QIAamp MinElute-kolonnmembranet. Sedan överförs varje lysat till en QIAamp MinElute-kolonn, och virala nukleinsyror adsorberas till kiselgelmembranet när lysatet dras igenom detta med vakuumtryck. Avlägsnande av restkontaminanter De virala nukleinsyrorna fortsätter att vara bundna till membranet i QIAamp MinElute-kolonnmembranet medan kontaminanter effektivt tvättas bort, först med tvättbuffert 1 (AW1) och sedan med tvättbuffert 2 (AW2). Eluering av rena nukleinsyror Virala nukleinsyror elueras från QIAamp MinElute-kolonnmembranet med elueringsbuffert (AVE). QIAamp MinElute-kolonner klarar elueringsvolymer på 20 µl eller 60 µl. Beroende på vilken nedströmsanalys som används, kan eluat av nukleinsyra utgöra upp till 50 % av reaktionsvolymen utan några hämmande effekter. 14 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

15 QIAamp DSP-virusprocedur Prov Lysera Bind Läs protokollet (sidan 25) noga innan du börjar Tillsätt 75 μl QP, 500 μl prov och 500 μl AL i LT Vortexblanda i 15 sek. Inkubera i 15 min. (±1 min.) vid 56 C (± 1 C) Tillsätt 600 μl etanol Vortexblanda i 15 sek. Inkubera i 5 min. (±1 min.) vid rumstemperatur (15 25 C) Vakuum Överför lysat till QIAamp MinElute-kolonnen med ansluten förlängning Vakuum Tvätta (AW1) Ta bort förlängning innan vakuum anbringas Tillsätt 600 µl rekonstituerad AW1 Ta bort förlängning Tvätta (AW2) Tillsätt 700 µl rekonstituerad AW2 Vakuum Tvätta (Etanol) Tillsätt 750 μl etanol Vakuum Torrcentrifugera Eluera Placera QIAamp MinElute-kolonnen i WT Centrifugera i 1 min. vid rpm Placera QIAamp MinElute-kolonnen i WT Inkubera i 3 min. vid 56 C Placera QIAamp MinElute-kolonnen i ET Tillsätt 20 µl eller 60 µl AVE Inkubera i 3 min. vid rumstemperatur Centrifugera i 1 min. vid rpm Rena virala nukleinsyror Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

16 Utrustning och reagenser som ska tillhandahållas av användaren Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt säkerhetsdatablad (SDS), tillgängligt från produktleverantören, för mer information. Etanol ( %) Pipetter* och pipettspetsar (det rekommenderas att pipettspetsar med aerosolbarriärer används för att undvika korskontamination) Engångshandskar Värmeblock* för lysering av prov vid 56 C (Eppendorf Thermomixer med termoblock för mikroprovrör på 2,0 ml rekommenderas) Mikrocentrifug* Mätcylinder (50 ml) Vortexblandare QIAvac 24 Plus-vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, katalognr 19413, QIAvac Connecting System, katalognr och Vacuum Pump, katalognr 84020) eller motsvarande vanligt laboratorievakuumsystem * För att säkerställa att proverna bearbetas ordentligt under processerna i QIAamp DSPvirusproceduren rekommenderar vi starkt att instrumenten (t.ex. pipetter och värmeblock) kalibreras i enlighet med tillverkarnas rekommendationer. Detta är ingen fullständig lista över leverantörer och inkluderar därför inte alla viktiga tillverkare av biologiska produkter. Tillgänglig i mitten av 2004; se 16 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

17 Viktiga anmärkningar Viktigt att tänka på före start Kontrollera efter mottagande att kitkomponenterna inte är skadade. Om blisterförpackningar eller buffertflaskor är skadade ska du kontakta QIAGENS tekniska service eller den lokala distributören. I händelse av vätskespill, se Varningar och försiktighet (sidan 8). Använd inte skadade kitkomponenter eftersom det kan leda till dålig kitprestanda. Använd alltid utrustning som är fri från RNas. Förvara etanol ( %) på is under proceduren. Byt alltid pipettspetsar mellan vätskeöverföringar. Användning av pipettspetsar med aerosolbarriärer rekommenderas för att undvika korskontamination. Alla centrifugeringssteg utförs i rumstemperatur (15 25 C). Använd alltid engångshandskar och kontrollera regelbundet att de inte kontaminerats av provmaterial. Kasta handskar om de blir kontaminerade, och som minst vid alla steg som är markerade med en handsksymbol. Öppna endast ett rör åt gången för att undvika korskontamination. Använd inte kitkomponenter från andra kit med det kit som för närvarande används såvida inte lotnumren är identiska. Undvik mikrobiell kontamination av kitreagenser. Arbete under laminära luftflödesförhållanden rekommenderas tills proverna har lyserats för att undvika kontamination från potentiellt smittsamma material. Detta kit ska endast användas av personal utbildad i in vitro-diagnostisk laboratoriepraxis. Proceduren ger anvisningar för bearbetning av ett enstaka plasma- eller serumprov. Upp till 24 prov kan emellertid bearbetas åt gången med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

18 Bereda RNA Vid beredning av viralt RNA ska du genomföra de manuella stegen i processen snabbt. Elueringsbuffert (AVE) innehåller natriumazid*, ett antimikrobiellt medel som förhindrar tillväxt av RNas-producerande organismer. Eftersom denna buffert inte innehåller några RNas-nedbrytande kemikalier, kan den dock inte aktivt hämma RNaser som introducerats genom olämplig hantering. Extrem försiktighet ska vidtas för att undvika kontamination med RNaser vid hantering av elueringsbuffert (AVE). Förvara prover Efter provtagning och centrifugering kan plasma eller serum förvaras vid 2 8 C i upp till 6 timmar. För långvarig förvaring rekommenderas frysning vid 20 C eller 80 C i alikvoter. Frysta plasma- eller serumprover får inte tinas upp mer än en gång. Upprepad infrysning-upptining leder till denaturering och utfällning av proteiner, vilket kan resultera i minskade virala titrar och därmed minskat utbyte av virala nukleinsyror. Dessutom kan frystorkningsutfällningar som bildas under frysning-upptining sätta igen membranet i QIAamp MinElutekolonnen. Om frystorkningsutfällningar är synliga ska de pelleteras genom centrifugering vid cirka x g i 3 minuter. Den klarnade supernatanten ska aspireras och bearbetas omedelbart utan att pelleten rubbas. Förbereda reagenser och buffertar Förbereda QIAGEN Protease Tillsätt hela innehållet i flaskan med 4,4 ml proteaslösningsmedel (PS) till flaskan med frystorkad QIAGEN Protease (QP) och blanda noga. För att undvika bubblor ska du blanda genom att vända flaskan flera gånger. Se till att QIAGEN Protease (QP) är fullständigt upplöst. Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till lyseringsbuffert (AL). * Bär alltid laboratorierock, skyddshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. 18 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

19 Tillsätta bärar-rna och intern kontroll till lyseringsbuffert Bärar-RNA har två funktioner. För det första förbättrar det bindningen av virala nukleinsyror till QIAamp MinElute-kolonnmembranet, särskilt om det är mycket få målmolekyler i provet. För det andra minskar tillsatsen av stora mängder bärar-rna risken för viral RNA-nedbrytning om RNas-molekylerna i sällsynta fall inte skulle denatureras av de kaotropiska salterna och rengöringsmedlet i lyseringsbufferten (AL). Om bärar-rna inte tillsätts till lyseringsbuffert (AL) kan detta leda till minskad återhämtning av viralt RNA eller DNA. Bärar-RNA kan även ingå i vissa reagenser för intern kontroll i kommersiella nedströmsanalyser. I dessa fall hänvisas till de relevanta bruksanvisningarna från tillverkaren av nedströmsanalysen. Användning av en intern kontroll rekommenderas starkt när QIAamp DSP Virus Kit används i kombination med diagnostiska amplifieringssystem. Intern kontroll-rna eller -DNA och rekonstituerat bärar-rna ska tillsättas till lyseringsbuffert (AL) och blandas noga genom att röret vänds 10 gånger. Använd inte vortex för att undvika skumbildning. Se tillverkarens anvisningar för att bestämma den optimala koncentrationen av intern kontroll. Om en annan koncentration än den rekommenderade används kan det ge felaktiga resultat. Vid beräkning av den korrekta mängden av intern kontroll som ska användas, måste du ta hänsyn till provets startvolym och elueringsvolymen. Kom ihåg att QIAamp DSP Virus Kit använder en startprovvolym på 500 µl. Bered lösningen med bärar-rna genom att tillsätta 310 µl elueringsbuffert (AVE) till röret som innehåller 310 µg frystorkat bärar-rna för att erhålla en lösning på 1 µg/µl. Lös upp bärar-rna noga, dela upp det i alikvoter av lämplig storlek, och förvara dem vid 20 C. Alikvoter av bärar-rna får inte frysas-tinas mer än 2 gånger. Observera att bärar-rna inte löses upp i lyseringsbuffert (AL). Det måste först lösas upp i elueringsbuffert (AVE), och därefter tillsättas till lyseringsbuffert (AL). Kontrollera att bärar-rna är helt upplöst i rätt volym av elueringsbuffert (AVE) innan du blandar det med lyseringsbuffert (AL). Använd alltid rätt intern kontroll för nedströmsanalysen. Se tillverkarens anvisningar för mer information. Beräkna den volym av blandningen lyseringsbuffert (AL) och bärar-rna som behövs per provbatch genom att välja antalet prover som ska bearbetas samtidigt i tabell 4 (sidan 20). Volymer beräknas på följande sätt: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl där: n= antalet prover som ska bearbetas samtidigt Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

20 y= beräknad volym lyseringsbuffert (AL) z = volym bärar-rna/elueringsbuffert (AVE) som ska tillsättas till lyseringsbuffert (AL) Tabell 4. Volymer av lyseringsbuffert (AL) och bärar- RNA/elueringsbuffert (AVE) som krävs för QIAamp DSP-virusproceduren Antal prover Vol. AL (ml) Vol. bärar- RNA/AVE (µl) Antal prover Vol. AL (ml) Vol. bärar- RNA/AVE (µl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43, ,45 117,0 8 4,40 49, ,00 123,2 9 4,95 55, ,55 129,4 10 5,50 61, ,10 135,5 11 6,05 67, ,65 141,7 12 6,60 73, ,20 147,8 Bereda tvättbuffert 1 Använd en mätcylinder och tillsätt 25 ml etanol ( %) till flaskan med 19 ml koncentrat av tvättbuffert 1 (AW1). Förvara rekonstituerad tvättbuffert 1 (AW1) i rumstemperatur (15 25 C). Blanda alltid rekonstituerad tvättbuffert 1 (AW1) genom att vända flaskan flera gånger innan proceduren startas. Bereda tvättbuffert 2 Använd en mätcylinder och tillsätt 30 ml etanol ( %) till flaskan med 13 ml koncentrat av tvättbuffert 2 (AW2). Förvara rekonstituerad tvättbuffert 2 (AW2) i rumstemperatur (15 25 C). 20 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

21 Blanda alltid rekonstituerad tvättbuffert 2 (AW2) genom att vända flaskan flera gånger innan proceduren startas. Bereda elueringsbuffert Fyra rör med elueringsbuffert (AVE) medföljer i kitet. Var försiktig så att inte bufferten kontamineras med RNaser. Om du ska utföra 4 reningsprocedurer eller mindre med ett enstaka kit, rekommenderar vi att du kasserar röret med elueringsbuffert (AVE) när proceduren är klar. Eluera virala nukleinsyror För nedströmsapplikationer som kräver små startvolymer (t.ex. vissa PCR- och RT-PCR-analyser) kan användning av virala nukleinsyror som eluerats i 20 µl elueringsbuffert (AVE) öka analysens känslighet. Volymen av virala nukleinsyror som eluerats från en QIAamp MinElute-kolonn kan vara upp till 5 µl mindre än volymen av elueringsbuffert (AVE) som tillsatts i kolonnen. Om du t.ex. eluerar virala nukleinsyror med 60 µl elueringsbuffert (AVE) får du ett eluat på cirka 55 µl, medan eluering med 20 µl ger ett eluat på cirka 15 µl. Återvunnen volym av eluatet beror på provets natur. Om den återvunna eluatvolymen är för liten för nedströmsanalysen ökar du volymen genom att tillsätta mer elueringsbuffert (AVE). Eluerade virala nukleinsyror samlas upp i elueringsrör (ET). Om de virala nukleinsyrorna ska förvaras i upp till 24 timmar rekommenderar vi förvaring vid 2 8 C. Utbyte av och kvalitet på virala nukleinsyror Utbytet av och kvaliteten på de isolerade virala nukleinsyrorna är lämpliga för alla typer av nedströmsdetektionsmetoder i molekylär diagnostik. Diagnostiska analyser bör utföras i enlighet med tillverkarnas anvisningar. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

22 Montera vakuumsystemet QIAvac 24 Plus Försäkra dig om att du monterar kolonnförlängaren (EXT), QIAamp MinElutekolonnen, VacConnector (VC) och VacValve på rätt sätt (se figur 3). Figur 3. Montering av komponenterna i QIAamp DSP Virus Kit för vakuumbearbetning av prov: 1: VacValve (tillhandahålls med vakuumsystemet) 3: QIAamp MinElute-kolonn 2: VacConnector (VC) 4: Kolonnförlängare (EXT) Vi rekommenderar att lyseringsrören (LT), elueringsrören (ET) och QIAamp MinElute-kolonner som används på vakuumsystemet QIAvac 24 Plus märks enligt schemat i figur 4 för att undvika sammanblandning av prov. Detta schema kan fotokopieras och märkas med provnamn. 22 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

23 Datum: Operatör: Kör-ID: Figur 4. Märkningsschema för lyseringsrör (LT), elueringsrör (ET) och QIAamp MinElutekolonner för användning med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

24 24 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

25 Protokoll: Isolering och rening av virala nukleinsyror från plasma och serum För isolering och rening av virala nukleinsyror från 500 µl av EDTA- eller citratbehandlad plasma och serum. Åtgärder som ska utföras före start Låt proven få rumstemperatur (15 25 C) och se till att de är väl blandade. Tillsätt bärar-rna som har rekonstituerats i elueringsbuffert (AVE) eller intern kontroll till lyseringsbuffert (AL), enligt anvisningarna på sidan 19. Se till att tvättbuffert 1 (AW1), tvättbuffert 2 (AW2) och QIAGEN Protease (QP) har förberetts i enlighet med anvisningarna i Viktiga anmärkningar på sidan 17. Låt elueringsbuffert (AVE) få rumstemperatur (15 25 C) för användning i steg 18. Använd om möjligt färsk elueringsbuffert (AVE) för varje procedur (4 rör medföljer). Ställ in ett värmeblock på 56 C för användning i steg 4 och 17. För in en VacConnector (VC) i varje lueradapter i vakuumsystemet för att undvika korskontamination. Se till att avfallsflaskan för vakuumsystemet är tom och att alla anslutningar är korrekta. Se den medföljande handboken för information om vakuumsystemets funktion, särskilt underhåll. Procedur 1. Pipettera 75 µl QIAGEN Protease (QP) i ett lyseringsrör (LT). Kontrollera utgångsdatumet för det rekonstituerade proteaset före användning. 2. Tillsätt 500 µl plasma eller serum till lyseringsröret (LT). Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

26 3. Tillsätt 500 μl lyseringsbuffert (AL) (inneh ållande µg/ml bärar- 11,2 RNA) till lyseringsröret (LT), stäng locket och blanda med pulsvortexblandning i 15 sek. Det är viktigt att prov och lyseringsbuffert (AL) blandas noggrant för att garantera effektiv lysering och ge en homogen lösning. Lyseringsbuffert (AL) innehåller intern kontroll. Se till att korrekt volym av lyseringsbuffert (AL) tillsätts genom försiktig pipettering eller genom användning av en lämplig pipett som Eppendorfs flerstegspipett eller motsvarande eftersom lyseringsbuffert (AL) har hög viskositet. Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till lyseringsbuffert (AL). 4. Inkubera vid 56 C (±1 C) i 15 min (±1 min). 5. Centrifugera lyseringsröret (LT) i 5 sek. med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 6. Byt handskar och öppna lyseringsröret (LT) försiktigt. 7. Tillsätt 600 μl etanol ( %) till lyseringsröret (LT), stäng locket och blanda noggrant med pulserande vortexblandning i 15 sek. Inkubera i 5 min. (±1 min.) vid rumstemperatur (15 25 C). 8. Centrifugera lyseringsröret (LT) i 5 sek. med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 9. För in QIAamp MinElute-kolonnen i VacConnector (VC) på vakuumsystemet (se figur 3, sidan 22). För in en kolonnförlängare (EXT) i den öppna QIAamp MinElute-kolonnen. Behåll tvättröret (WT) för torrcentrifugeringen i steg Byt handskar och öppna bara ett rör i taget. 11. Applicera försiktigt hela lysatet från steg 7 i kolonnförlängaren (EXT) på QIAamp MinElute-kolonnen utan att väta kanten. Undvik att vidröra QIAamp MinElute-kolonnens membran med pipettspetsen. 26 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

27 12. Sätt igång vakuumpumpen. Efter att lysatet har transporterats igenom QIAamp MinElute-kolonnen ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. Om flera QIAamp MinElute-kolonner bearbetas samtidigt rekommenderas att VacValve för varje kolonn stängs efter att lysatet har passerat för att minska tiden för detta vakuumsteg. Om lysatet inte helt har passerat genom membranet efter 15 min, ska QIAamp MinElute-kolonnen kasseras och proceduren ska upprepas med ett nytt prov. Vakuumsystemets ventil ska användas för snabb utjämning av vakuumtrycket. 13. Tillsätt 600 µl tvättbuffert 1 (AW1) i QIAamp MinElute-kolonnen. Ta försiktigt bort och kassera kolonnförlängaren (EXT) och stäng vakuumsystemets ventil. När tvättbuffert 1 (AW1) har transporterats igenom QIAamp MinElute-kolonnen ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. För att undvika korskontamination måste du se till att borttagna kolonnförlängare (EXT) inte passerar över angränsande QIAamp MinElutekolonner. 14. Tillsätt 750 µl tvättbuffert 2 (AW2) i QIAamp MinElute-kolonnen utan att väta kanten. Undvik att vidröra QIAamp MinElute-kolonnens membran med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. När tvättbuffert 2 (AW2) har transporterats igenom QIAamp MinElute-kolonnen ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. 15. Tillsätt 750 µl etanol ( %) i QIAamp MinElute-kolonnen utan att väta kanten. Undvik att vidröra QIAamp MinElute-kolonnens membran med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. När etanolet har transporterats igenom QIAamp MinElute-kolonnen ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. Använd pipettspetsar med aerosolbarriär när du tillsätter etanol i QIAamp MinElute-kolonnen. Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/

28 16. Stäng locket på QIAamp MinElute-kolonnen, ta bort den från vakuumsystemet och kasta VacConnector (VC). Placera QIAamp MinElute-kolonnen i tvättröret (WT) som sparats från steg 9 och centrifugera med maximal hastighet (cirka x g eller rpm) i 1 minut för att fullständigt torka membranet. Kassera det tvättrör (WT) som innehåller filtratet. Uteslutning av torrcentrifugeringen kan leda till inhibering av efterföljande analys. 17. Placera QIAamp MinElute-kolonnen i ett nytt tvättrör (WT) och inkubera med locket öppet vid 56 C i 3 min. för att eventuell återstående vätska ska avdunsta. 18. Placera QIAamp MinElute-kolonnen i ett rent elueringsrör (ET) och kasta tvättröret (WT). Öppna försiktigt locket på QIAamp MinElutekolonnen och tillsätt 20 µl eller 60 µl elueringsbuffert (AVE) (beroende på nedströmsanalysen) i mitten av membranet. Stäng locket och inkubera vid rumstemperatur (15 25 C) i 3 min. Centrifugera med full hastighet (cirka x g, eller rpm) i 1 min. för att eluera de virala nukleinsyrorna. Följ underhållsproceduren för vakuumsystemet när protokollet har utförts (se handboken som medföljer vakuumsystemet för mer information). 28 Handbok till QIAamp DSP Virus Kit 11/2016

29

30 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) /2016 Sample & Assay Technologies