QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok

Transkript

1 januari 2004 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok IVD Σ 50 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit är ett allmänt system som använder QIAamp-teknologi för manuell isolering och rening av genomiskt DNA från humana helblodsprov för in vitro-diagnostiska ändamål. Kitet är inte till för användning med vävnads- eller faecesprov. Kitet är inte heller till för isolering och rening av nukleinsyror från bakterier, svampar eller parasiter och inte heller för isolering och rening av RNA. Kitets prestanda för isolering och rening av viralt DNA har inte utvärderats. Kitprestanda har inte heller utvärderats för buffycoat, odlade eller isolerade celler, prov tagna med provtagningspinne, torkade blodfläckar eller cellfria kroppsvätskor som likvor, plasma och urin. För in vitro-diagnostisk användning REF H B /2004 QIAGEN GmbH, D Hilden, Tel:

2 Varumärken: QIAGEN, QIAamp, QIAvac (QIAGEN-koncernen); BD Vacutainer (Becton, Dickinson & Co); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH); Monovette (Sarstedt AG & Co.); Vacuette (Greiner Bio-One). Registrerade namn, varumärken, etc, som används i detta dokument, även om de inte angetts som sådana, ska inte anses som oskyddade i lag. PCR-processen täcks av de amerikanska patenten 4,683,195 och 4,683,202 och motsvarande utländska som ägs av Hoffmann-La Roche AG QIAGEN, alla rättigheter förbehållna. 2 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

3 Innehåll Kitinnehåll 4 Symboler 5 Förvaring 6 Kvalitetskontroll 6 Avsedd användning 6 Begränsningar för produktanvändning 6 Säkerhetsinformation 7 Inledning 9 Princip och utförande 9 Utrustning och reagenser som tillhandahålls av användaren 14 Viktiga anmärkningar 15 Viktiga moment före start av protokoll 15 Förberedning av reagenser och buffertar 15 Eluering av genomiskt DNA 16 Utbyte av och kvalitet på genomiskt DNA 16 Montering av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus 17 Protokoll Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med ett vakuumsystem 20 Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med en mikrocentrifug 23 QIAGEN-distributörer 27 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 3

4 Kitinnehåll QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Katalognr Antal provpreparat 50 QIAamp Mini QIAamp Mini Spin Columns COL 50 Spin med Wash Tubes (WT) (2 ml) ET Elution Tubes (1,5 ml) ELU TUBE 50 VC VacConnectors VAC CON 50 LT Lysis Tubes (1,5 ml) LYS TUBE 50 WT Wash Tubes (2 ml) WASH TUBE 3 x 50 AL Lysis Buffer* LYS BUF 12 ml AW1 Wash Buffer 1* (koncentrerad) WASH BUF 1 CONC 19 ml AW2 Wash Buffer 2 (koncentrerad) WASH BUF 2 CONC 13 ml AE Elution Buffer ELU BUF 25 ml PS Protease Solvent QPROT SOLV 2 ml QP QIAGEN Protease QPROT 1 vial CD H B 1 Handbook H B 1 * Innehåller guanidinhydroklorid. Inte kompatibel med desinfektionsmedel med blekmedel. För mer information, se sid. 7. Innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Resuspensionsvolym 1,2 ml. 4 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

5 Symboler Σ 50 IVD REF LOT MAT COMP VOL i Kitet innehåller reagens för 50 provpreparat Se information i handboken Använd före Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialnummer Komponenter Volym Temperaturbegränsningar Laglig tillverkare Vid ankomst Viktig anmärkning Byt handskar efter protokollsteg med denna markering Öppna vid leverans. Förvara QIAamp Spin Columns vid 2-8 C ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Skriv ner aktuellt datum efter tillsats av etanol i flaskan Tillsätta Innehåller Frystorkad Rekonstituera Etanol Guanidinhydroklorid Subtilisin Leder till QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 5

6 Förvaring QIAamp Mini Spin Columns bör förvaras vid 2-8 C vid ankomst. Alla buffertar kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C). Frystorkat QIAGEN Protease (QP) kan förvaras i rumstemperatur (15-25 C) i upp till två år utan prestandaförsämring. Rekonstituerat QIAGEN Protease (QP) är stabilt i ett år med förvaring vid 2-8 C. Rekonstituerad Wash Buffer 1 (AW1) och rekonstituerad Wash Buffer 2 (AW2) är stabila i ett år med förvaring i rumstemperatur (15-25 C). Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGENs certifierade totala kvalitetshanteringssystem testas varje batch QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit mot förbestämda specifikationer för att garantera konstant produktkvalitet. Avsedd användning QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit är ett allmänt system som använder QIAampteknologi för manuell isolering och rening av genomiskt DNA från humana helblodsprov för in vitro-diagnostiska ändamål. Färskt eller fryst humant helblod behandlat med EDTA eller citrat, men inte heparin, från vanliga blodtagningssystem kan användas som prov. Produkten är avsedd för användning av professionella användare som laboratoriepersonal och läkare utbildade i molekylärbiologiska tekniker. Den är utformad för användning med efterföljande applikation som använder enzymatisk amplifiering eller annan enzymatisk modifiering av DNA följt av signaldetektion eller amplifiering. Ett diagnostiskt resultat genererat med provförberedningsmetoden tillsammans med en efterföljande diagnostisk analys bör tolkas med hänsyn tagen till andra kliniska undersökningar eller laboratorieundersökningar. För att minimera oregelbundenheter i diagnostiska resultat bör lämpliga kontroller användas för efterföljande applikationer. Begränsningar för produktanvändning Kitet är inte till för användning med vävnads- eller faecesprov. Kitet är inte heller till för isolering och rening av nukleinsyror från bakterier, svampar eller parasiter och inte heller för isolering och rening av RNA. Kitets prestanda för isolering och rening av viralt DNA har inte utvärderats. Kitprestanda har inte heller utvärderats för buffycoat, odlade eller isolerade celler, prov tagna med provtagningspinne, torkade blodfläckar eller cellfria kroppsvätskor som likvor, plasma och urin. 6 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

7 Säkerhetsinformation Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt materialsäkerhetsdatablad (MSDS) för mer information. Dessa finns online i behändigt och kompakt pdf-format på hemsidan där man kan hitta, titta på och skriva ut MSDS för varje QIAGEN-kit och kitkomponent. VARNING: Tillsätt INTE blekmedel eller sura lösningar direkt till provprepareringsavfall. Lysis Buffer (AL) och Wash Buffer 1 (AW1) innehåller guanidinhydroklorid som kan bilda mycket reaktiva föreningar i kombination med blekmedel. Om vätska med dessa buffertar spills ut ska den torkas upp med lämpliga laboratorierengöringsmedel och vatten. Om den spillda vätskan innehåller potentiellt smittsamma ämnen ska ytorna först rengöras med laboratorie rengöringsmedel och vatten och därefter med 1 % (v/v) natriumhypoklorit. Om buffertflaskorna är skadade eller läcker ska man använda handskar och skyddsglasögon när flaskorna kastas för att undvika personlig skada eller skada på andra. QIAGEN har inte testat det flytande avfall som genereras av metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini efter smittsammt restmaterial. Kontamination av det flytande avfallet med smittsammt restmaterial är mycket osannolikt men kan inte fullständigt uteslutas. Därför måste det flytande avfallet anses vara smittsamt och ska hanteras och kastas i enlighet med lokala säkerhetsbestämmelser. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 7

8 Följande risk- och säkerhetsfraser tillämpas på komponenterna i QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit: Lysis Buffer (AL) och Wash Buffer 1 (AW1) Innehåller guanidinhydroklorid: hälsoskadlig, irriterande. Risk- och säkerhetsfraser:* R22-36/38, S QIAGEN Protease (QP) Innehåller subtilisin: sensibiliserande, irriterande. Risk- och säkerhetsfraser:* R37/ , S /37/ timmars nödsituationsinformation Medicinsk nödsituationsinformation på engelska, franska och tyska kan erhållas 24 timmar om dygnet från: Giftinformationscentral Mainz, Tyskland Tel: * R22: Hälsoskadlig vid förtäring, R36/38: Irriterande för ögon och hud, R37/38: Irriterande för andningssystem och hud, R41: Risk för allvarlig ögonskada, R42: Kan orsaka sensibilisering vid inandning, S13: Förvara ej i närheten av livsmedel, dryckesvaror och djurfoder, S22: Andas inte in damm, S24: Undvik hudkontakt, S26: I fall av ögonkontakt, spola omedelbart med mycket vatten och uppsök läkare, S36: Använd lämplig skyddsklädsel, S36/37/39: Använd lämplig skyddsklädsel, handskar och ögon/ansiktsskydd, S46: Vid förtäring, uppsök läkare omedelbart och visa denna behållare eller etikett. 8 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

9 Inledning QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit använder väletablerad teknologi för att ge ett snabbt och lätt sätt att isolera och rena genomiskt DNA från 200 µl helblodsprov. Renat DNA fungerar pålitligt i efterföljande applikationer som PCR. De enkla metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini, som är avsedda för simultan bearbetning av flera blodprov, ger bruksfärdigt rent DNA. Metoderna är lämpliga för användning med färskt eller fryst helblod och blod som behandlats med citrat eller EDTA. Förseparation av leukocyter är inte nödvändigt. Metoderna kräver varken extraktion med fenol/kloroform eller fällning med alkohol och kräver minimal interaktion av användaren, vilket ger säker hantering av potentiellt smittsamma prov. Metoderna är utformade för att undvika korskontamination från prov till prov. Renat DNA är bruksfärdigt för PCR eller andra applikationer eller alternativt förvaring vid -20 C för senare användning. Princip och utförande Varje metod med QIAamp DSP DNA Blood Mini utgör fyra steg: Lysering av celler i blodprovet Bindning av genomiskt DNA i cellysatet till membranet i en QIAamp Mini Spin Column Tvättning av membranet Eluering av genomiskt DNA från membranet Denna handbok innehåller protokoll för två alternativa metoder med QIAamp DSP DNA Blood Mini: spinnmetoden som kräver en centrifug och vakuummetoden som kräver en centrifug och ett vakuumsystem (se flödesschema, sida 13). Prov Efter provtagning kan blodproven förvaras i rumstemperatur (15-25 C) i upp till sex timmar eller vid 2-8 C i upp till 24 timmar. För långtidsförvaring rekommenderas nedfrysning av prov vid -20 C eller -80 C. Kryofällningar som bildas vid upptining av frysta prov kommer att täppa till membranet i QIAamp Mini Spin Column. Om kryofällningar är synliga undvik att aspirera dem vid aspiration av provet. Effekterna av nedfrysning och upptining av blodprov på DNA-rening med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit har fastställts (figur 1). QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004 9

10 Nedfrysnings-/upptiningscyklers påverkan på DNA-utbyte från blod behandlat med EDTA 125 Utbyte normaliserat till färskt prov (%) Färskt Antal nedfrysnings-/upptiningscykler Figur 1 Blod behandlat med EDTA frystes och tinades upp till tre gånger och genomgick därefter rening av DNA med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Det beräknade DNA-utbytet är normaliserat till utbytet av färskt prov (100 %). Varje stapel i grafen representerar resultat från 32 replikat (medelvärde ± standardavvikelse). Mängden renat DNA i metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini beror på innehållet av vita blodkroppar i varje blodprov. Med spinn- eller vakuummetoden renas genomiskt DNA från 200 µl blodprov från friska givare. Flera olika primärrör och antikoagulanter kan användas för att ta blodprov för metoderna med QIAamp DSP DNA Blood Mini (tabell 1). Tabell 1. Relativa medelutbyten av DNA från blodprov tagna med olika primärrör och antikoagulanter Nominell Medelut- Primärrör Tillverkare Art. nr volym byte* BD Vacutainer 9NC BD ml 6,4 µg BD Vacutainer K3E BD ml 6,6 µg BD Vacutainer K2E BD ml 6,4 µg S-Monovette EDTA Sarstedt ml 6,5 µg S-Monovette CPDA1 Sarstedt ml 6,3 µg Vacuette K3E Greiner ml 6,5 µg Bio-One Vacuette 9NC Greiner ml 6,3 µg Bio-One * För varje primärrör bestäms medelutbytet från 11 triplikatprov. 10 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

11 Det linjära intervallet för DNA-utbyte med QIAamp DSP DNA Blood Minis vakuummetod har fastställts för blod från friska givare med vita blodkroppar på 3,8 x 106-1,34 x 107 celler/ml (figur 2). Det linjära intervallet för DNA-utbyte med QIAamp DSP DNA Blood Minis vakuummetod vid 200 µl elueringsvolym Utbyte (µg/sample) Figur 2 Antalet vita blodkroppar från friska givare fastställdes i intervallet 3,8 x 106-1,34 x 107 celler/ml. DNA renades från blodprov med vakuummetoden för QIAamp DSP DNA Blood Mini med 200 µl elueringsvolym. 87 triplikatprov bearbetades. Lysering av blodkroppar Prov lyseras under denatureringsförhållanden vid förhöjda temperaturer. Lysering utförs i närvaro av QIAGEN Protease (QP) och Lysis Buffer (AL). Bindning av genomiskt DNA till membranet i QIAamp Mini Spin Column För att optimera bindningen av genomiskt DNA till membranet i QIAamp Mini Spin Column tillsätts först etanol till lysatet. Varje lysat appliceras därefter till en QIAamp Mini Spin Column och genomiskt DNA adsorberas på kiselgelmembranet när lysatet transporteras igenom med vakuumtryck eller centrifugalkraft. Avlägsnande av restkontaminanter Medan genomiskt DNA kvarstår som bundet till membranet i QIAamp Mini Spin Column tvättas kontaminanter effektivt bort med hjälp av först Wash Buffer 1 (AW1) och därefter Wash Buffer 2 (AW2). QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

12 Eluering av rent genomiskt DNA Genomiskt DNA elueras från membranet i QIAamp Mini Spin Column med µl Elution Buffer (AE). Eluerat DNA är bruksfärdigt för olika efterföljande analyser. Effekterna av elueringsvolym och eluatvolym som används i PCR på PCR-prestanda har fastställts (tabell 2). Tabell 2. Effekterna av elueringsvolym och eluatvolym som används i PCR på PCRprestanda Eluatvolym per 50 µl PCR* Elueringsvolym 2 µl 5 µl 10 µl 50 µl 100 % 100 % 100 % 100 µl 100 % 100 % 97 % 200 µl 100 % 100 % 100 % * Värdena visar andelen PCR-träffar och representerar medelvärdet av 48 prov. I förvaringstest med eluat som genererats med QIAamp DNA Blood Mini Kit, ett kit för allmän laboratorieanvändning och med identisk teknologi, visades att DNA som eluerats från QIAamp Mini Spin Columns i buffert AE var stabila i åtta år med förvaring vid antingen 5 C eller -20 C (figur 3). Emellertid pågår långtidsundersökningar om stabiliteten för eluat som erhållits med QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Långtidsstabilitet för DNA isolerat och renat med QIAamp Mini Spin Columns M 2 8 C 20 C M Figur 3 DNA renades med QIAamp DNA Blood Mini Kit, eluerat i 200 µl buffert AE och förvarat vid antingen 2-8 C eller -20 C i åtta år. DNA-prov analyserades på en etidiumbromid-färgad agarosgel. M: markör. 12 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

13 QIAamp DSP DNA Blood Mini-metoder Läs protokollen (sidan 20 och 23) noggrant före start Tillsätt 20 µl QP, 200 µl prov och 200 µl AL i LT Vortexblanda i 15 s Inkubera i 10 min (± 1 min) vid 56 C (± 1 C) Tillsätt 200 µl etanol Vortexblanda i 15 s Överför lysat till QIAamp Mini Spin Column Spinnmetod: centrifugera 1 min vid cirka 6000 x g Vakuummetod: applicera vakuum Spinnmetod: placera QIAamp Mini Spin Column i ny WT, tillsätt 500 µl AW1 och centrifugera 1 min vid cirka x g Vakuummetod: tillsätt 750 µl AW1 och applicera vakuum Spinnmetod: placera QIAamp Mini Spin Column i ny WT, tillsätt 500 µl AW2 och centrifugera 1 min vid cirka x g Vakuummetod: tillsätt 750 µl AW2 och applicera vakuum Placera QIAamp Mini Spin Column i WT Centrifugera 3 min vid cirka x g Placera QIAamp Mini Spin Column i ET Tillsätt µl AE och inkubera 1 min Centrifugera 1 min vid cirka x g QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

14 Utrustning och reagenser som ska tillhandahållas av användaren Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt materialsäkerhetsdatablad (MSDS) tillgängligt från produktleverantören för mer information. För spinn- och vakuummetoderna Etanol ( %) Pipetter* och pipettspetsar (det rekommenderas att pipettspetsar med aerosolbarriärer används för att undvika korskontamination) Engångshandskar Värmeblock* för lysering av prov vid 56 C (Eppendorf Thermomixer med termoblock för mikroprovrör på 1,5 ml rekommenderas) Mikrocentrifug* Mätcylinder (50 ml) Vortexblandare Endast för vakuummetod QIAvac 24 Plus-vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr 19413, QIAvac Connecting System, kat.nr och Vacuum Pump, kat.nr 84020) eller motsvarande allmänt laboratorievakuumsystem * För att garantera att prover bearbetas korrekt i QIAamp DSP DNA Blood Mini-metoderna rekommenderas att instrument (t.ex. pipetter och värmeblock) kalibreras i enlighet med tillverkarnas. Detta är ingen fullständig lista över leverantörer och inkluderar därför inte alla viktiga tillverkare av biologiprodukter. 14 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

15 Viktiga anmärkningar Viktiga moment före start av protokoll Kontrollera kitkomponenterna för möjlig skada efter mottagande av kitet. Om blisterförpackningar eller buffertflaskor är skadade, kontakta QIAGENs tekniska service eller den lokala distributören. I händelse av vätskespill, se Säkerhetsinformation (sida 7). Använd inte skadade kitkomponenter eftersom det kan leda till dålig kitprestanda. Byt alltid pipettspetsar mellan vätskeöverföringar. Användning av pipettspetsar med aerosolbarriärer rekommenderas för att undvika korskontamination. Alla centrifugeringssteg utförs i rumstemperatur (15-25 C). Använd alltid engångshandskar och kontrollera regelbundet att de inte kontaminerats av provmaterial. Kasta handskar om de blir kontaminerade. Öppna endast ett rör åt gången för att undvika korskontamination. Använd inte kitkomponenter från andra kit med kitet som för närvarande används såvida inte batchnumren är identiska. Undvik mikrobiell kontamination av kitreagenser. Arbete under laminära luftflödesförhållanden rekommenderas tills proverna har lyserats för att undvika kontamination från potentiellt smittsamma material. Detta kit bör endast användas av personal utbildad i in vitro-diagnostisk laboratoriepraxis. Förberedning av reagenser och buffertar Förberedning av QIAGEN Protease Tillsätt 1,2 ml Protease Solvent (PS) till vialen med frystorkat QIAGEN Protease (QP) och blanda noggrant. För att undvika bubblor blanda genom att vända vialen upp och ned flera gånger. Se till att QIAGEN Protease (QP) är fullständigt upplöst. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). Förberedning av Wash Buffer 1 Använd en mätcylinder och tillsätt 25 ml etanol ( %) till flaskan med 19 ml koncentrat av Wash Buffer 1 (AW1). Förvara den rekonstituerade Wash Buffer 1 (AW1) i rumstemperatur (15-25 C). i Blanda alltid den rekonstituerade Wash Buffer 1 (AW1) genom att vända upp och ned på flaskan flera gånger innan proceduren startas. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

16 Förberedning av Wash Buffer 2 Använd en mätcylinder och tillsätt 30 ml etanol ( %) till flaskan med 13 ml koncentrat av Wash Buffer 2 (AW2). Förvara den rekonstituerade Wash Buffer 2 (AW2) i rumstemperatur (15-25 C). i Blanda alltid den rekonstituerade Wash Buffer 2 (AW2) genom att vända upp och ned på flaskan flera gånger innan proceduren startas. Förberedning av Elution Buffer En flaska Elution Buffer (AE) tillhandahålls med kitet. Det rekommenderas att pipettspetsar med aerosolbarriärer används när Elution Buffer (AE) pipetteras från flaskan och att locket på flaskan omedelbart sätts på igen för att undvika kontamination. Förvara vid 2-8 C efter att en flaska Elution Buffer (AE) använts för första gången. Låt Elution Buffer (AE) anta rumstemperatur (15-25 C) före varje användning. i Elution Buffer (AE) innehåller konserveringsmedlet natriumazid som visar absorbans vid 260 nm. Därför ska man se till att blankprovet innehåller samma koncentration av natriumazid som eluatet när man kvantifierar DNA i eluatet med absorbansmätningar vid 260 nm, när man bestämmer renheten av DNA i eluatet med absorbansmätningar vid 260 nm och 280 nm eller när absorbans skannas i intervallet nm. Om till exempel eluatet förbereds för absorbansmätningar med spädning av 50 µl eluat med 100 µl vatten, bör man förbereda blankprovet genom att späda 50 µl Elution Buffer (AE) med 100 µl vatten. Använd färskt destillerat vatten för spädningar. Eluering av genomiskt DNA Volymen av DNA eluerat från en QIAamp Mini Spin Column kan vara upp till 20 µl mindre än volymen av Elution Buffer (AE) som applicerats till kolonnen. Utbytesvolymen av eluatet beror på provets natur. Elution Buffer (AE) bör komma i jämvikt till rumstemperatur (15-25 C) innan den appliceras till kolonnen. Eluerat DNA samlas in i Elution Tubes (ET). Om DNA förvaras i upp till fyra veckor rekommenderas förvaring vid 2-8 C. För långtidsförvaring rekommenderas förvaring vid -20 C. Utbyte av och kvalitet på genomiskt DNA Utbytet av och kvalitet på isolerat genomiskt DNA är lämpligt för alla typer av efterföljande detektionsmetoder i molekylär diagnostik. Diagnostiska analyser bör utföras i enlighet med tillverkarnas anvisningar. 16 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

17 Montering av vakuumsystemet QIAvac 24 Plus Se till att QIAamp Mini Spin Column, VacConnector (VC) och VacValve ställs in korrekt (se figur 4). Figur 4 Montering av komponenterna i QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit för vakuumbearbetning av prov: 1: VacValve (tillhandahålls med vakuumsystemet) 3: QIAamp Mini Spin Column 2: VacConnector (VC) Om vakuummetoden används med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus rekommenderas märkning av Lysis Tubes (LT), Elution Tubes (ET) och QIAamp Mini Spin Columns i enlighet med schemat i figur 5 för att undvika sammanblandning av prov. Detta schema kan kopieras och märkas med provnamn. Användning av ett liknande schema rekommenderas om andra vakuumsystem eller spinnmetoden används. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

18 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

19 Datum: Operatör: Kör-ID: Figur 5 Märkningsschema för Lysis Tubes (LT), Elution Tubes (ET) och QIAamp Mini Spin Columns för användning med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

20 Vakuumprotokoll Protokoll: Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med ett vakuumsystem För isolering och rening av genomiskt DNA från 200 µl helblodsprov behandlade med EDTA eller citrat med ett vakuumsystem som QIAvac 24 Plus. Viktigt moment före start Metoden nedan ger anvisningar för bearbetning av ett enskilt blodprov. Upp till 24 prov kan emellertid bearbetas åt gången med vakuumsystemet QIAvac 24 Plus. Saker som ska utföras före start Låt blodprov anta rumstemperatur (15-25 C) och se till att de är väl blandade. Om en fällning bildas i Lysis Buffer (AL) kan den lösas upp genom inkubering vid 56 C. Se till att Wash Buffer 1 (AW1), Wash Buffer 2 (AW2) och QIAGEN Protease (QP) har förberetts i enlighet med anvisningarna i Viktiga anmärkningar på sidan 15. Låt Elution Buffer (AE) anta rumstemperatur (15-25 C) för användning i steg 14. Ställ in ett värmeblock på 56 C för användning i steg 4. För in en VacConnector (VC) i varje lueradapter i vakuumsystemet för att undvika korskontamination. Se till att avfallsflaskan för vakuumsystemet är tom och att alla anslutningar är korrekta. Se den medföljande handboken för detaljer om vakuumsystemets funktion, särskilt underhåll. Utförande 1. Pipettera 20 µl QIAGEN Protease (QP) i Lysis Tubes (LT). i Kontrollera utgångsdatumet för det rekonstituerade proteaset före användning. 2. Tillsätt 200 µl blodprov till Lysis Tubes (LT). 3. Tillsätt 200 µl Lysis Buffer (AL) till Lysis Tubes (LT), stäng locket och blanda med pulserande vortexblandning i 15 s. För att garantera effektiv lysering är det viktigt att provet och Lysis Buffer (AL) blandas noggrant för att ge en homogen lösning. i Se till att korrekt volym av Lysis Buffer (AL) tillsätts genom försiktig pipettering eller genom användning av en lämplig pipett som Eppendorfs flerstegspipett eller motsvarande eftersom Lysis Buffer (AL) har hög viskositet. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). 20 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

21 4. Inkubera vid 56 C (± 1 C) i 10 min (± 1 min). 5. Centrifugera Lysis Tubes (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 6. Tillsätt 200 µl etanol ( %) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda noggrant med pulserande vortexblandning i 15 s. 7. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 8. För in QIAamp Mini Spin Column i VacConnector (VC) på vakuumsystemet. 9. Applicera hela lysatet från steg 6 försiktigt på QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. i Om flera prov bearbetas ska endast ett Lysis Tube (LT) öppnas åt gången. 10. Sätt igång vakuumpumpen. Efter att lysatet har transporterats igenom QIAamp Mini Spin Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. i Om flera QIAamp Mini Spin Columns bearbetas på samma gång rekommenderas att VacValve för varje kolonn stängs efter att lysatet har passerat för att minska tiden för detta vakuumsteg. i Om lysatet inte fullständigt passerat genom membranet efter tio minuter, placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT), stäng locket och centrifugera vid cirka x g (8 000 varv/min) i tre minuter eller tills lysatet fullständigt passerat. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett annat rent Wash Tube (WT) och fortsätt med steg 10 i protokollet på sidan 24. i Vakuumsystemets ventil bör användas för snabb utjämning av vakuumtrycket. 11. Applicera 750 µl Wash Buffer 1 (AW1) till QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. Efter att Wash Buffer 1 (AW1) har transporterats igenom QIAamp Mini Spin Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas för att bryta vakuumet. 12. Applicera 750 µl Wash Buffer 2 (AW2) till QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. Låt kolonnens lock vara öppet och stäng ventilen på vakuumsystemet. Efter att Wash Buffer 2 (AW2) har transporterats igenom QIAamp Mini Spin Column ska ventilen på vakuumsystemet öppnas och släppa ut vakuumet. Vakuumprotokoll QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

22 Vakuumprotokoll 13. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column, ta bort den från vakuumsystemet och kasta VacConnector (VC). Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och centrifugera med maximal hastighet (cirka x g eller varv/min) i tre minuter för att fullständigt torka membranet. i Uteslutning av torrcentrifugeringen kan leda till inhibering av efterföljande analys. 14. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Elution Tube (ET) och kasta Wash Tube (WT) med filtratet. Öppna locket till QIAamp Mini Spin Column försiktigt och applicera 50 till 200 µl Elution Buffer (AE) till membranets centrum. Stäng locket och inkubera i rumstemperatur (15-25 C) i en minut. Centrifugera vid cirka x g (8 000 varv/min) i en minut för att eluera DNA. i Följ underhållsproceduren för vakuumsystemet efter att protokollet utförts (se handboken som medföljer vakuumsystemet för mer detaljer). 22 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

23 Protokoll: Isolering och rening av genomiskt DNA från blodprov med en mikrocentrifug För isolering och rening av genomiskt DNA från 200 µl helblodsprov behandlat med EDTA eller citrat med en mikrocentrifug. Viktigt moment före start Metoden nedan ger anvisningar för bearbetning av ett enskilt blodprov. Flera prov kan emellertid bearbetas samtidigt. Antalet beror på kapaciteten för den mikrocentrifug som används. Saker som ska utföras före start Låt blodproven anta rumstemperatur (15-25 C) och se till att de är väl blandade. Om en fällning bildas i Lysis Buffer (AL) kan den lösas genom inkubering vid 56 C. Se till att Wash Buffer 1 (AW1), Wash Buffer 2 (AW2) och QIAGEN Protease (QP) har förberetts i enlighet med anvisningarna i Viktiga anmärkningar på sidan 15. Låt Elution Buffer (AE) anta rumstemperatur (15-25 C) för användning i steg 15. Ställ in ett värmeblock på 56 C för användning i steg 4. Spinnmetod Utförande 1. Pipettera 20 µl QIAGEN Protease (QP) i ett Lysis Tube (LT). i Kontrollera utgångsdatumet för det rekonstituerade proteaset före användning. 2. Tillsätt 200 µl blodprov till Lysis Tube (LT). 3. Tillsätt 200 µl Lysis Buffer (AL) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda med pulserande vortexblandning i 15 s. Det är viktigt att prov och Lysis Buffer (AL) blandas noggrant för att garantera effektiv lysering och ge en homogen lösning. i Se till att korrekt volym av Lysis Buffer (AL) tillsätts genom försiktig pipettering eller genom användning av en lämplig pipett som Eppendorfs flerstegspipett eller motsvarande eftersom Lysis Buffer (AL) har hög viskositet. i Tillsätt inte QIAGEN Protease (QP) direkt till Lysis Buffer (AL). 4. Inkubera vid 56 C (± 1 C) i 10 min (± 1 min). 5. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 6. Tillsätt 200 µl etanol ( %) till Lysis Tube (LT), stäng locket och blanda noggrant med pulserande vortexblandning i 15 s. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

24 Spinnmetod 7. Centrifugera Lysis Tube (LT) i 5 s med maximal hastighet för att avlägsna droppar från insidan av locket. 8. Applicera hela lysatet från steg 6 försiktigt på QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. i Om flera prov bearbetas ska endast ett Lysis Tube (LT) öppnas åt gången. 9. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column och centrifugera vid cirka x g (8 000 varv/min) i en minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och kasta röret med filtratet. i Om lysatet inte fullständigt passerat igenom membranet efter centrifugering vid cirka x g (8 000 varv/min), centrifugera igen med maximal hastighet (cirka x g eller varv/min) i en minut. 10. Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 500 µl Wash Buffer 1 (AW1) utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. 11. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column och centrifugera vid cirka x g (8 000 varv/min) i en minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och kasta röret med filtratet. 12. Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 500 µl Wash Buffer 2 (AW2) utan att blöta ned kanten. Undvik att vidröra membranet i QIAamp Mini Spin Column med pipettspetsen. 13. Stäng locket på QIAamp Mini Spin Column och centrifugera med maximal hastighet (cirka x g eller varv/min) i en minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Wash Tube (WT) och kasta röret med filtratet. 14. Centrifugera med maximal hastighet (cirka x g eller varv/min) i tre minuter för att fullständigt torka membranet. i Uteslutning av torrcentrifugeringen kan leda till inhibering av efterföljande analys. 15. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent Elution Tube (ET) och kasta Wash Tube (WT) med filtratet. Öppna locket till QIAamp Mini Spin Column försiktigt och applicera 50 till 200 µl Elution Buffer (AE) till membranets centrum. Stäng locket och inkubera i rumstemperatur (15-25 C) i en minut. Centrifugera vid cirka x g (8 000 varv/min) i en minut för ett eluera DNA. 24 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

25 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

26 26 QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/2004

27 QIAGEN-företag På bakre omslaget finns kontaktinformation för lokala QIAGEN-kontor. QIAGEN-distributörer Argentina Tecnolab S.A. Tel: (011) Fax: (011) E-post: Hemsida: Belgien/Luxemburg Westburg b.v. Tel: Fax: (31) E-post: Hemsida: Brasilien Uniscience do Brasil Tel: Fax: E-post: Hemsida: Cypern Scientronics Ltd Tel: Fax: E-post: Danmark VWR International A/S Tel: Fax: E-post: Hemsida: Egypten Clinilab Tel: Fax: E-post: Finland VWR International Oy Tel: (09) Fax: (09) E-post: Hemsida: Grekland BioAnalytica S.A. Tel: (210) Fax: (210) E-post: Hemsida: Indien Genetix Tel: (011) eller (011) Fax: (011) E-post: Israel Westburg (Israel) Ltd. Tel: /4 eller (tullfri) Fax: E-post: Hemsida: Kina Gene Company Limited Tel: (852) Fax: (852) E-post: Hong Kong: Peking: Shanghai: Chengdu: Guangzhou: Korea LRS Laboratories, Inc. Tel: (02) Fax: (02) E-post: Hemsida: Kroatien INEL Medicinska Tehnika d.o.o. Tel: (01) Fax: (01) E-post: Malaysia RESEARCH BIOLABS SDN. BHD. Tel: (603) Fax: (603) E-post: Hemsida: Mexico Quimica Valaner S.A. de C.V. Tel: (55) Fax: (55) E-post: Hemsida: Nederländerna Westburg b.v. Tel: (033) Fax: (033) E-post: Hemsida: Norge VWR International AS Tel: Fax: E-post: info@no.vwr.com Hemsida: Nya Zeeland Biolab Ltd Tel: (09) eller Fax: (09) E-post: biosciences@nzl.biolabgroup.com Hemsida: Österrike VWR International GmbH Tel: (01) Fax: (01) E-post: info@at.vwr.com Hemsida: Polen Syngen Biotech Sp.z.o.o. Tel: (071) eller Fax: (071) E-post: info@syngen.pl Hemsida: Portugal IZASA PORTUGAL, LDA Tel: (21) Fax: (21) Singapore Research Biolabs Pte Ltd Tel: Fax: E-post: sales@researchbiolabs.com Slovakien BIO-CONSULT Slovakia spol. s.r.o. Tel/Fax: (02) E-post: bio-cons@cdicon.sk Hemsida: Slovenien MEDILINE d.o.o. Tel: (01) Fax: (01) eller (01) E-post: mediline@siol.net Spanien IZASA, S.A. Tel: (93) Fax: (93) E-post: suministros@izasa.es Sverige VWR International AB Tel: (08) Fax: (08) E-post: info@se.vwr.com Hemsida: Sydafrika Southern Cross Biotechnology (Pty) Ltd Tel: (021) Fax: (021) E-post: info@scb.co.za Taiwan TAIGEN Bioscience Corporation Tel: (02) Fax: (02) E-post: taigen@ms10.hinet.net Thailand Theera Trading Co. Ltd. Tel: (02) Fax: (02) E-post: theetrad@samart.co.th Tjeckien BIO-CONSULT spol. s.r.o. Tel/Fax: (420) E-post: info@bioconsult.cz Hemsida: Turkiet Medek Medikal Ürünler ve Saglik Hizmetleri A. S. Tel: (216) Fax: (216) E-post: makialp@med-ek.com Ungern Kasztel-Med Co. Ltd. Tel: (01) Fax: (01) E-post: info@kasztel.hu Hemsida: Alla övriga stater QIAGEN GmbH, Germany QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbok 01/

28 Australien QIAGEN Pty Ltd ABN PO Box 25 Clifton Hill Victoria 3068 Beställningar Fax Teknisk Support Frankrike QIAGEN S.A. 3 avenue du Canada LP COURTABOEUF CEDEX Beställningar Fax Teknisk Support Italien QIAGEN S.p.A. Via Grosio, 10/ Milano Beställningar Fax Teknisk Support Japan QIAGEN K.K. Forefront Tower II 13-1, Kachidoki 3 Chome Chuo-ku, Tokyo Telefon Fax Teknisk Support Kanada QIAGEN Inc Argentia Road Unit 7 Mississauga Ontario L5N 8L2 Beställningar Fax Teknisk Support 800-DNA-PREP ( ) Schweiz QIAGEN AG Auf dem Wolf Basel Beställningar Fax Teknisk Support Storbritannien och Irland QIAGEN Ltd. QIAGEN House Fleming Way Crawley West Sussex, RH10 9NQ Beställningar Fax Teknisk Support Tyskland QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse Hilden Beställningar Fax Teknisk Support USA* QIAGEN Inc Turnberry Lane Valencia CA Beställningar Fax Teknisk Support 800-DNA-PREP ( ) * Adress från och med 1:a februari Före detta datum, använd adressen QIAGEN Inc., Avenue Stanford, Valencia, CA /2004