artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok

Transkript

1 September 2010 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 24 (katalognr ) 72 (katalognr ) Version 1 Kvantitativ in vitro-diagnostik För användning med QIAsymphony SP/AS och Rotor-Gene Q-instrument , SV QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R SV Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prov- och analysteknik QIAGEN är den ledande leverantören av innovativ prov- och analysteknik, vilken möjliggör att isolera och upptäcka innehållen i valfritt biologiskt prov. Våra avancerade produkter och tjänster av hög kvalitet garanterar framgång från prov till resultat. QIAGEN skapar standarder i: Rening av DNA, RNA och proteiner Nukleinsyra- och proteinanalyser mikrorna-forskning och RNAi Automation av prov- och analysteknik Vårt uppdrag är att möjliggöra för dig att uppnå utomordentlig framgång och genombrott. För mer information, besök

3 Innehåll Satsinnehåll 5 Symboler 5 Förvaring 6 Avsedd användning 6 Begränsningar av produktanvändning 6 Teknisk hjälp 7 Kvalitetskontroll 7 Säkerhetsinformation 7 Introduktion 9 Princip 9 Information om patogen 9 Prestandaegenskaper 10 Arbetsflöde 17 Utrustning och reagenser som användaren ska tillhandahålla 21 Viktiga anmärkningar 23 Allmänna försiktighetsåtgärder 23 Insamling, förvaring och transport av prov 23 Så här kommer du i gång med QIAsymphony SP/AS-instrument 25 Förberedelse av provmaterial 27 Förberedelse av bärar-rna (CARRIER) buffert AVE (AVE)-blandningar 28 Använda en intern kontroll 28 Analyskontrolluppsättningar och analysparameteruppsättningar 29 Utbyten av nukleinsyror 29 Förvaring av nukleinsyror 29 Kvantifiering 30 Protokoll RNA-isolering på QIAsymphony SP 31 Analysinställningar på QIAsymphony AS 37 RT-PCR och dataanalys på Rotor-Gene Q 46 Felsökningshandbok 54 Litteraturhänvisningar 59 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010 3

4 Beställningsinformation 60 4 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

5 Satsinnehåll artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok (24) (72) Katalognr: Antal reaktioner Blå HI Virus-1 RG Master A 4 x 144 μl 8 x 144 μl Violett HI Virus-1 RG Master B 4 x 216 μl 8 x 216 μl Röd HI Virus-1 RG QS1* (1x 10 4 IU/μl) 200 μl 200 μl Röd HI Virus-1 RG QS 2* (1x 10 3 IU/μl) 200 μl 200 μl Röd HI Virus-1 RG QS 3* (1x 10 2 IU/μl) 200 μl 200 μl Röd HI Virus-1 RG QS 4* (1x 10 1 IU/μl) 200 μl 200 μl Grön HI Virus-1 RG IC 1000 μl 2 x 1000 μl Vit Vatten (PCR-grad) 1000 μl 1000 μl Handbok 1 1 * Kvantifieringsstandard. Intern kontroll. Symboler <N> Innehåller reagenser som räcker för <N> tester Använd före In vitro-diagnostisk medicinsk apparat Katalognummer Lot-nummer Materialnummer Komponenter artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010 5

6 Innehåller Antal Temperaturbegränsningar Lagenlig tillverkare Konsultera bruksanvisningen Viktig anmärkning Förvaring Komponenterna i artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit, måste förvaras vid 20 C och är stabil fram till det utgångsdatum som anges på etiketten. Upprepad tining och frysning (>2 x) ska undvikas, eftersom detta kan minska analyssensitiviteten. Avsedd användning artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit är ett nukleinsyreamplifieringstest in vitro avsett för kvantifiering av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1)-RNA i human plasma. I denna diagnostiska testsats används omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) och är konfigurerad för användning med QIAsymphony SP/AS-och Rotor-Gene Q-instrument. Plasmaprover innehållande grupp M undertyp A-H har validerats för användning i analysen. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit är avsedd för användning i samband med klinisk presentation och andra laboratoriemarkörer för sjukdomsprognos samt för användning som ett hjälpmedel vid bedömning av virussvar på antiretroviral behandling, mätt i förändring av HIV-1 RNA-nivåerna i EDTA-plasma. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit är inte avsett för användning som ett screeningtest för HIV eller som ett diagnostiskt test för att bekräfta förekomst av HIV-infektion. Begränsningar av produktanvändning Alla reagenser kan användas exklusivt i in vitro-diagnostik. Produkten ska endast användas av personal som har fått specialinstruktioner och som har utbildats i in vitro-diagnostiska förfaranden (EN375). 6 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

7 Användarhandboken måste följas strikt för att uppnå optimala resultat för PCR. Var noga med att uppmärksamma de utgångsdatum som är angivna på asken och på etiketterna för alla komponenter. Använd inte utgångna komponenter. Även om det i sällsynta fall kan uppkomma mutationer inom virusgenomets i hög grad bevarade områden, vilka täcks av satsens primrar och/eller sökfragment, kan dessa kvantifieras i underkant eller kan befintligheten av virus i dessa fall missas att upptäckas. Därför granskas analysens giltighet och prestanda med jämna mellanrum. Teknisk hjälp På QIAGEN är vi stolta över vår kvalitet och tillgängligheten av teknisk support. Våra tekniska tjänsteavdelningar är bemannade med erfarna vetenskapsmän med bred praktisk och teoretisk expertis i prov- och analysteknik samt i användningen av QIAGEN-produkter. Om du har några frågor eller stöter på några svårigheter vad gäller artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit eller QIAGENprodukter i allmänhet, får du gärna kontakta oss. QIAGEN-kunder är huvudkällan till information om avancerad eller specialiserad användning av våra produkter. Denna information är till hjälp för andra vetenskapsmän såväl som för forskarna på QIAGEN. Därför uppmuntrar vi dig att kontakta oss, om du har någraförslag gällande produktprestanda eller nya ansökningar och ny teknik. Teknisk hjälp och mer information: se vårt tekniska supportcenter på eller ring en av QIAGEN:s tekniska supportavdelningar eller lokala återförsäljare (se baksidan eller besök Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGENs ISO-certifierade kvalitetshanteringssystem testas varje lot av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit mot förutbestämda specifikationer för att garantera följdriktig produktkvalitet. Säkerhetsinformation När du arbetar med kemikalier ska du alltid ha på dig en laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon. Om du vill ha mer information, hänvisas till tillämpliga materialsäkerhetsdatablad (MSDSs). Dessa finns tillgängliga online i ett lättsamt och komprimerat PDF-format på där du kan hitta, titta på och skriva ut materialsäkerhetsdatabladen för varje QIAGEN-sats och satskomponent. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010 7

8 Säkerhetsinformation för QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit: se Handbok för QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Säkerhetsinformation om instrument: se användarhandboken för respektive instrument. Kassera prov- och analysavfall enligt lokala säkerhetsregler. Akutinformation dygnet runt Medicinsk akutinformation på engelska, franska och tyska kan erhållas dygnet runt från: Giftinformationscentret i Mainz, Tyskland Tel: artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

9 Introduktion artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit utgör ett system som är klart att användas för upptäckt av HIV-1 RNA som använder sig av polymeraskedjereaktion (PCR) på RotorGene-Q-instrument med provberedning och analysinställningar tillsammans med QIAsymphony-SP/AS-instrument. HI Virus-1 RG Master A och B innehåller reagenser och enzymer för den omvända transkriptionen och specifika amplifieringen av en 93 bp-region i HIV1-genomet, samt för direkt detektion av den specifika amplikonen i fluorescenskanalen Cycling Green i Rotor-Gene Q. Dessutom innehåller artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit ett andra heterologt amplifieringssystem för att identifiera eventuell PCR-inhibition. Denna upptäcks som en intern kontroll (IC) i fluorescenskanalens Cycling Orange av Rotor- Gene Q. Detektionsgränsen för analytiska HI Virus-1 RT-PCR har inte reducerats. Externa positiva kontroller (HI Virus-1 RG QS 1 4) medföljer, vilka gör det möjligt att fastställa andelen virus-rna. Mer information: se Kvantifiering, sidan 30. Princip Patogen organism upptäckt av polymeraskedjereaktion (PCR) baserar på amplifieringen av specifika regioner i den patogena organismens genom. I realtids-pcr upptäcks den amplifierade produkten via fluorescerande färgämnen. Dessa är vanligtvis kopplade till sökfragment av oligonukleotider, vilka binder specifikt till den amplifierade produkten. Om du övervakar fluorescensintensiteterna under PCR-körningen (det vill säga i realtid) kan du upptäcka och kvantifiera den ackumulerande produkten utan att behöva öppna reaktionsrören på nytt efter PCR-körningen.* Information om patogen Humant immunbristvirus (HIV) är ett retrovirus som orsakar förvärvat immunbristsyndrom (AIDS). Det finns två olika typer av HIV som leder till infektion hos människor, HIV-1 och HIV-2. De skiljer sig åt i virulens och prevalens. De flesta rapporterade fall av AIDS runt om världen har hänförts till HIV-1. Infektion med HIV sker genom överföring av infekterat blod, vaginalvätska, bröstmjölk och andra kroppsvätskor. I dessa kroppsvätskor förekommer HIV både som fria viruspartiklar och virus i infekterade immunceller. De tre vanligaste överföringsvägarna är oskyddat samlag, kontaminerade nålar samt överföring från en infekterad mor till hennes barn vid födseln eller genom bröstmjölken. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010 9

10 HIV infekterar primärt celler in det humana immunsystemet, exempelvis T- hjälpar-celler (specifikt CD4 + ). HIV-infektion leder till låga nivåer av CD4 + T- celler. När antalet CD4 + T-celler sjunker under en kritisk nivå går den cellmedierade immuniteten förlorad och kroppen blir alltmer mottaglig för opportunistiska infektioner. AIDS-symptom inträffar i framskriden fas av HIV-infektion, då det nedsatta immunsystemet inte längre klarar att bekämpa opportunistiska infektioner. I denna fas utvecklar den infekterade personen alltfler symptom som utlöses av dessa infektioner. De vanligaste infektionerna är bland annat kronisk cryptosporiddiarré, cytomegalovirus-inducerad ögoninfektion, pneumocystispneumoni, toxoplasmos och tuberkulos samt infektion av medlemmar av Mycobacterium avium-komplexet. Dessutom observeras ofta utveckling av olika typer av cancer, exempelvis invasiva cervikal cancer, kaposisarkom eller lymfom. För närvarande finns inget botemedel mot AIDS, och man tror att de flesta HIV-infekterade personerna till slut kommer att avlida i en AIDS-relaterad sjukdom. Framsteg inom behandlingen av HIV/AIDS, bland annat bekämpning av själva viruset liksom behandlingar som förebygger eller behandlar opportunistiska infektioner har emellertid drastiskt förbättrat den förväntade livslängden och livskvaliteten för många HIV/AIDS-patienter. Prestandaegenskaper Analytisk sensitivitet Den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen (sensitivitetsgräns) utvärderas för artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit med hjälp av HIV-positiva kliniska prover i kombination med extraktionen av QIAsymphony SP. Den analytiska sensitiviteten fastställdes med hänsyn till reningen av artus HI- Virus-1 QS-RGQ Kit med hjälp av en spädningsserie från WHO:s andra internationella standard för HIV-1 RNA (NIBSC-kod 97/650) från 316 till nominella 5 IU/ml spetsade i kliniska plasmaprover. Dessa underkastades en RNA-extraktion med hjälp av den QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit i kombination med Cellfree1000-protokollet (extraktionsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl). Var och en av de åtta spädningarna analyserades med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit under fyra olika dagar i fem körningar med elva replikat vardera. Resultaten fastställdes genom en probitanalys. En grafisk illustration av probitanalysen visas i figur 1. Den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit i kombination med Rotor-Gene Q är 76,4 IU/ml (p = 0,05). Detta innebär att det finns en 95- procentig sannolikhet att 76,4 IU/ml kommer att upptäckas. 10 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

11 1.0 95% Proportioner Proportions , ~ 76, UI/ml IU/ml (95%) (63,5 96,2 ( UI/ml) IU/ml) log log (dos) (dose) Figur 1. Probitanalys: HI Virus-1 (Rotor-Gene Q). Analytisk sensitivitet med hänsyn till reningen (QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit) i artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit på Rotor- Gene Q. Specificitet Specificiteten för artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit garanteras först och främst genom valet av primrar och sökfragment, såväl som genom valet av stränga reaktionsvillkor. Primrarna och sökfragmenten kontrollerades beträffande eventuella homologier i alla sekvenser som publicerats i genbaser genom sekvensjämförande analys. Möjligheten att detektera alla relevanta genotyper har på det viset garanterats genom en justering av databasen och genom en RT-PCR-körning på Rotor-Gene-instrument med följande genotyper (se tabell 1). För ytterligare test av specificiteten användes HI Virus-1-stammar med kända sekvensskillnader i HI Virus-1 genomets förkärneområde (HI Virus-1 förkärnemutant panel, Teragenix, Florida, USA). Alla 9 förkärnemutanta stammarna i denna panel kunde upptäckas med användning av artus HI Virus- 1 QS-RGQ Kit. Dessutom utvärderades specificiteten med 100 olika HIV-negativa plasmaprover. Dessa genererade inte några signaler med HIV-1-specifika primrar och prober, vilka ingår i HI Virus-1 RG Masters. Potentiell korsreaktivitet av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit testades med användning av den kontrollgrupp som anges i tabell 2 (sida 12). Ingen av de testade sjukdomalstrarna har varit reaktiva. Inga korsreaktiviteter visade sig med blandade infektioner. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

12 Tabell 1. Testning av relevanta genotypers specificitet Virus Genotyp Källa HIV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Orange) HI Virus-1 A NIBSC* + + HI Virus-1 B NIBSC + + HI Virus-1 C NIBSC + + HI Virus-1 D NIBSC + + HI Virus-1 E NIBSC + + HI Virus-1 F NIBSC + + HI Virus-1 G NIBSC + + HI Virus-1 H NIBSC + + * National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire. Tabell 2. Tester av kits specificitet med potentiellt korsreaktiva patogen Intern kontroll Kontrollgrupp HIV (Cycling Green) (Cycling Orange) Hepatit A-virus + Hepatit B-virus + Hepatit C-virus + Humant herpesvirus 1 (herpes simplex-virus 1) Humant herpesvirus 2 (herpes simplex-virus 2) Humant herpesvirus 3 (varicellazoster-virus) Humant herpesvirus 5 (cytomegalovirus) Tabellen fortsätter på nästa sida 12 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

13 Tabell 2. Fortsättning Kontrollgrupp Humant T-cell leukemivirus, typ 1 och typ 2 HIV (Cycling Green) Intern kontroll (Cycling Orange) + Enterovirus + Parvovirus B19 + Gula febern + Aspergillus flavus + Aspergillus fumigatus + Candida albicans + Chlamydia trachomatis + Cryptosporidium parvum + Filobasidiella neoformans + Mycoplasma pneumoniae + Pneumocystis cariniie + Staphylococcus sp. + Streptococcus agalactiae + Staphylococcus aureus + Streptococcus pyogenes + Linjärt område Det linjära området med hänsyn till reningen av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit fastställdes genom att analysera en spädningsserie med akrometriskt standardmaterial av HIV med intervallet 1,00 x 10 8 IU/ml till 1,00 x 10 2 IU/ml. Reningen utfördes i replikat (n = 4 för koncentrationer 1,00 x 10 7 IU/ml; n = 8 för koncentrationer <1,00 x 10 7 IU/ml) med hjälp av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit i kombination med Cellfree1000 -protokollet (extraktionsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl). Vart och ett av proven analyserades med hjälp av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Det linjära området med hänsyn till reningen av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit fastställdes genom att täcka koncentrationer från 2,50 x 10 2 IU/ml till 1,00 x 10 8 IU/ml (figur 2). artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

14 log estimated uppskattad concentration koncentration (IU/ml) (IU/ml) y = 1,0336x x + 0, R 4 R 2 2 = 0,9995 = log log 10 nominell 10 nominal koncentration concentration (IU/ml) (IU/ml) Figur 2. Linjärt område för artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Beräkning av det linjära området. Den raka linjen fastställdes genom en linjär regression av loggens 10 -beräknade koncentrationer jämfört med loggens 10 -nominella koncentrationer. Ekvationen för regressionslinjen är inkluderad i figuren. Precision Precisionsuppgifterna för artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit gör det möjligt att fastställa analysens totala varians. Den totala variansen består av intraanalysvariabiliteten (variabilitet för flera provresultat med samma koncentration inom ett experiment), interanalysvariabiliteteten (variabilitet för flera analysresultat alstrade på olika instrument av samma typ av olika operatörer inom ett laboratorium) och interbatchvariabiliteten (variabilitetet för flera analysresultat med hjälp av olika batcher). De uppgifter som erhölls användes för att fastställa standardavvikelsen, variansen, variationskoefficienten för den specifika sjukdomalstraren och den interna kontrollen för PCR. Analytiska precisionsdata i artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit (utan hänsyn tagen till reningen) samlades in med hjälp av kvantifieringsstandarden för den lägsta koncentrationen (QS4; 10 IU/μl). Tester utfördes med åtta replikat. Precisionsdata beräknades med utgångspunkt från C T -värdena i amplifieringskurvorna (C T : tröskelcykel, se tabell 3). Baserat på dessa resultat är den totala statistiska spridningen för ett av de givna proven med nämnd koncentration 1,66% (C T ) och 2,15% (C T ) för upptäckten av den interna kontrollen. Dessa värden bygger på slutsumman för alla enskilda värden av de fastställda variabiliteterna. 14 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

15 Tabell 3. Precisionsdata på underlag av C T -värdena Intraanalysvariabilitet: HI Virus-1 RG QS 4 Intraanalysvariabilitet: Intern kontroll Interanalysvariabilitet: HI Virus-1 RG QS 4 Interanalysvariabilitet: Intern kontroll Interbatchvariabilitet: HI Virus-1 RG QS 4 Interbatchvariabilitet: Intern kontroll Total varians: HI Virus-1 RG QS 4 Total varians: Intern kontroll C T -värde Standardav vikelse Variationskoef ficient (%) 35,62 0,45 1,26 31,24 0,18 0,58 35,75 0,56 1,55 31,65 0,36 1,13 35,40 0,61 1,73 31,20 0,55 1,76 35,58 0,59 1,66 31,40 0,67 2,15 Precisionsdata avseende rening av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit samlades in med användning av Acrometrix HIV-standardmaterial med en koncentration på 1,00 x 10 3 IU/ml spetsade i kliniska plasmaprover. Tester utfördes med hjälp av QIAsymphonys DSP Virus/Pathogen Kit i kombination med Cellfree1000- protokollet (extraktionsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl). Tester utfördes på 36 replikat med användning av en matris av olika batcher av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit och artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Baserat på dessa resultat är den totala statistiska spridningen för ett av de givna proven med nämnd koncentration 1,45% (C T ) eller 31,34% (koncentration) och 1,29 % (C T ) för upptäckten av den interna kontrollen (tabeller 4 och 5). Dessa värden bygger på slutsumman för alla enskilda värden av de fastställda variabiliteterna med hänsyn tagen till reningen. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

16 Tabell 4. Precisionsdata (total varians) på grundval av C T -värdena Acrometrix HIV standard (1,00 x 10 3 IU/ml) Intern kontroll (HIV, 1,00 x 10 3 IU/ml) Standardavvikelse Varians Variationskoefficient (%) 0,48 0,24 1,45 0,51 0,26 1,47 Tabell 5. Precisiondata (total varians) på grundval av de kvantitativa resultaten (i IU/ml) Acrometrix HIV standard (1,00 x 10 3 IU/ml) Medelvärde Standardavvikelse Variationskoefficient (%) 1,54 x ,84 x ,34 Robusthet Med hjälp av verifieringen av robustheten går det att fastställa den totala felfrekvensen av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. För att verifiera robustheten spetsades 100 HIV negativa prover av plasma med 230 IU/ml av HIV kontroll- RNA (ungefär en tre gånger så stor koncentration av den analytiska sensitivitetsgränsen). Efter extraktion med hjälp av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit i kombination med Cellfree1000_DSP protokollet (extraktionsvolym: 1 ml, elueringsvolym: 60 μl), analyserades dessa prover med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Dessutssutom utvärderades robustheten i den interna kontrollen genom rening och analys av de hundra spetsade plasmaproverna. Inhibitioner observerades inte. Således är robustheten i artus HI Virus-1 QS RGQ Kit 99 %. Reproducerbarhet Med hjälp av reproducerbarhetsdata är det möjligt att regelbundet utvärdera artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit och att göra en effektivitetsjämförelse med andra produkter. Dessa data erhålls vid deltagande i etablerade kunskapsprogram. 16 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

17 Korskontamination Frånvaro av korskontamination mellan prover i hela arbetsflödet bevisades tack vare en korrekt upptäckt av alla kända positiva och negativa prover i omväxlande positioner (schackrutat mönster) för valda artus QS-RGQ-system. Arbetsflöde QIAsymphony RGQ-arbetsflödet startar med en rening av nukleinsyror från humana plasmaprover på QIAsymphony SP-instrumentet. De eluerade substanserna, vilka innehåller renade nukleinsyror, från provberedningsförfarandet överförs till QIAsymphony AS-modulen, vilken därefter utför analysinställningar (figur 3). Analyserna överförs därefter till Rotor-Gene Q för RT-PCR och dataanalys (figur 4). På sidorna ges en översikt av arbetsflödet. Om du vill ha mer information, hänvisas till de utförliga protokollen i denna handbok (sidorna 31, 37 och 46). Figur 3. Enkel automatisering på QIAsymphony SP/AS-instrument. Prover, reagenser och konsumtionsvaror laddas i relevanta lådor. Provberedning och analysinställningar automatiseras därefter helt på QIAsymphony SP/AS-instrumenten. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

18 Figur 4. Överföring av proven till Rotor-Gene Q. Efter provberedning och analysinställningar laddas reaktionerna i Rotor-Gene Q:s 72-brunnsrotor för analys av PCR i realtid. QIAsymphony RGQ-arbetsföde översikt QIAsymphony SP Definiera en körning/batch med provberedningens användargränssnitt. Ladda lådorna med lämpliga prover, reagenser och konsumtionsvaror. Placera elueringsstället i lådan Eluate (Eluerad substans). Oberoende drift Integrerad drift Placera elueringsstället i valfri elueringsskåra (det vill säga skårorna 1 4). Starta protokollet. Placera elueringsstället med adapter, inklusive överföringsramen i skåra artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

19 När provbearbetningen är klar tar du antingen bort elueringsstället från lådan Eluate, (oberoende drift) manuellt, eller överför elueringsstället direkt till QIAsymphony AS via överföringsmodulen (integrerad drift). Oberoende drift Integrerad drift Tag bort elueringsstället från skåran på pekskärmen, öppna därefter lådan Eluate och tag bort elueringsstället manuellt. Tryck på Transfer (Överföra) för att överföra elueringsstället från skåra 1 i QIAsymphony SP till skåra 2 i QIAsymphony AS. Ladda ned QIAsymphony SP-resultatfilen. QIAsymphony AS Växla till ananalysinställningarnas användargränssnitt i pekskärmen. Starta analysdefinitionen. Oberoende drift Integrerad drift Tryck på New (Ny) och välj ställfilen från respektve körning på QIAsymphony SP. Ett meddelande visas, vilket frågar dig om du vill använda elueringsstället som ett provställ. Tryck på Yes för att bekräfta. Definiera en analyskörning. De skärmar som visas på pekskärmen vägleder dig steg för steg genom analysdefinitionen. Ladda lådorna Eluate and Reagents samt Assays (Analyser) med lämpliga prover, reagenser och konsumtionsvaror. Skärmen Loading Information (Ladda information) ger dig utförlig information. Alternativt kan du trycka på Queue (Kö) och ladda ned informationsfilen. Starta analyskörningen. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

20 Tag bort analyserna. Tryck på Remove (Tag bort) och tag därefter bort analysstället/analysställen från lådan Assays. Överför analysstället (analysställen) till Rotor-Gene Q. Ladda ned QIAsymphony AS-resultatfilen och cyklerfilen. Överför cyklerfilen till Rotor-Gene Q. Rotor-Gene Q Välj eller skapa en temperaturprofil. Klicka på Start Run. När körningen är klar analyserar du resultaten. Underhåll Utför lämpliga underhållsförfaranden för QIAsymphony SP/AS och Rotor-Gene Q enligt instrumentets användarhandböcker. Se avsnitt 8 i QIAsymphony SP/AS User Manual General Description (QIAsymphony SP/AS användarhandbok - Allmän beskrivning) och avsnitt 9 i Rotor-Gene Q User Manual (Rotor-Gene Q, användarhandbok). De ger dig mer specifikationer om de underhållsförfaranden som måste utföras dagligen, regelbundet och varje vecka. 20 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

21 Utrustning och reagenser som användaren ska tillhandahålla När du arbetar med kemikalier ska du alltid ha på dig en laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon. Om du vill ha mer information, hänvisas till tillämpliga materialsäkerhetsdatablad (MSDSs), vilka kan erhållas från produktleverantören. Pipetter (justerbara)* och sterila pipettspetsar med filter Vortex-blandare* Bordscentrifug* med rotor för 2 ml reaktionsrör med en centrifugeringskapacitet på 6800 x g För provberedning QIAsymphony SP-instrument (kat.nr )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (kat.nr ) Adaptrar för QIAsymphony SP: Elueringsmikrorörställ QS (avkylningsadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ) Rörinföring 3B (införing, 2,0ml v2, provbärare (24), Qsym, kat.nr ) Konsumtionsvaror för QIAsymphony SP: Provberedn.patroner, 8-brunnars, (kat.nr ) 8-stavars skydd (kat.nr ) Filterspetsar, 1500 μl (kat.nr ) Filterspetsar, 200 μl (kat.nr ) Elueringsmikrorör CL (kat.nr 19588) Spetsavfallspåsar (kat.nr ) Mikrorör 2,0 ml, typ I (Sarstedt, kat.nr , för användning med prover och interna kontroller För analysinställning QIAsymphony AS-instrument (kat.nr )* Adaptrar och reagenshållare för QIAsymphony AS: * Förvissa dig om att du har kontrollerat och kalibrerat instrumenten enligt tillverkarens rekommendationer. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

22 Reagenshållare 1 QS (avkylningsadapter, reagenshållare 1, Qsym, kat.nr ) Reagenshållare 2 QS (avkylningsadapter, reagenshållare 2, Qsym, kat.nr ) RG-testremserör 72 QS (avkylningsadapter, RG-testremserör 72, Qsym, kat.nr ) Konsumtionsvaror för QIAsymphony AS: Testremserör med lock, 0,1 ml (kat.nr ) Rör, koniska, 2 ml, Qsym AS (kat.nr )* eller mikrorör 2,0 ml, typ I (Sarstedt, kat.nr , Rör, koniskt, 5 ml, Qsym AS (kat.nr )* eller rör med platt bas från PP (Sarstedt, kat.nr , Reagensflaskor, 30 ml, QSym AS (kat.nr ) Elueringsmikrorör CL (kat.nr 19588) Filterspetsar, 1500 μl (kat.nr ) Filterspetsar, 200 μl (kat.nr ) Filterspetsar, 50 μl (kat.nr ) Spetsavfallspåsar (kat.nr ) För PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument Rotor-Gene Q programversion 2.02 eller högre * Kontrollera om produkten är tillgänglig. Förvissa dig om att du har kontrollerat och kalibrerat instrumenten enligt tillverkarens rekommendationer. 22 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

23 Viktiga anmärkningar Allmänna försiktighetsåtgärder Användaren ska alltid vara uppmärksam om följande: Använd sterila pepiettspetsar med filter. Håll om möjligt rör stängda under manuella åtgärder och undvik kontamination. Tina alla komponenter noggrant vid rumstemperatur (15 25 C) innan du startar en analys. När komponenterna är tinade, blandar du dem (pipettera upprepade gånger upp och ned eller genom pulsvortex-blandning) och centrifugera kort. Kontrollera att det inte finns något skum eller några bubblor i reagensrören. Kontrollera att de nödvändiga adaptrarna har förkylts till 2 8 C. Arbeta snabbt och håll PCR reagenser på is eller i kylblocket innan du laddar dem. Fortgå kontinuerligt från en del i arbetsflödet till nästa. Överskrid inte 30 minuters överföringstid mellan varje modul (QIAsymphony SP till QIAsymphony AS till Rotor-Gene Q). Insamling, förvaring och transport av prov Alla prover måste behandlas som potentiellt infektiöst material. Enbart följande provmaterial är tillåtna, där följande regler och särskilda instruktioner om insamling, transport och förvaring strikt har iakttagits. Aktuell studier hänvisar till EDTA plasma som det mest lämpliga provmaterialet för HIV-detektion. Därför rekommenderar vi att dessa material används med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Den interna utvärderingen av artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit har utförts med humana EDTA-plasmaprover. Annat provmaterial har inte utvärderats. Använd endast den rekommenderade RNA-isoleringssatsen (se Protokoll: RNAisolering på QIAsymphony SP, sidan 31) vad beträffar provberedning. Om du använder vissa provmaterial måste du strikt iaktta speciella instruktioner om insamling, transport och förvaring. Insamling av prov Varje tappning av blod skadar blodkärl (artärer, vener och kapillärer). Använd endast harmlöst och sterilt material. Det finns lämpliga engångsförpackningar artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

24 för tappning av blod. Använd inte kapillärnålar för venpunkturer. Tappa venblod på lämpliga ställen i armvecket, på underarmen eller på handens baksida. Blod måste tappas med standardprovinsamlingsrör (röd hätta, Sarstedt eller motsvarande rör från annan tillverkare). Tappa en volym motsvarande 5 10 ml EDTA-blod. Rör ska blandas ovanför huvudet direkt efter blodinsamling (åtta gånger, rör inte om). Prover från hepariniserade människor får inte användas (se Störande substanser, sidan 24). Provförvaring Helblod måste separeras i plasma- och cellulära komponenter genom centrifugering under tjugo minuter vid x g inom sex timmar. Den isolerade plasman måste överföras i sterila polypropylen rör. Analysens sensitivitet kan minska, om du fryser proven som ett rutinförfarande eller förvarar dem under en längre tid. Virusinkapslad RNA är stabil i flera dagar, om du förvarar det vid 4 C, i flera veckor, om du förvarar det vid 20 C, och även i flera månader eller år, om du förvarar det vid 70 C.* Provtransport Provmaterial ska rutinmässigt transporteras i en splitterfri transportbehållare. På så sätt undviker du att en infektion uppstår på grund av läckande prov. Transportera proven enligt lokala och nationella instruktioner för transport av patogen material. Proven måste levereras inom sex timmar. Vi rekommenderar inte att du förvarar proven på insamlingsplatsen. Du kan leverera proven via post, om du följer de lagenliga instruktionerna för transport av patogen material. Vi rekommenderar provtransport via bud. Blodproven måste transporteras kylförvarade (2 8 C), och den separerade plasman djupfryst ( 15 till 30 C). Störande substanser Förhöjda nivåer av albumin ( 6 g/dl), bilirubin ( 30 mg/dl) och lipider ( 1 g/dl triglycerid), såväl som hemolytiska prover ( 2 g/dl hemoglobin) påverkar inte systemet. Heparin ( 10 IU/ml) påverkar PCR. Prover som har insamlats i rör innehållande heparin som en antikoagulant får inte användas. Prover från hepariniserade patienter får inte heller användas. * Arbeitskreis Blut, V17 ( ), Bundesgesundheitsblatt 11/1997, sid International Air Transport Association (IATA). Föreskrifter om farligt gods. 24 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

25 Så här kommer du i gång med QIAsymphony SP/ASinstrument Stäng alla lådor och huvar. Sätt på QIAsymphony SP/AS-instrumenten och vänta tills skärmen Sample Preparation (provberedning) visas och initieringen har slutförts. Logga in på instrumentet (lådorna låses upp). Ladda reagenspatroner (RC) i lådan Reagents and Consumables (reagenser och konsumtionsvaror). Reagenser för rening av nukleinsyror ligger i en innovativ reagenspatron (RC) (se figur 5). Varje tråg i reagenspatronen (RC) innehåller en speciell reagens, till exempel magnetiska partiklar, lysbuffert, tvättbuffert, eller elueringsbuffert. Reagenspatroner (RC) som använts till en del kan stängas på nytt med återanvändbara tätningsremsor för senare användning, vilket förhindrar uppkomsten av avfall på grund av överblivna reagenser mot slutet av reningsförfarandet. Instickslock (PL) Enzymställ (ER) Skåror med skruvlock från enzymrör Återanvändbar tätningsremsa Magnetiskt partikeltråg Ram med reagenstråg Reagenspatronhå llare Figur 5. Kassera reagenspatron (RC). Reagenspatronen (RC) innehåller alla reagenser som behövs för reningsprocessen. Innan du startar förfarandet, måste du kontrollera att magnetpartiklarna är helt resuspenderade. Tag bort magnetpartikeltråget från reagenspatronramen, vortex-blanda det kraftfullt under minst tre minuter och byt ut det i reagenspatronramen före den första användningen. Placera reagenspatronen (RC) i reagenspatronhållaren. Placera enzymstället (ER) i reagenspatronhållaren. Innan du använder reagenspatronen (RC) den första gången, placerar du instickslocket (PL) på reagenspatronen (RC) (figur 6). Instickslocket (PL) är vasst. Var försiktig när du placerar det i reagenspatronen (RC). Kontrollera att du placerar instickslocket (PL) på reagenshållaren (RC) i rätt riktning. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

26 När du har tagit bort magnetpartikeltrågskyddet och öppnat enzymställrören (skruvlock kan förvaras i skåror avsedda för detta ändamål, se figur 5), laddar du därefter reagenshållaren (RC) i lådan Reagents and Consumables. Insticklslock (PL) Figur 6. Enkel inställning av arbetsbord med reagenspatroner (RC). Reagenspatroner (RC) som använts till en del kan förvaras tills de behövs igen, se Storage (Förvaring) i handboken QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Ladda plastartiklar i lådan Reagents and Consumables. Provberedningspatroner, 8-stavars skydd (båda förinställda i enhetsaskar) och kasserbara filterspetsar (200 μl spetsar i blå ställ, 1500 μl spetsar i svarta ställ) laddas in i lådan Reagents and Consumables. Kontrollera att du har tagit bort skydden på enhetsaskarna innan du laddar askarna i lådan Reagents and Consumables. Spetsar har filter, vilket hjälper att förhindra korskontamination. Spetsställskåror i QIAsymphony SP-arbetstabellen kan fyllas med valfri typ av spetsställ. QIAsymphony SP identifierar typ av spetsar som laddats under inventarieskanningen. Fyll inte spetsställ eller enhetsaskar på nytt med provpreparerade patroner eller 8-stavars skydd innan du startar ännu en protokollkörning. QIAsymphony SP kan använda spetsställ och enhetsaskar som är något använda. Ladda lådan med Waste Provpreparerade patroner och 8-stavars skydd som används under en körning ställs på nytt i tomma enhetsaskar lådan Waste (avfall). Kontrollera att lådan 26 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

27 Waste innehåller tillräckligt med tomma enhetsaskar för plastavfall som alstrats under protokollkörningen. Kontrollera att du har tagit bort skydden på enhetsaskarna innan du laddar askarna i lådan Waste. Om du använder askar med 8-stavars skydd för att samla in förbrukade provpreparerade patroner och 8-stavars skydd, måste du kontrollera att du har tagit bort askens avståndsbricka. En påse för förbrukade filterspetsar måste fästas på framsidan av lådan Waste. Systemet kontrollerar inte, om det finns en avfallspåse. Konmtrollera att spetsavfallspåsen har fästs ordentligt innan du startar protokollkörningen. Användarhandböckerna som medföljer instrumentet ger mer information. Töm spetspåsen när du har kört maximalt 96 prover, så att det inte anhopas för många spetsar. En avfallsbehållare samlar in flytande avfall som alstrats under reningsförfarandet. Lådan Waste kan endast stängas, om avfallsbehållaren finns på plats. Kassera det flytande avfallet enligt lokala säkerhets- och miljöregler. Autoklavera inte den fyllda avfallsflaskan. Töm avfallsflaskan när du har bearbetat maximalt 96 prover. Ladda lådan med Eluate Ladda det krävda elueringsstället i lådan Eluate. Använd Elution slot 1 (elueringsskåra 1) med motsvarande avkylningsadapter. Placera elueringsstället med adpter, inklusive överföringsramen i skåra 1 för att få ett integrerat arbetsmoment. Inventarieskanning Innan du startar en körning kontrollerar instrumentet att tillräckligt med konsumtionsvaror för batchen/batcherna i kön har laddats i motsvarande lådor. Förberedelse av provmaterial QIASymphony midisats med DSP Virus/Pathogen Midi Kit är lämplig för användning med humana plasmaprover. Undvik skumbildning i eller på proven. Prover ska bringas i jämvikt till rumstemperatur (15 25 C) innan du startar körningen. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

28 Förberedelse av bärar-rna (CARRIER) buffert AVE (AVE)- blandningar Vi rekommenderar å det bestämdaste att bärar-rna (CARRIER) används. Om bärar-rna (CARRIER) inte tillsätts, kan återhämtningen av nukleinsyror avsevärt reduceras. Om du vill bereda en bärar-rna- (CARRIER) moderlösning, tillsätter du 1350 μl buffert AVE (AVE), (tillhandahålls i ampuller á 2 ml) i det rör som innehåller 1350 μg frystorkad bärar- RNA (CARRIER) för att erhålla en lösning á 1 μg/μl. Lös bärar-rna (CARRIER) noggrant, dela den i lagom stora alikvoter och förvara vid 2 8 C i upp till två veckor. Beräkna volymen för bärar-rna (CARRIER)-blandning per rör Minimivolymen av bärar-rna (CARRIER)-buffert-AVE (AVE)-blandning måste inkludera tillräckligt stor extra volym för att ta med den vätskeförlust i beräkningen som beror på pipettering och avdunstning. Se tabell 6, om du vil veta mer om de volymer du kan använda tillsammans för analys med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Rör som innehåller bärar-rna (CARRIER)-buffert-AVE (AVE) (och valfria intern kontroll)-blandningar är placerade i en rörbärare. Den rörbärare som innehåller bärar-rna (CARRIER)-buffert AVE (AVE)-blandning(ar) måste placeras i provlådans skåra A. Upp till åtta rör av blandningen kan användas per batch, och upp till 24 rör kan användas per körning av fyra batcher. Använda en intern kontroll En intern kontroll (HI Virus-1 RG IC) levereras tillsammans med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Detta gör att användaren både kan kontrollera RNAisoleringsförfarandet och kontrollera om det finns en möjlig inhibition av PCR. QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit i kombination med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit kräver att den interna kontrollen (HI Virus-1 RG IC) förs in i reningsförfarandet för att övervaka effektiviteten med provförberedelse och analys nedströms. Interna kontroller måste tillsättas med bärar-rna (CARRIER)-buffert AVE (AVE)- blandning, och den totala volymen av den interna kontrollbärar-rna (CARRIER)-buffert AVE (AVE)-blandningen förblir 120 μl. För denna ansökan tillsätter du den interna kontrollen i isoleringen enligt tabell 6. Denna framställer ett tillägg av den interna kontrollen i isoleringen vid ett förhållande på 0,1 μl per 1 μl elueringsvolym. När du beräknar andelen intern kontroll att använda såväl som halten bearbetat prov, måste du beräkna den verkliga volym elueringslösning som används för varje prov. Eftersom små vätskemängder går förlorade under överföring och kontakt med magnetiska 28 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

29 partiklar, måste den inledande volymen av elueringslösning vara större än den valda volymen för att garantera att den slutliga eluerade substansen har korrekt volym. Vi rekommenderar att du preparerar färska blandningar för varje körning precis innan användning. Använd IC-kalkylatorn för att fastställa den totala volym som krävs, inklusive tom volym, för det antal prover som ska köras. Tabell 6. Förberedelse av intern kontroll-bärar-rna (CARRIER) Komponent Stammar från bärare av RNA (CARRIER) Volym (μl) 5 Intern kontroll* 9 Buffert-AVE 106 Slutlig volym per prov 120 * Beräkningen av andelen intern kontroll bygger på de inledande elueringsvolymerna (90 μl). Ytterligare tomvolym beror på vilken typ av provrör som används. Använd IC-kalkylatorn för att fastställa den totala volym som krävs, inklusive tom volym, för det antal prover som ska köras. Analyskontrolluppsättningar och analysparameteruppsättningar Analyskontrolluppsättningar är kombinationen av ett protokoll plus extra parametrar, till exempel intern kontroll, för provrening på QIAsymphony SP. En förvald analyskontrolluppsättning har förinstallerats för varje protokoll. Analysparameteruppsättningar är kombinationen av en analysdefinition med ytterligare parametrar definierade, till exempel replikaträkning och antal analysstandarder, för analysinställningar på QIAsymphony AS. Utbyten av nukleinsyror Eluerade substanser preparerade med bärar-rna (CARRIER) kan innehålla många fler bärar-rna (CARRIER) än målnukleinsyror. Vi rekommenderar att du använder kvantitativa amplifieringsmetoder för att fastställa utbyten. Förvaring av nukleinsyror För korttidsförvaring upp till 24 timmar rekommenderar vi en förvaring av nukleinsyror vid 2 8 ºC. För långtidsförvaring över 24 timmar rekommenderar vi förvaring vid 20 ºC. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

30 Kvantifiering Kvantifieringsstandarderna (HI Virus-1 RG QS 1 4) i artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit behandlas som tidigare renade prover och samma volym används (20 μl). Om du vill framställa en standardkurva på Rotor-Gene-Q-instrument, måste du använda alla 4 kvantifieringsstandarder och definiera dessa i dialogrutan Edit Samples (Redigera prover) på Rotor-Gene Q-instrumentetsom standarder med de specificerade koncentrationerna (se instrumentanvändarhandboken). Kvantifieringsstandarderna är definierade som IU/μl.* Följande ekvation måste användas för att omvandla de fastställda värdena med hjälp av standardkurvan till IU/ml provmaterial: Resultat (IU/ml) = Resultat (IU/μl) x inledande elueringsvolym (90 μl) Provvolym (ml) Principiellt ska den inledande provvolymen fyllas i ekvationen ovan. Tag hänsyn till denna när provvolymen har förändrats före extraktionen av nukleinsyran (till exempel reducering av volymen genom centrifugering eller ökning av volymen genom att tillsätta den volym som krävs för isoleringen). En riktlinje för den kvantitativa analysen av system som upptäcker sjukdomalstrande ämnen på Rotor-Gene-instrument finns att tillgå från QIAGEN teknisk support ( Teknisk notis om kvantifiering på Rotor- Gene instrument ). * Standarden har kalibrerats med hjälp av den internationella HIV standarden (WHO). Beräkningen baserar på de inledande elueringsvolymerna (90 μl). 30 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

31 Protokoll: RNA-isolering på QIAsymphony SP QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (QIAGEN, kat. nr ) har utvärderats för virus-rna-rening från human plasma för användning med artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit. Allmän information om protokollet visas i tabell 7. Tabell 7. Allmän protokollinformation Kit Provmaterial Provvolym (inklusive överskottsvolym) Protokollnamn Förvald analyskontrolluppsättning Elueringsvolym Nödvändig programversion QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit EDTA-plasma 1200 μl Cellfree1000_V4_DSP Cellfree1000_V4_DSP artus HIV 60 μl Version 3.1 eller högre Viktiga saker att tänka på innan du startar Kontrollera att du vet hur du manövrerar QIAsymphony SP/ASinstrumenten. De användarhandböcker som medföljer instrumenten innehåller driftinstruktioner. Innan du startar förfarandet läser du Viktiga anmärkningar, sidorna Innan du använder reagenspatronen (RC) för första gången kontrollerar du att bufferterna QSL2 och QSB1 inte innehåller ett precipitat. Vid behov avlägsnar du de tråg som innehåller bufferterna QSL2 och QSB1 från reagenspatronen (RC) och inkuberar under trettio minuter vid 37 C med sporadiska omskakningar för att lösa upp precipitatet. Ersätt trågen i korrekta positioner. Om du redan har stuckit igenom reagenspatronen (RC), kontrollerar du att trågen är tätade med återanvändbara tätningsremsor och inkuberar hela reagenspatronen (RC) under trettio minuter vid 37 C med sporadiska omskakningar i ett vattenbad.* * Förvissa dig om att du har kontrollerat, underhållit och kalibrerat instrumenten regelbundet enligt tillverkarens rekommendationer. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

32 Försök att undvika kraftiga omskakningar av reagenspatronen (RC) eftersom det kan bildas skum, vilket kan ge upphov till problem med att upptäcka vätskenivån. Alla komponenter i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit har visat sig vara stabila ombord på QIAsymphony SP/AS-instrumenten under minst den normala tid som krävs för att bearbeta 96 prover. Gör följande innan du startar: Preparera alla nödvändiga blandningar, inklusive blandningar som innehåller bärar-rna (CARRIER) och interna kontroller precis innan du startar. Mer information finns på Förberedelse av bärar-rna (CARRIER) buffert AVE (AVE)-blandningar, sida 28 och Använda en intern kontroll, sida 28. Kontrollera att du har placerat instickslocket (PL) på reagenspatronen (RC), och att du har tagit bort locket på det magnetiska partikeltråget. Om du använder en reagenspatron (RC) som redan har brukats en del, kontrollerar du att du har tagit bort de återanvändbara tätningsremsorna. Innan du startar förfarandet, måste du kontrollera att magnetpartiklarna är helt resuspenderade. Vortex-blanda tråget som innehåller de magnetiska partiklarna kraftfullt under minst tre minuter före första användningen. Innan du laddar reagenspatronen (RC) tar du bort skyddet från det tråg som innehåller de magnetiska partiklarna och öppnar enzymrören. Kontrollera att enzymstället har bringats i jämvikt med rumstemperatur (15 25 C). Kontrollera att du har placerat instickslocket (PL) på reagenspatronen (RC). Om du använder en reagenspatron som redan brukats en del, kontrollerar du att du har tagit bort de återanvändbara tätningsremsorna. Om prover är streckkodade, ställer du in proven i rörbäraren så att streckkoderna pekar mot streckkodsläsaren inuti lådan Sample (prov) till vänster om QIAsymphony SP. Förfarande 1. Stäng alla lådor och huvar på QIAsymphony SP/AS-instrumenten. 2. Sätt på instrumenten och vänta tills skärmen Sample Preparation (provberedning) visas och initieringen har slutförts. Strömbrytaren sitter nedtill i det vänstra hörnet på QIAsymphony SP. 3. Logga in på instrumenten. 4. Kontrollera att lådan Waste har preparerats korrekt (se tabell 8) och skanna inventariet i lådan Waste, inklusive spetsrännan och det flytande avfallet. Byt spetsavfallspåse vid behov. 32 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

33 Tabell 8. Preparera lådan Waste Enhetsaskhållare 1 4 Avfallspåshållare Flaskhållare för flytande avfall Tomma enhetsaskar Sätt in avfallspåse Töm och installera flaska för flytande avfall 5. Ladda det krävda elueringsstället i lådan Eluate. Använd endast Elution slot 1 med tillhörande avkylningsadapter (Cavkylningsadapter, EMT, v2, Qsym, kat.nr ). Placera elueringsstället med adpter, inklusive överföringsramen i skåra 1 för att få ett integrerat arbetsmoment. 6. Ladda nödvändig(a) reagenspatron(er) (RC) och konsumtionsvaror i lådan Reagents and Consumables (se tabeller 9 och 10). Beroende på inställningarna kan antalet givna filterspetsar skilja sig från de siffror som visas på pekskärmen. Tabell 9. Preparera lådan Reagents and Consumables. RC-position 1 och 2 Spetsställhållare, position 1 4 Spetsställhållare, position 5-18 Enhetsaskhållare, position 1 3 Enhetsaskhållare, position 4 Ladda 1 reagenspatron (RC) för maximalt 48 prover eller två nya reagenspatroner (RC) med maximalt 96 prover. Ladda tillräckligt många kasserbara filterspetsar, 200 μl (se tabell 10) Ladda tillräckligt många kasserbara filterspetsar, 1500 μl (se tabell 10) Ladda tre enhetsaskar innehållande provbearbetade patroner Ladda 1 enhetsask innehållande 8-stavars skydd artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

34 Table 10. Nödvändiga plastartiklar för 1 4 provbatcher Kasserbara filterspetsar, 200 μl Kasserbara filterspetsar, 1500 μl Provpreparerade patroner En batch, 24 prover* Två batcher, 48 prover* Tre batcher, 72 prover* Fyra batcher, 96 prover* stavars skydd * Om du använder fler än ett internt kontrollrör per batch och utför mer än en inventarieskanning, måste du ha fler kasserbara filterspetsar. Det finns 32 filterspetsar/spetsställ. Antal nödvändiga filterspetsar inkluderar filterspetsar för en inventarieskanning per reagenspatron. Det finns 28 provbearbetade patroner/enhetsask. Det finns tolv 8-stavars skydd/enhetsask. 7. Utför en inventarieskanning av lådan Reagents and Consumables. 8. Placera proven i respektive rörbärare, och ladda dem i lådan Sample, (se tabell 11). Tabell 11. Ladda prover i lådan Sample Provtyp Provvolym (inklusive överskottsvolym) Provrör EDTA-plasma 1200 μl Mikrorör 2,0 ml, typ I (Sarstedt, kat.nr ) Införande Rörinföring 3B (kat.nr ) 34 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

35 9. Placera röret/rören som innehåller bärar-rna (CARRIER)-buffert AVE (AVE)-blandning, inklusive intern kontroll, i rörbäraren och ladda in i skåra A i lådan Sample. Mer information finns på Förberedelse av bärar-rna (CARRIER) buffert AVE (AVE)-blandningar, sida 28 och Använda en intern kontroll, sida Med pekskärmen matar du in nödvändig information för varje provbatch som ska bearbetas. Ange följande information: Provinformation Protokoll som ska köras (välj analyskontrolluppsättning Cellfree1000_V4_DSP artus HIV från kategorin artus_qs-rgq ) Elueringsvolym 60 μl (se tabell 12) och utmatningsposition skåra 1 Rör som innehåller bärar-rna (CARRIER) buffert AVE (AVE)- blandningen, inklusive intern kontroll (välj IC-namn Cellfree1000_V4_DSP artus HIV ) När du har matat in information om batchen ändras statusen från LOADED (LADDAD) till QUEUED (I KÖ). Så snart som en batch är i kö visas knappen Run (Kör). Tabell 12. Förvald elueringsvolym Förvald elueringsvolym (μl)* Första elueringsvolym (μl) * Den elueringsvolym som förvalts för protokollet. Detta är den minsta volym som är tillgänglig av den eluerade substansen i det slutliga elueringsröret. Den första volym av elueringslösning som krävs för att förvissa sig om att den verkliga volymen av eluerad substans är densamma som den förvalda volymen. 11. Tryck på knappen Run för att starta reningsförfarandet. Alla bearbetningssteg är helautomatiserade. Mot slutet av protokollkörningen ändras batchstatusen från RUNNING (KÖR) till COMPLETED (KLAR). artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

36 12. När provbearbetningen är klar tar du antingen bort elueringsstället från lådan Eluate, (oberoende drift), eller överför elueringsstället direkt till QIAsymphony AS via överföringsmodulen (integrerad drift). För oberoende drift tar du bort elueringsstället från skåran på pekskärmen och öppnar därefter lådan Eluate och tar bort elueringsstället manuellt. För integrerad drift trycker du på Transfer för att överföra elueringsstället från skåra 1 i QIAsymphony SP till skåra 2 i QIAsymphony AS. Vi rekommenderar att du omgående fortsätter med analysinställningarna på QIAsymphony AS när körningen är klar. Beroende på temperatur och fuktighet kan de eluerade substanser som finns kvar i QIAsymphony SP efter det att körningen är slutförd kondensera eller avdunsta. För korttidsförvaring upp till 24 timmar rekommenderar vi en förvaring av renade nukleinsyror vid 2 8 ºC. För långtidsförvaring över 24 timmar rekommenderar vi förvaring av renade nukleinsyror vid 20 ºC. Resultatfiler alstras för varje elueringsställ. 13. Om en reagenspatron (RC) endast har använts till en del, tätar du den med medföljande återanvändbara tätningsremsor och stänger rören innehållande proteinas K med skruvlock direkt efter slutförd protokollkörning för att undvika avdunstning. Mer information om förvaring av reagenspatroner (RC) som använts till en del finns i Storage i handboken QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. 14. Kassera använda provrör, plattor och avfall enligt lokala säkerhetsregler. Se handboken QIAsymphony DSP Virus/Pathogen för säkerhetsinformation. 15. Stäng instrumentlådorna och fortsätt med analysinställningarna på QIAsymphony AS (sida 37). 16. Rengör QIAsymphony SP under analysinställningarna på QIAsymphony AS eller senare version. För integrerad drift rengör du alla instrument mot slutet av det utförda arbetsflödet. Följ underhållsinstruktionerna i QIAsymphony SP/AS User Manual General Description. Kontrollera att du utför underhåll regelbundet för att minimera risken för korskontamination. 36 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

37 Protokoll: Analysinställningar på QIAsymphony AS QIAsymphony AS utför analysinställningar för 6 72 reaktioner. Prover som bearbetas på QIAsymphony SP kan överföras automatiskt till QIAsymphony AS (integrerad drift). För extra flexibilitet kan QIAsymphony SP och AS även manövreras oberoende.* Specifikationer om analysen visas i tabell 13. Tabell 13. Analysparametrar som använder artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit Bearbetningsinformation Provinmatningsmaterial Masterblandningsvolym Mallvolym Specifikationer Eluerad substans 30 μl 20 μl Antal reaktioner 6 24 eller 6 72 Bearbetningstid Nödvändig programversion För 6 reaktioner: cirka 9 minuter För 72 reaktioner: cirka 35 minuter Version 3.1 eller högre Vid körning av flera analyskörningar måste det säkerställas att gränsen på 72 reaktioner och 1 analysställsadapter inte överskrids. Undvik långvarig inkubationstid mellan avslutandet av analyskörningen och överföring till Rotor-Gene Q. Analyser kördes med varje unik reaktion (inga replikat), och en masterblandning preparerades av instrumentet. Viktiga saker att tänka på innan du startar Innan du startar förfarandet läser du Viktiga anmärkningar, sidorna Reagensvolymerna har optimerats för 24 eller 72 reaktioner (kat. nr och ). För andra antal reaktioner måste överflödiga reagenser kasseras efter körningen. Före varje användning måste alla reagenser tinas helt, blandas (pipettera upprepade gånger upp och ned eller vortex-blanda snabbt) och centrifugeras under minst 3 sek vid 6800 x g. Undvik skumbildning av reagenserna. * QIAsymphony SP och AS förblir fysiskt anslutna under oberoende drift. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

38 Eluat från provberedningen och samtliga komponenter i artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit har visat sig vara stabila i instrumentet i minst den tid som normalt krävs för provrening av 96 prover och analysinställning för 72 analyser, inklusive upp till en timmes överföringstid från QIAsymphony SP till QIAsymphony AS samt upp till 30 minuters överföringstid från QIAsymphony AS till Rotor-Gene Q. Arbeta snabbt och håll PCR reagenser på is eller i kylblocket innan du laddar dem. Gör följande innan du startar: Kombinera samtliga provrör med HI Virus-1 RG Master A i en och samma sats i ett provrör före användning. Kombinera samtliga provrör med HI Virus-1 RG Master B i en och samma sats i ett provrör före användning. Förfarande 1. Sätt i spetsrännan. 2. Kassera spetsavfallspåsen. 3. Installera en tom spetsavfallspåse. 4. Växla till användargränssnittet i analysinställningarna genom att trycka på Switch -knappen (Växla) i statusfältet. 5. Starta analysdefinitionen. Tryck New för oberoende drift. För integrerad drift visas ett meddelande, vilket frågar dig om du vill använda elueringsstället som ett provställ. Tryck på Yes för att bekräfta. Skärmarna på pekskärmen vägleder användaren genom analysdefinitionen steg för steg. 6. Tilldela provstället en Sample -skåra genom att välja ställfilen från respektive körning på QIAsymphony SP. Om elueringsstället har överförts automatiskt till QIAsymphony AS, tilldelas ställfilen automatiskt. Skärmen Sample Rack(s) (Provställ) i ananalysinställningarnas användargränssnitt är redan ifylld. 7. Kontrollera provstället för prov, positionerna EC+ och EC-, providentiteter och volymer. 8. Välj den analysparameterinställning som ska användas i körningen (se tabell 14). 38 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

39 Tabell 14. Analysinformation som använder artus HI Virus-1 QS- RGQ Kit Pressmeddelandeinformation Kategori Analysparameteruppsättning Specifikationer artus QS-RGQ artus HIV-1 QS-RGQ_V1 9. Tilldela analysparameteruppsättningar för prover. Analysparameteruppsättningar definierar parametrarna i analysinställningarna, se tabell 15. Tabell 15. Analysparametrar Parameter Masterblandning Use ready-to-use master mix? (Använd bruksfärdig masterblandning?) Provinmatning Number of sample replicates (Antal provreplikat) Do samples contain an assay specific control? (Innehåller prover en analysspecifik kontroll?) Number of EC+ replicates (Antal EC+ replikat) Number of EC replicates (Antal EC replikat) Analysstandarder Number of assay standards replicates (Antal analysstandardreplikat) Selected assay standards (Valda analysstandarder) Förvald inställning No (Nej) 1 Yes QS1: IU/μl QS2: 1000 IU/μl QS3: 100 IU/μl QS4: 10 IU/μl Tabellen fortsätter på nästa sida artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

40 Tabell 15. Fortsättning Parameter Analyskontroller Assay standards on all output racks? (Analysstandarder på alla utmatningsställ?) Number of possitive assay controls (Antal positiva analyskontroller) Number of positive control replicates? (Antal positiva kontrollreplikat?) Number of NTC with IC replicates (Antal NTC med IC-replikat) Number of NTC without IC replicates (Antal NTC utan IC-replikat) Concentration (Koncentration) Unit (Enhet) Assay control on all assay racks? (Analyskontroller på alla analysställ?) Analysutmatning Assay rack (Analysställ) Cycler file format (Cyklerfilformat) Dyes (Färgämnen) Extra information Read only (Skrivskydd) Comment (Kommentar) Unique ID (Unikt ID) APS name (APS-namn) Förvald inställning All (Alla) Inget förval Inget förval Frånvald QIA# *StripTubes 0.1 Rotor-Gene Q Inget förval Master innehåller färgämne. Vald Ingen kommentar Inget ID artus HIV-1 QS-RGQ_V1 Tabellen fortsätter på nästa sida 40 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

41 Tabell 15. Fortsättning Parameter APS filename (APS-filnamn) Panels (Paneler) Förvald inställning APS_artus_HIV-1_QS- RGQ_V1.xml Inga paneler 10. Definiera analysställ(er). Kommen så långt, går det nu att ladda analysställ(er) på Assay -skåran/skårorna (se tabell 18). 11. Kontrollera temperaturen för avkylningspositionerna. När målkylningstemperaturerna har uppnåtts visas skårorna i grön färg. 12. Fyll varje reagensrör med nödvändig volym tillämplig reagens enligt den laddningsinformation du erhöll från instrumentprogrammet (se tabell 16 för exempel på reagensvolymer). Före varje användning måste alla reagenser tinas helt, blandas (pipettera upprepade gånger upp och ned eller vortex-blanda snabbt) och centrifugeras under minst 3 sek vid 6800 x g. Undvik bubblor eller skumbildning, vilket kan ge upphov till upptäcktsfel. Arbeta snabbt och håll PCR komponenter på is eller i kylblocket innan du laddar dem. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

42 Tabell 16. Exempel på reagensvolymer* Volym (μl) för 24 Volym (μl) för 72 Reagens reaktioner reaktioner HI Virus-1 RG Master A HI Virus-1 RG Master B HI Virus-1 RG QS 1 (1x 10 4 IU/μl) HI Virus-1 RG QS 2 (1x 10 3 IU/μl) HI Virus-1 RG QS 3 (1x 10 2 IU/μl) HI Virus-1 RG QS 4 (1x 10 1 IU/μl) HI Virus-1 RG IC NTC * Den här tabellen ger exempel på reagensvolymer för en analyskörning med följande specifikationer: 19 eller 67 mallar, 4 analysstandarder, en eller ingen mallkontroll (NTC), prover med intern kontroll (IC), masterblandning preparerad av instrumentet. Använd tillämpliga reagensvolymer enligt den laddningsinformation som instrumentprogrammet ger. Kombinera samtliga provrör med HI Virus-1 RG Master A i en och samma sats i ett provrör före användning. Kombinera samtliga provrör med HI Virus-1 RG Master B i en och samma sats i ett provrör före användning. 13. Placera reagensrören, utan lock, i lämpliga positioner i förkylda reagensadaptrar (se tabell 17). 42 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

43 Tabell 17. Konsumtionsvaror Konsumtionsvaror Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Rör, koniska, 2 ml, Qsym AS (500)* Rör, koniska, 5 ml, Qsym AS (500)* Reagensflaskor, 30 ml, QSym AS (50)* Elueringsmikrorör CL (24 x 96) Namn på pekskärm QIA# *StripTubes 0.1 QIA# *T2.0 ScrewSkirt QIA# *T5.0 ScrewSkirt QIA# *Bottle 30ml QIA#19588 * EMTR För användning med adapter/reagenshållare RG Strip Tubes 72 QS Reagent holder 1 QS Reagent holder 2 QS Reagent holder 1 QS Reagent holder 2 QS Reagent holder 2 QS Elution Microtube Rack QS * För masterblandade komponenter, systempreparerad masterblandning, analysstandarder och analyskontroller. Alternativt går det att använda Sarstedt-rör, se beskrivning på sidan 22. Suffixet (m) indikerar att vätskenivåupptäckt har optimerats för viskösa reagenser. 14. Öppna lådorna Eluate and Reagents och Assays. 15. Ladda den preparerade reagensadaptern i tillämplig skåra. Ange en satsstreckkod för analysen via List view (listvy) på skärmen Loading Reagents (Ladda reagenser). 16. Om du inte redan gjort det, placerar du testremserören i de förkylda RG-testremsorna 72, QS adapter (se tabell 18), och in i tillämplig(a) skåra(or). Tabell 18. Adaptrar och reagenshållare Ställ/reagenshållare Namn Antal som krävs Provställ Elution Microtube Rack QS 1 Reagenshållare Reagent holder 1 QS Reagent holder 2 QS 1 1 Analysställ RG Strip Tubes 72 QS 1 Beräknad för en analyskörning med 72 reaktioner. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

44 17. Om du inte redan har överfört elueringsstället till QIAsymphony AS (se steg 12 i reningsprotokollet, sida 35), placerar du elueringsmikrorören CL i det förkylda elueringsmikrorörställets kvalitetssäkrade adapter (se tabell 18) och den preparerade adaptern i den angivna skåran. För oberoende drift tar du bort elueringsstället från skåran på pekskärmen. Öppna därefter lådan Eluate i QIAsymphony SP och tag bort elueringsstället manuellt. För integrerad drift trycker du på Transfer för att överföra elueringsstället från skåra 1 i QIAsymphony SP till angiven skåra i QIAsymphony AS. 18. Ladda kasserbara filterspetsar i lådorna Eluate and Reagents och Assays enligt det antal som varje spetstyp kräver (se tabellerna 19 och 20). Ladda spetsställ med start med spetsskårorna 1, 2 och 3 i lådan Eluate and Reagents och ladda därefter spetsställ i spetsskårorna 7, 8 och 9 i lådan Assays. Tabell 19. Filterspetsar Konsumtionsvaror Filterspetsar, 1500 μl (1024) Filterspetsar, 200 μl (1024) Filterspetsar, 50 μl (1024) Namn på pekskärm 1500 μl 200 μl 50 μl Tabell 20. Konsumtion av konsumtionsvaror* Antal för 24 Antal för 72 Konsumtionsvara reaktioner reaktioner Filterspetsar, 1500 μl 5 6 Filterspetsar, 200 μl Filterspetsar, 50 μl Spetsavfallspåsar 1 1 * Den här tabellen ger exempel på konsumtion av konsumtionsvaror för en analyskörning med följande specifikationer: 19 eller 67 mallar, 4 analysstandarder, en eller ingen mallkontroll (NTC), prover med intern kontroll (IC), masterblandning preparerad av instrumentet. Konsumtion av filterspetsar kan påverkas av vissa processer på QIAsymphony AS (till exempel upptäckt av vätskenivå). 44 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

45 19. Stäng lådorna Eluate and Reagents och Assays. 20. När du har stängt var och en av lådorna, trycker du på Yes för att starta inventarieskanningen av respektive låda. Inventarieskanningen kontrollerar skårorna, adaptrarna, filterspetsarna och spetsrännan. Korrigera eventuella fel vid behov. 21. Tryck på Queue. Övervakning av avkylning startar. 22. Vänta tills målavkylningstemperaturerna har uppnåtts. När målkylningstemperaturerna har uppnåtts visas skårorna i grön färg. 23. Tryck på Run för att starta körningen. 24. När körningen är klar, trycker du på Remove (Ta bort) på skärmen Overview (Översikt) i analysinställningarna. Öppna lådan Assays och ladda ur analysstället/-ställen. 25. Ladda ned resultatet och cyklerfilerna. 26. Fortsätt till Protokoll: RT-PCR och dataanalys på Rotor-Gene Q, sidan Utför regelbundet underhåll på QIAsymphony AS under körningen av PCR på Rotor-Gene Q eller senare. För integrerad drift rengör du alla instrument mot slutet av det utförda arbetsflödet. Följ underhållsinstruktionerna i QIAsymphony SP/AS User Manual General Description. Kontrollera att du utför underhåll regelbundet för att minimera risken för korskontamination. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

46 Protokoll: RT-PCR och dataanalys på Rotor-Gene Q Viktiga saker att tänka på innan du startar Innan du startar förfarandet läser du Viktiga anmärkningar, sidorna Ta dig tid och bekanta dig med Rotor-Gene Q innan du startar protokollet. Se användarmanualen till instrumentet. Kontrollera att alla fyra kvantifieringsstandarder såväl som minst en negativ kontroll (vatten, grad av PCR) är inkluderade per körning PCR. Om du vill alstra en standardkurva använder du alla fyra kvantifieringsstandarder som levererats (HI Virus-1 QS 1 4) för varje körning av PCR. Förfarande 1. Stäng polymeraskedjereaktionsrören och placera dem i Rotor-Gene Q:s 72-brunnsrotor. Förvissa dig om att du överför de fyra testremserören i Rotor-Gene Q i rätt riktning, så att positionsangivelserna för avkylningsadaptern och rotorn stämmer överens. Kontrollera att låsringen (tillbehör till Rotor-Geneinstrumentet) är placerad överst på rotorn för att förhindra att rören öppnas av misstag under körningen. 2. Överför cyklerfilen från QIAsymphony AS till Rotor-Gene Q. 3. För upptäckt av HIV-1 RNA väljer du den fördefinierade temperaturprofilen artus HI Virus-1 QS-RGQ_V1 eller skapar en temperaturprofil enligt följande steg. Inställning av allmänna analysparametrar Figurer 7, 8, 9 Omvänd transkription av RNA Figur 10 Första aktivering av enzym med varmstart Figur 11 cdna-amplifiering Figur 12 Justering av fluorescenskanalsensitiviteten Figur 13 Start av körningen Figur 14 Alla specifikationer hänför sig till Rotor-Gene Q, programversion Mer information om hur du programmerar Rotor-Gene-Q-instrumenten hittar 46 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

47 du i användarhandboken till instrumentet. I bilderna är dessa inställningar inramade i svart fet stil. 4. Öppna först dialogrutan New Run Wizard (Ny körning av guide) (figur 7). Kontrollera rutan Locking Ring Attached (Låsring fäst) och klicka därefter på Next (Nästa). Figur 7. Dialogrutan New Run Wizard 5. Välj 50 för volymen PCR och klicka därefter på Next, (figur 8). Figur 8. Inställning av allmänna analysparametrar. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

48 6. Klicka på knappen Edit Profile (Redigera profil) i nästa dialogruta New Run Wizard, (figur 9), och programmera temperaturprofilen enligt bild i figurerna Figur 9. Redigering av profilen. Figur 10. Omvänd transkription av RNA. 48 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

49 Figur 11. Första aktivering av enzym med varmstart. Figur 12. cdna-amplifiering. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

50 7. Upptäcktsintervallet för fluorescenskanalerna måste fastställas enligt fluorescensintensiteterna i polymeraskedjereaktionsrören. Klicka på Gain Optimisation (Optimeringsvinst) i dialogrutan New Run Wizard, (se figur 9) för att öppna dialogrutan Auto-Gain Optimisation Setup (Inställningar av automatisk optimeringsvinst). Ställ in kalibreringstemperaturen på 50, så att den stämmer överens med amplifieringsprogrammets kyltemperatur (figur 13). Figur 13. Justering av fluorescenskanalens sensitivitet. 50 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

51 8. De vinstvärden som fastställs av kanalkalibreringen sparas automatiskt och anges i det sista menyfönstret i programmeringsförfarandet (figur 14). Klicka på Start Run. Figur 14. Start av körningen. 9. När du har startat körningen, redigerar du proven. Importera informationen från cyklerfilen genom att klicka på knappen ( Open ) (Öppna). 10. När körningen är klar analyserar du uppgifterna. Följande resultat (10a, 10b och 10c) är möjliga. Exempel på positiva och negativa PCR-reaktioner ges i figur 15 och figur 16. I tabell 21 finns riktlinjer för tolkning av kvantitativa resultat. 10a. En signal har upptäckts i fluorescenskanalen Cycling Green (grön återvinning). Analysresultatet är positivt: provet innehåller HIV-1 RNA. I det här fallet är upptäckten av en signal i kanalen Cycling Orange umbärlig, eftersom höga inledande koncentrationer av HIV-1 RNA (positiv signal i kanalen Cycling Green) kan leda till en reducerad eller fråvarande fluorescenssignal i den interna kontrollen i kanalen Cycling Orange (konkurrens). artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

52 10b. I fluorescenskanalen Cycling Green har ingen signal upptäckts. Gå samma gång syns en signal från den interna kontrollen i kanalen Cycling Orange. I provet upptäcks inget HIV-1 RNA. Det kan betraktas som negativt. Ifall RT-PCR för HI Virus-1 är negativ, utesluter den upptäckta signalen i den interna kontrollen möjligheten av en inhibition av RT-PCR. Om C T -värdet för den interna kontrollen av ett negativt prov emellertid är mer än tre cykler högre än C T -värdet för den interna kontrollen av kontrollen utan mall i körningen (C T IC-prov C T IC NTC >3), ska provet betraktas som ogiltigt. Det går inte att komma fram till några resultat. 10c. Ingen signal har upptäckts i kanalerna Cycling Green respektive Cycling Orange. Det går inte att komma fram till några resultat. Information om felkällor och deras lösning kan du hitta i Felsökningshandbok, sidan 54. Figur 15. Upptäckt av kvantifieringsstandarderna (HI Virus-1 RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green. NTC: Ingen mallkontroll (negativ kontroll). 52 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

53 Figur 16. Upptäckt av den interna kontrollen (IC) i fluorescenskanalen Cycling Orange med samtidig amplifiering av kvantifieringsstandarderna (HI Virus- 1 RG QS 1 4). NTC: Ingen mallkontroll (negativ kontroll). Tabell 21. Tolkning av kvantitativa resultat Resultat HIV RNA >76,4 IU/ml* HIV RNA <76,4 IU/ml* HIV RNA-negativt Tolkning Resultatet ligger inom det fastställda testområdet. Sannolikheten för detektion av HIV RNA är > 95 %. Det positiva testresultatet är statistiskt säkerställt. Resultatet ligger utanför det fastställda testområdet. Det positiva resultatets reproducerbarhet är inte säkerställt. Inget HIV-RNA detekterades. * Detektionsgräns. Se Analytisk sensitivitet, sidan 10. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

54 Felsökningshandbok Denna felsökningshandbok kan vara till hjälp för att lösa eventuella problem som uppstår. Mer information finns även på sidan Ledfrågor hos vårt tekniska supportcenter: Vetenskapsmännen på QIAGEN teknisk support svarar gärna på eventuella frågor du kan ha om antingen informationen och protokollen i denna handbok, eller om prov- och analysteknik (kontaktinformation: vänligen se baksidan eller besök Allmän hantering Felmeddelande som visas på pekskärmen Kommentarer och förslag Om ett felmeddelande visas under en protokollkörning, hänvisas till de användarhandböcker som levereras tillsammans med instrumenten. Precipitat i reagenstråg i en öppen patron i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit a) Buffertavdunstning Överflödig avdunstning kan leda till ökad saltkoncentration eller minskade alkoholkoncentrationer i buffertar. Kassera reagenspatron (RC). Förvissa dig om att täta bufferttrågen till en till viss andel använd reagenspatron (RC) med återanvändbara tätningsremsor, när dessa inte används för rening. 54 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

55 b) Förvaring av reagenspatron (RC) Kommentarer och förslag Förvaring av en reagenspatron (RC) under 15 C kan leda till bildning av precipitat. Vid behov avlägsnar du de tråg som innehåller bufferterna QSL2 och QSB1 från reagenspatronen (RC) och inkuberar i ett vattenbad* vid 37 C under trettio minuter med sporadiska omskakningar för att lösa upp precipitatet. Ersätt trågen i korrekta positioner. Om du redan har stuckit igenom reagenspatronen (RC), kontrollerar du att trågarna har stängts igen med återanvändbara tätningsremsor och inkuberar hela reagenspatronen (RC) i ett vattenbad* vid 37 C under trettio minuter med sporadiska omskakningar. Nukleinsyror med lågt utbyte a) Magnetiska partiklar suspenderades inte helt Innan du startar förfarandet, måste du kontrollera att magnetpartiklarna är helt resuspenderade. Vortex-blanda under minst tre minuter före användning. b) Frusna prover blandades inte korrekt efter tining c) Bärar-RNA (CARRIER) inte tillsatt d) Nedbrutna nukleinsyror Tina frusna prover med lätt omrörning för att garantera en noggrann blandning. Rekonstituera bärar-rna (CARRIER) i buffert AVE (AVE) och blanda med lämplig volym av buffert AVE (AVE) enligt beskrivning i Förberda bärar-rna (CARRIER)-buffert AVE (AVE)- blandningar med start på sidan 28. Upprepa reningsförfarandet med nya prover. Prover lagrades inkorrekt eller utsattes för för många frysnings-/tiningscykler. Upprepa reningsförfarandet med nya prover. * Förvissa dig om att du har kontrollerat, underhållit och kalibrerat instrumenten regelbundet enligt tillverkarens rekommendationer. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

56 Kommentarer och förslag e) Ofullständig provlys f) Tilltäppning av pipettspets på grund av olösligt material Kontrollera före användning att buffert QSL2 och QSB1 inte innehåller några precipitat. Vid behov avlägsnar du de tråg som innehåller bufferterna QSL1 och QSB1 från reagenspatronen (RC) och inkuberar under trettio minuter vid 37 C med sporadiska omskakningar för att lösa upp precipitatet. Om du redan har stuckit igenom reagenspatronen (RC), kontrollerar du att trågen har stängts igen med återanvändbara tätningsremsor och inkuberar hela reagenspatronen (RC) i ett vattenbad* vid 37 C under trettio minuter med sporadiska omskakningar i ett vattenbad.* Olösligt material avlägsnades inte från provet innan du startade reningsförfarandet QIAsymphony. Om du vill ta bort olösligt material för virustillämpningar centrifugerar du provet vid 3000 x g under 1 min och överför den överstående lösningen till ett nytt provrör. Ingen signal med positiva kontroller (HI Virus-1 RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green a) Den valda fluorescenskanalen för PCR dataanalys stämmer inte överens med protokollet För dataanalys väljer du fluorescenskanalen Cycling Green för den analytiska PCR för HI Virus-1 och fluorescenskanalen Cycling Orange för den interna kontrollen av PCR. b) Felaktig programmering av temperaturprofilen till rotorgeninstrumentet Jämför temperaturprofilen med protokollet. Se Protokoll: RT-PCR och dataanalys på Rotor- Gene Q, sidan 46. * Förvissa dig om att du har kontrollerat, underhållit och kalibrerat instrumenten regelbundet enligt tillverkarens rekommendationer. 56 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

57 Kommentarer och förslag c) Felaktig konfiguration av PCR d) Förvaringsvillkoren för en eller flera satskomponenter överensstämde inte med de instruktioner som gavs i Förvaring (sidan 6). e) Utgångsdatum för artus HI Virus-1 QS- RGQ kit har passerat Kontrollera att du har ställt in analysen korrekt och att du använde korrekt analysparameteruppsättning. Upprepa polymeraskerdjereaktionen vid behov. Se Protokoll: Analysinställningar på QIAsymphony AS, sidan 37. Kontrollera reagensernas förvaringsvillkor och utgångsdatum (se satsetiketten) och använd en ny sats vid behov. Kontrollera reagensernas förvaringsvillkor och utgångsdatum (se satsetiketten) och använd en ny sats vid behov. Svag eller obefintlig signal i den interna kontrollen för ett negativt plasmaprov som renats med hjälp av QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit i fluorescenskanalen Cycling Orange och samtidig frånvaro av signal i kanalen Cycling Green. a) Villkoren för PCR stämmer inte överens med protokollet Kontrollera villkoren för PCR (se ovan) och upprepa reaktionen med korrekt inställningar vid behov. b) PCR inhiberades Kontrollera att du använder den utvärderade isoleringsmetoden (se Protokoll: RNA-isolering på QIAsymphony SP, sidan 31) och följ instruktionerna noggrant. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

58 c) RNA förlorades under extraktion Om den interna kontrollen tillsattes i extraktionen, kan en frånvarande signal i den interna kontrollen tyda på att RNA gårr förlorad under extraktionen. Kontrollera att du använder den utvärderade isoleringsmetoden (se Protokoll: RNA-isolering på QIAsymphony SP, sidan 31) och följ instruktionerna noggrant. Se även Nukleinsyror med lågt utbyte, ovan. d) Förvaringsvillkoren för en eller flera satskomponenter överensstämde inte med de instruktioner som gavs i Förvaring (sidan 6). e) Utgångsdatum för artus HI Virus-1 QS- RGQ kit har passerat Kontrollera reagensernas förvaringsvillkor och utgångsdatum (se satsetiketten) och använd en ny sats vid behov. Kontrollera reagensernas förvaringsvillkor och utgångsdatum (se satsetiketten) och använd en ny sats vid behov. Signaler med de negativa kontrollerna i fluorescenskanalen Cycling Green i den analytiska PCR a) Kontamination inträffade under beredning av PCR Upprepa PCR med nya reagenser i replikat. Stäng polymeraskedjereaktionsrören om möjligt när du har tillsatt det prov som ska testas. Kontrollera med jämna mellanrum att arbetsytan och instrumenten är dekontaminerade. b) Kontamination inträffade under extraktion Upprepa extraktionen och PCR för det prov som ska testas med nya reagenser. Kontrollera med jämna mellanrum att arbetsytan och instrumenten är dekontaminerade. 58 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

59 Litteraturhänvisningar QIAGEN upprätthåller en stor och uppdaterad databas online med vetenskapliga publiceringar som använder QIAGEN-produkter. Med hjälp av omfattande sökalternativ kan du hitta de artiklar du behöver - antingen genom att ange en enkel lösenordssökning eller genom att specificera till exempel tillämpning, forskningsområde och rubrik. QIAGEN:s referensdatabas online på QIAGEN teknisk support eller den lokale återförsäljaren tillhandahåller en komplett lista med litteraturhänvisningar. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

60 Beställningsinformation Produkt Innehåll Kat.nr artus HI Virus-1 QS- RGQ Kit (24) För 24 reaktioner: 2 masters, 4 kvantifieringsstandarder, intern kontroll, vatten (polymeraskedjereaktionsgrad) artus HI Virus-1 QS- RGQ Kit (72) För 72 reaktioner: 2 masters, 4 kvantifieringsstandarder, intern kontroll, vatten (polymeraskedjereaktionsgrad) QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit för automatiserad rening av virusnukleinsyror eller patogen DNA från 1 96 prover. QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (96) QIAsymphony RGQ-system QIAsymphony RGQ, System För maximalt 96 beredningar á 1000 μl vardera: inkluderar två reagenspatroner och enzymställ plus tillbehör QIAsymphony SP, QIAsymphony AS, Rotor-Gene Q 5plex HRM, nödvändiga tillbehör och konsumtionsvaror, installation och utbildning. QIAsymphony SP/AS-instrument och tillbehör QIAsymphony SP QIAsymphony provberedningsmodul, 1års garanti på reservdelar och arbete QIAsymphony AS Sample Prep Cartridges, 8-well (336) 8-Rod Covers (144) Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym QIAsymphony provberedningsmodul, 1års garanti på reservdelar och arbete 8-brunnars provberedningspatroner för användning med QIAsymphony SP 8-stavars skydd för användning med QIAsymphony SP Avkylningsadapter för EMT-ställ, för användning med QIAsymphony SP/ASinstrument (programversion 3.1 eller högre) artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

61 Produkt Innehåll Kat.nr Reuse Seal Set (20) Återanvändbara tätningsuppsättningar för tätningar som till en del används för QIAsymphony-reagenspatroner Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym Elution Microtubes CL (24 x 96) Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (500) Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (500) Reagent Bottles, 30 ml, QSym AS (50) Filter-Tips, 1500 μl (1024) Andra röradapter (för 2 ml rör med skruvlock, rörinföring 3b) för användning med QIAsymphony SPrörbärare Icke-sterila polypropylenrör (0,85 ml maximal kapacitet, mindre än 0,7 ml förvaringskapacitet, 0,4 ml elueringskapacitet) i ställ med 96, inkluderar lockremsor. Adapter för att hålla 18 x 2 ml koniska rör och 6 x 5 ml koniska rör för användning med QIAsymphony SP/ASinstrument (programversion 3.1 eller högre) Adapter för att hålla 18 x 2 ml koniska rör, 2 x 5 ml koniska rör och 2 x reagensflaskor, 30 ml, för användning med QIAsymphony SP/AS-instrument (programversion 3.1 eller högre) Adapter för att hålla 18 remsor med fyra rör, för användning med QIAsymphony SP/AS-instrument (programversion 3.1 eller högre) Koniska rör (2 ml) för att hålla reagens, för användning med QIAsymphony AS Koniska rör (2 ml) för att hålla reagens, för användning med QIAsymphony AS Reagensflaskor (30 ml) med lock, för användning med QIAsymphony AS Kasserbara filterspetsar, i ställ (8 x 128). För användning med QIAsymphony SP * * * Kontrollera om produkten är tillgänglig. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

62 Produkt Innehåll Kat.nr Filter-Tips, 200 μl (1024) Kasserbara filterspetsar, i ställ (8 x 128). För användning med QIAcube och QIAsymphony SP Filter-Tips, 50 μl (1024) Kasserbara filterspetsar, i ställ (8 x 128). För användning med QIAsymphony AS Tip Disposal Bags (15) Rotor-Gene Q och tillbehör Rotor-Gene Q 5plex HRM System Spetsavfallspåsar för användning med QIAsymphony SP/AS-instrument Polymeraskedjereaktionscykler i realtid och analysator med högupplösningssmältning och fem kanaler (grön, gul, orange, röd och karmosinröd) plus HRM-kanal, laptopdator, program, tillbehör och ett års garanti på reservdelar och arbete Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Polymeraskedjereaktionscykler i realtid och analysator med högupplösningssmältning och fem kanaler (grön, gul, orange, röd och karmosinröd) plus HRM-kanal, laptopdator, program, tillbehör och ett års garanti på reservdelar och arbete (inkluderar installation och utbildning) 250 remsor för fyra rör och lock för 1000 reaktioner 10 x 250 remsor för fyra rör och lock för reaktioner Uppdaterad licensinformation och produktspecifika friskrivningsklausuler: se respektive QIAGEN-satshandbok eller användarhandbok. QIAGENsatshandböcker och användarhandböcker finns att tillgå på eller kan beställas från QIAGEN teknisk support eller från lokal återförsäljare. 62 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

63 Denna sida har med avsikt lämnats tom. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

64 Denna sida har med avsikt lämnats tom. 64 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

65 Denna sida har med avsikt lämnats tom. artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/

66 Denna sida har med avsikt lämnats tom. 66 artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit handbok 09/2010

67 I och med inköpet av denna produkt kan personen använda denna för diagnostiska tjänster för human in vitro-diagnostik. Inget allmänt patent eller annan licens av något slag förutom denna specifika användarrätt i och med inköpet beviljas härigenom. Varumärken: QIAGEN, QIAsymphony, artus (QIAGEN-grupp); Rotor-Gene (Corbett Research Pty Ltd). artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit är en CE-märkt diagnostisk sats enligt det europeiska in vitro-diagnostiska direktivet 98/79/EG. Ej tillgänglig i alla länder. Begränsat licensavtal Användningen av denna produkt utgör inköparens eller användarens samtycke till artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit enligt följande villkor: 1. Satsen artus HI Virus-1 QS-RGQ får endast användas i enlighet med handboken artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit och med de komponenter som ingår i denna sats. QIAGEN godkänner ingen licens enligt någon av dess immaterialrätt att använda eller inkorporera de ingående komponenterna i denna sats med någon komponent som inte ingår i denna sats enligt beskrivning i handboken artus HI Virus-1 QS-RGQ Kit och ytterligare protkoll som finns tillgängliga på 2. Förutom de uttryckligen angivna licenserna garanterar QIAGEN inte att denna sats och/eller användningen därav inte bryter mot tredje mans rättigheter. 3. Denna sats och dess komponenter har licensierats för engångsbruk och får inte återanvändas, renoveras eller säljas på nytt. 4. QIAGEN frånsäger sig specifikt alla andra licenser, uttryckliga eller underförstådda, bortsett från dem som uttrycligen uppgivits. 5. Inköparen och användaren av denna sats samtycker till att inte vidta eller tillåta att någon annan vidtar några steg som kan leda till eller underlätta några åtgärder som är förbjudna enligt ovan. QIAGEN kan verkställa förbuden i detta begränsade licensavtal i alla domstolar, och ska erhålla betalning för alla sina forsknings- och domstolskostnader, inklusive advokatarvoden, i alla åtgärder de tar för att verkställa detta begränsade licensavtal eller någon av dess immaterialrätter avseende satsen och/eller dess komponenter. För uppdaterade licensavtal: se QIAGEN, med ensamrätt.

68 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) Sample & Assay Technologies