Galleria mellonella som modellsystem för anrikning och identifiering av Francisella i miljöprover. Cecilia Ylinenjärvi

Transkript

1 Galleria mellonella som modellsystem för anrikning och identifiering av Francisella i miljöprover Cecilia Ylinenjärvi Examensarbete, 15 hp Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2017

2 Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinsk analytikerprogrammet Examensarbete, 15 hp Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson Examensarbetets engelska titel Galleria mellonella as a Model System for Enrichment and Identification of Environmental Strains of Francisella Handledare Johanna Thelaus och Eva Lundmark, Totalförsvarets forskningsinstitut, FOI Läraropponent: Examinator: Mari Norgren Ylva Hedberg Fransson Datum för godkännande:

3 Abstrakt Studier och identifiering av patogena bakterier i miljöprover begränsas ofta av mycket bakgrund som gör det svårt att särskilja virulenta från icke virulenta bakterier. Galleria mellonella, vaxmott, är en modellorganism som används för att undersöka bakteriers sjukdomsframkallande förmåga. Syftet med studien var att ta fram en metod där G. mellonella kan användas som modellsystem för anrikning av sjukdomsframkallande bakterier i miljöprover för att förbättra möjligheten till vidare analys och identifiering av bakterieart genom högupplösta sekvenseringsmetoder. Infektion med bakterien Francisella hispaniensis vid 37 C i G. mellonella indikerade att bakterien kunde tillväxa redan vid injicering av trettiotalet bakterier. Bakterietillväxt bekräftades genom realtids-pcr med primer GF1 och odling. Francisella endociliphora tenderade att vara mindre virulent, men odling visade på liten tillväxt vid 22 C. I studien utvärderades en ny primer (GF1) som är specifik för Francisella och som inkluderar nyligen identifierade stammar. Konklusionen var att det var möjligt att använda G. mellonella för anrikning av F. hispaniensis, medan den mer långsamväxande arten F. endociliphora inte anrikades i modellen. Anrikning av sjukdomsframkallande bakterier kan förbättra möjligheten till vidare analys av bakterieart som underlag för bedömning av risk för smitta. Primern GF1 fungerade för påvisning av Francisella och innebär en ny möjlighet att snabbt kunna screena bakterieinnehåll i komplexa miljöprover. Nyckelord Galleria mellonella, Francisella tularensis, anrikning, odling, realtids-pcr, primer GF1, miljöprover 3

4 Introduktion Galleria mellonella, vaxmott, har använts som modell för att undersöka virulensfaktorer och patogenes för olika bakterier. Andra modeller som Drosophila melanogaster och Caenorhabditidis elegans har också använts för att studera bakteriers virulensförmåga, men det finns vissa begränsningar med dessa modeller. Fördelar med G. mellonella är bland andra att larven är lätthanterlig på grund av dess storlek i förhållande till D. melanogaster och C. elegans. Larvens immunsystem är väl utvecklat och består av både humoralt och cellulärt immunförsvar. Larven har också förmåga att leva vid temperaturer motsvarande kroppstemperatur (37 C) hos människor. Mer avancerade modeller som möss och gerbiler kräver stora resurser i form av regelrätt djurhållning och relativt stora ekonomiska medel, medan användning av G. mellonella inte kräver några etiska tillstånd och medför låga kostnader (1, 2). Studier har visat att G. mellonella i vissa fall skulle kunna fungera som ersättare för försöksdjur då utfallet visat på stora likheter med studier där däggdjursmodeller använts (1). Formaterat: UmU Rubrik1 Francisella tularensis är en gramnegativ aerob bakterie som kan orsaka tularemi (harpest) hos människor. Infektionen kan beroende på smittväg ge upphov till olika symptom som sår och svullna lymfkörtlar i anslutning till såret, influensaliknande symptom som kommer plötsligt och lunginflammation. F. tularensis är en vektorburen zoonos och kan smitta dels genom insekter som myggor men också genom kontakt med smittade djur eller djur som avlidit av infektion. Smittan kan även spridas via aerosol eller i vissa fall via vatten och livsmedel (3). Det finns olika underarter av Francisella tulariensis vilka kan delas in i Typ A och Typ B. Francisella tularensis ssp. tularensis (Typ A) identifieras som högvirulent och pneumoniassocierad sjukdom med denna typ är förknippad med 80 % dödlighet om infektionen inte behandlas (4). Typ A-stammar har genom historien använts som biologiskt vapen (3, 4) och hantering med denna typ av agens måste ske i laboratorium med riskklass 3 (3). Stammar tillhörande Typ A förekommer främst i Nordamerika (5). 4

5 Underarten Francisella tularensis ssp. holarctica (Typ B) förekommer över hela norra halvklotet. Utbredning av F. tularensis Typ B i Sverige är störst i Norrland och sjukdomsutbrott orsakade av dessa stammar varierar från år till år. Dödligheten hos människor med infektion av F. tularensis Typ B är låg (6) och bakteriestammarna kan hanteras i laboratorium med riskklass 2 (3). Ett exempel på en Typ-Bstam som studerats i modellorganismen G. mellonella är Francisella tularensis holarctica live vaccin strain (F. tularensis LVS). Studien visade att det kan vara möjligt att använda F. tularensis LVS som alternativ till högpatogena stammar (4). Moderna identifieringstekniker har medfört att kunskapen om diversiteten av Francisella i miljön har ökat. Det är därför viktigt att de metoder som används för identifiering av sjukdomsframkallande stammar, F. tularensis Typ A och Typ B, har hög specificitet. Vid studier och analys av patogena ämnen i miljöprover är identifiering genom odlingstekniker ofta begränsad då sådana typer av prov innehåller mycket bakgrund. Istället baseras analys av patogena bakterier i miljöprover ofta på molekylära metoder som till exempel polymerase chain reaction (PCR). PCR är en metod som används för att amplifiera deoxiribonukleinsyra (DNA) i ett prov, vilket sker med primers. Primrarna är designade att känna igen en specifik nukleinsyrasekvens och tillämpning av olika temperaturprogram medför att DNA kan amplifieras vid optimala förhållanden. Vid realtids-pcr, eller kvantitativ PCR, kan DNA-sekvensen detekteras antingen genom fluorescerande molekyler bundna till en probe eller genom fria molekyler. Den vanligaste typen av probe är TaqMan-probe. TaqMan-proben är inmärkt med en reporter (flourofor) i 5 -änden och en quencher i 3 -änden. När amplifiering av målsekvensen sker binder proben in till den eftersökta DNA-sekvensen och proben hydrolyseras av Taq-polymeraset. Den exciterade reportern kan därmed detekteras av instrumentet. Mängden amplifierat DNA är proportionell mot fluorescenssignalen, genom detta kan kvantifiering av nukleinsyrainnehållet i provet ske och 5

6 reaktionen kan analyseras i realtid. Med realtids-pcr kan man undersöka om en viss DNA-sekvens finns i provet och kvantifiera mängden (7). En analysmetod som används för identifiering av DNA-innehåll i ett prov är Next generation sequencing (NGS). NGS är ett exempel på en nyligen utvecklad metod som används för att analysera hela genomet hos en organism. Det finns dock vissa begränsningar med NGS, som till exempel sekvensering av regioner i arvsmassan som har högt innehåll av guanin och cytosin (8). Third generation sequencing (TGS) är också en vidareutveckling inom sekvensering. TGS baseras på nanoporeteknik och har hög specificitet, är snabb, kan analyseras i realtid och kan användas där tillgång till laboratorieutrustning är begränsad (9). De nya sekvenseringsmetoderna har inneburit att flertalet nära släktingar till F. tularensis kunnat definieras eller omdefinieras. Ett exempel på detta är Francisella hispaniensis som tidigare klassificerats som Francisella tularensis ssp. novicida, men med de nya teknikerna har man sett att dessa stammar skiljer sig åt och F. hispaniensis klassificeras idag som en egen underart (10). Francisella endociliphora är också en nyligen identifierad underart till F. tularensis som lever i symbios med ciliater (11). Syftet med studien var att ta fram en metod där G. mellonella kan användas som modellsystem för anrikning av sjukdomsframkallande bakterier i miljöprover för att förbättra möjligheten till vidare analys och identifiering av bakterieart genom högupplösta sekvenseringsmetoder. 6

7 Material och metoder Bakteriestammar och organismer Formaterat: UmU Rubrik1 Bakteriestammar från FOI Francisella Strain Collection (FSC) användes i studien Francisella tularensis holarctica live vaccin strain (LVS) (FSC458), Francisella hispaniensis (FSC454) (10) och Francisella endociliphora (FSC1006) (11). Larver av Galleria mellonella, vaxmott (Vivara, Göteborg, Sverige) förvarades i kyl (14⁰C) och larver av likvärdig storlek valdes ut till försöken. Odling All odling av bakterier gjordes på modified Thayer-Martin-agar (12) med antibiotika; 50 µg/ml ampicillin, 100 µg/ml polymyxin B och 25 µg/ml vancomycin, om inte annat anges. Vid odling av F. tularensis LVS och F. hispaniensis inkuberades materialet på agarplattor i 37⁰C (5 % CO2) och avlästes efter fem respektive två dygn. F. endociliphora odlades i rumstemperatur och avlästes efter en vecka. Vid beräkning av CFU tillämpades två olika metoder viable count förenklad metod eller klassisk metod. Vid viable count klassisk metod gjordes en tiofaldig spädningsserie i NaCllösning (0,9 %) av bakteriesuspensionen i eppendorfrör. En volym applicerades sedan på runda agarplattor och fördelades jämnt över hela plattan med plastinös, plattorna inkuberades sedan vid angivna förhållanden. För beräkning av CFU räknades antal bakteriekolonier på plattor med bakteriekolonier. Vid viable count förenklad metod späddes proverna i mikrotiterplatta med 96 brunnar. I första raden tillsattes ursprungssuspensionen av provet och späddes därefter i NaCllösning (0,9 %) i tiofaldig spädningsserie. Multikanalpipett användes och innehållet blandades väl genom att pipettera upp och ner minst tio gånger mellan varje spädning. Med hjälp av multikanalpipett togs 1 µl ur vardera brunnen innehållande lägst koncentration och applicerades på den fyrkantiga 7

8 agarplattan. Därefter applicerades proverna med näst lägsta koncentration. Detta upprepades för samtliga koncentrationer. Plattan inkuberades under angivna förhållanden och CFU beräknades utifrån högsta spädningsfaktor som medförde synlig tillväxt av minst en bakteriekoloni. Realtids-PCR PCR-mix beräknad till 25,0 µl för varje brunn; 12,5 µl PerfeCTa qpcr toughmix (Quanta Bioscience, Beverly MA, USA), 0,625 µl forward primer (20 pmol/µl), 0,625 µl reverse primer (20 pmol/µl), 0,5 µl probe (5 pmol/µl), 9,7 µl H2O och 1,0 µl templat. Positiv kontroll (preparerad DNA från LVS; 1 µg/ml) och negativ kontroll analyserades också. Primerpar (med probe) som användes var; GF1 forward primer 5 -AAC TGG CTG ACC TTC AGC AT-3 (Eurofins Genomics, Ebersberg, Tyskland), GF1 reverse primer 5 -GTG GTC GTG GTA AAG CTG GT-3 (Eurofins Genomics) med GF1 probe 5 -TEX-CCG ATT AGG CTT TCT GCT ACT TCA CGA-BHQ2-3 (Eurofins Genomics). ISFtu2 forward primer 5 - CCC TGA TTT ACA AGA AGT C-3 (Eurofins Genomics), ISFtu2 reverse primer 5 - CTT GGT TAT CAT CTT TAT CAT ATC-3 (Eurofins Genomics) med probe 5 - TEX-TGA TTC AAC AAT AGC AAG AGC ACA T- BHQ2-3 (Eurofins Genomics). Vid analys med internkontroll tillsattes 0,625 µl IPC forward primer 5 -GGG CGA ATC ACA GAT TGA ATC-3 (Invitrogen, Waltham MA, USA), 0,625 µl IPC reverse primer 5 -GCG GTT CCA AAC GTA CCA A-3 (Invitrogen), 0,5 µl IPC probe 5 -VIC-TTT TTA TGT GTC CGC CAC CAT CTG GAT C-BHQ1-3 (Invitrogen) och 1 µl internkontroll sälherpes (HPV) (2,5 x 10 5 CFU/mL). Samtliga prover analyserades med PCR-instrumentet CFX96 Real-time system (Bio-Rad, Solna, Sverige) med PCR-program; 95 C i tre min, (95 C i tre sek, 60 C i 30 sek) x 45 cykler. Annealingtemperatur för primer GF1 En gradient för temperaturintervallet 55,0-66,0 C programmerades på PCR-instrumentet Biometra T-Gradient (Biosite, Täby, Sverige). Smältpunkt från tillverkaren av GF1 8

9 forward primer var 57,3 C respektive 59,4 C för GF1 reverse primer. Tolv temperaturer beräknades med smältpunkternas temperaturer i mitten av intervallet, vilket gav gradienterna; 50,0, 50,4, 51,5, 53,2, 55,1, 57,0, 58,9, 60,8, 62,7, 64,5, 65,6 och 66,0 C. PCR-program; 95⁰C i tre min (95⁰C i fem sek, gradient i 30 sek, 72⁰C 30 sek) x 35, 72⁰C i 20 sek. PCR-mix beräknad till 25,0 µl för varje brunn tillreddes enligt beskrivning ovan. Två olika serier med templat från F. hispaniensis samt F. tularensis LVS testades. Templaten utgjordes av bakteriesuspensioner i H2O för respektive stam innehållande ca 6,0 x 10 8 bakterier/ml beräknat genom mätning av OD på instrumentet Biowave CO8000 (WPA, Somerset, Storbritannien), vid 600 nm. Produkten kontrollerades genom gelelektrofores (1 % agaros (Lonza, Walkersville MD, USA) 0,01 % GelRed (Bioticum, Fremont, Kanada), 1xTEA (Tris-EDTA-Acetic acid). PCRprodukt från vardera gradienten samt negativ kontroll blandades med loading buffer och 2 µl applicerades i respektive brunn, molekylviktsstandard 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen) applicerades med lika volym. En spänning (120 V) lades på gelen under ca 60 min. Gelen fotograferades under UV-ljus. Standardkurva med kända bakteriekoncentrationer i larvhemolymfa En standardkurva av stigande bakteriekoncentration i larvhemolymfa gjordes för respektive bakteriestam F. tularensis LVS, F. hispaniensis och F. endociliphora. En bakteriesuspension tillverkades genom att bakteriekolonier från agarplatta späddes i NaCl-lösning (0,9 %) till den önskade koncentrationen 1,0 x 10 9 bakterier/ml. Bakteriekoncentrationen uppskattades genom mätning av OD. Friska larver dränerades på hemolymfa och samlades i ett eppendorfrör. En volym av bakteriesuspensionen (1,0 x 10 9 bakterier/ml) sattes till första röret med hemolymfa och späddes därefter i tiofaldig spädningsserie. En spädningsserie i intervallet 10 8 till 10 1 bakterier/ml erhölls. Viable count bestämdes för ursprungssuspensionen med bakterier som tillsattes till första röret för spädningsserien genom förenklad metod i fyra replikat samt klassisk metod. Spädningsserien förvarades därefter i frys (-80⁰C) i väntan på analys. Formaterat: UmU Rubrik1, Radavstånd: enkelt 9

10 Standardkurvorna (F. tularensis LVS, F. hispaniensis och F. endociliphora) analyserades med realtids-pcr i duplikat med primer GF1 samt internkontroll. Standarkurvan för F. tularensis LVS analyserades även i triplikat med primer GF1 mot ISFtu2 samt internkontroll. Standardkurvorna späddes 1/10 i H2O innan tillsats som templat i PCR-mix. Formaterat: UmU Rubrik1 10

11 Infektion av larver En bakteriesuspension späddes i NaCl (0,9 %) till den önskade koncentrationen 1,0 x 10 9 bakterier/ml. Bakteriesuspensionen späddes därefter i tiofaldig spädningsserie i NaCl (0,9 %) och utgjorde infektionslösningarna för försöket. Viable count enligt klassisk metod gjordes för den ursprungliga bakteriesuspensionen (1,0 x 10 9 bakterier/ml). Fem försöksgrupper om tio larver (G. mellonella) placerades i petriskålar. En obehandlad kontrollgrupp, NaCl-behandlade (0,9 %) larver samt larver med infektionsdos 10 4, 10 6 och 10 8 bakterier/ml. Behandlingsdosen injicerades med volymen 10 µl med steril insulinspruta i larvens bakre vänstra proleg. Larverna inkuberades och kontrollerades en gång/dygn och protokoll fördes genom att notera om larven övergått till puppstadium eller om larven avlidit, samt status vid avslut av försöket. En larv räknades som avliden när den melaniserat eller inte kunde vända tillbaka från ryggläge. Vid dränering av hemolymfa när larven avlidit eller övergått till puppstadium under försökets gång användes sax för att klippa i larvens nedre del och hemolymfan samlades i ett eppendorfrör. Bestämning av viable count i slutstadiet gjordes på hemolymfa från larver med infektionsdosen 10 6 bakterier/ml förenklad metod i duplikat eller klassisk metod. Rören med hemolymfa från samtliga försökslarver förvarades i frys (-80 C) innan analys med realtids-pcr. Larver infekterades med F. hispaniensis och inkuberades i 37 C under nio dagar och kontrollerades en gång/dygn. Försöket upprepades två gånger. Erhållen hemolymfa från båda infektionsförsöken med F. hispaniensis samt material från försökskontrollerna från försök 1 analyserades med realtids- PCR i duplikat med primer GF1. Samtliga prover späddes 1/10 i H2O innan tillsats som templat. Vid mycket liten volym erhållen hemolymfa tillsattes ytterligare H2O provet för möjliggörande av analys. Viable count (klassisk metod) för ursprungssuspensionen vid infektionstillfället beräknades till 3,9 x 10 8 CFU/mL för försök 1 respektive 8,0 x 10 9 CFU/mL för försök 2. 11

12 Larver infekterades med F. endociliphora och inkuberades vid 37 C respektive 22 C. Försöken kontrollerades under nio respektive åtta dagar. Vid försökets avslut poolades hemolymfa från kvarvarande larver. Hemolymfa från en avliden larv (37⁰C) med infektionsdos 10 6 bakterier/ml på försökets sista dag odlades direkt på agarplatta utan spädning. Även den poolade hemolymfan från larver med infektionsdos 10 8 bakterier/ml från infektionsförsöket odlades på samma sätt. De rör med poolad hemolymfa från infekterade larver som inkuberades i 22⁰C odlades direkt på agarplatta utan spädning. Plattorna inkuberades därefter enligt angivna förhållanden. Viable count (klassisk metod) för ursprungssuspensionen vid infektionstillfället beräknades till 1,6 x 10 8 CFU/mL för försöket som inkuberades vid 37⁰C respektive 1,2 x 10 8 CFU/mL för försöket som inkuberades vid 22⁰C. Sammanställning av data Samtliga sammanställningar av data gjordes i Microsoft Office Excel. Standardavvikelse beräknades genom funktionen STDAV i programmet. Etiska överväganden Galleria mellonella omfattas inte av etiska föreskrifter och därmed krävs inga etiska tillstånd för användning av organismen. 12

13 Resultat Jämförelse av två olika metoder för viable count Formaterat: UmU Rubrik1 För att uppskatta känsligheten i den förenklade metoden för viable count jämfört med den klassiska metoden jämfördes CFU genererat genom de olika metoderna. Viable count för bakteriesuspensionen som användes vid beredning av respektive standardkurva (kända bakteriekoncentrationer i larvhemolymfa) användes vid jämförelsen. CFU för bakteriesuspensionen med F. tularensis LVS beräknades till 5,8 x 10 8 CFU/mL med viable count klassisk metod och 10 9 CFU/mL genom förenklad metod. F. hispaniensis beräknades till 1,79 x 10 9 CFU/mL respektive CFU/mL. F. endociliphora beräknades till 1,9 x 10 8 CFU/mL respektive 10 9 CFU/mL. Känslighet i larvhemolymfa vid användning av primer GF1 Vid analys av standardkurvorna (larvhemolymfa med känd mängd Francisella) med realtids-pcr och primer GF1 kunde inga Ct-värden detekteras för CFU < 19. Känsligheten för primern GF1 varierade vid analys av de olika bakteriestammarna. Detektionsgränsen sattes till Ct-värde 28 (Fig. 1). Vid jämförelse av GF1 och ISFtu2 med standardkurvan F. tularensis LVS som templat visade att ISFtu2 amplifierade målsekvensen vid Ct-värde 20,96 och GF1 amplifierade målsekvensen vid motsvarande koncentration vid Ct-värde 27,43. Detta mönster sågs ner till 58 CFU. Standardavvikelsen var störst för ISFtu2 och GF1 vid låga CFU per reaktion. Högsta Ct-värde erhölls vid 0,58 CFU för ISFtu2 respektive 58 CFU för GF1 (Fig. 2). Ct-värden kunde detekteras för internkontrollen i samtliga brunnar vid analys av standardkurvorna, lägst värde i brunnen med positiv kontroll och högre värden för brunnar med material från standardkurvorna (data visas ej). Optimering av annealingtemperatur för primer GF1 13

14 F. hispaniensis och F. tularensis LVS testades för annealingtemperaturerna 55,0-66,0⁰C. PCR-produkten kunde storleksbestämmas genom gelelelektrofores och ett band mellan kb detekterades. Den eftersökta sekvensen var 125 kb och bandets intensitet var ungefär lika för samtliga brunnar. Ett svagare band kunde ses i den brunn med F. tularensis LVS som amplifierats vid annealingtemperatur 66,0 C (Fig. 3). Infektion av G. mellonella med F. hispaniensis Samtliga larver med infektionsdos 10 8 bakterier/ml hade fallit bort försöksdag tre, samtliga larver med infektionsdos 10 7 och 10 6 bakterier/ml dag fyra, samtliga larver med infektionsdos 10 5 bakterier/ml dag fem och nio av tio larver med infektionsdos 10 3 bakterier/ml dag sex, varav en avled försöksdag nio, och nio av tio larver med infektionsdos 10 4 bakerier/ml dag åtta samt en som levde vid försökets avslut. Sammantaget hade 59 av 60 infekterade larver fallit bort inom tidsramen för försöket där dag ett avser infektionsdagen (Fig. 4). Infektionsvolymen i respektive larv var 10 µl och motsvarade ungefär 39 bakterier per larv i försöksgruppen med lägst infektionsdos. Viable count för ursprungssuspensionen vid infektionstillfället beräknades till 3,9 x 10 8 CFU/mL för försök 1 respektive 8,0 x 10 9 CFU/mL för försök 2. Beräkning av viable count för larver med infektionsdos 10 6 och 10 5 bakterier/ml visade att 19 av 20 larver innehöll bakterier (7,1 x 10 7 till CFU/mL). Analyserat material med realtids- PCR från samtliga försökslarver visade att % av larverna som infekterats var positiva för Francisella (Fig. 5). Ct-värden < 28 betraktades som positiva utifrån standardkurvan för F. hispaniensis (Fig. 1). Erhållna Ct-värden vid analys av NaClbehandlade och obehandlade larver från försök 1 gav Ct-värden > 41,8 för uppsamlat material från fem larver (data visas ej). Infektion av G. mellonella med F. endociliphora Av de infekterade larverna som inkuberats vid 37⁰C var det en larv med infektionsdos 10 5 bakterier/ml som föll bort dag sju och en dag nio, odling av hemolymfan gav ingen tillväxt. Vid 14

15 försökets avslut levde alla larver med infektionsdos 10 7 bakterier/ml, åtta larver med infektionsdos 10 5 bakterier/ml samt fyra med infektionsdos 10 3 bakterier/ml (Fig. 4). Odling av poolad hemolymfa från larver med infektionsdos 10 7 bakterier/ml vid försökets avslut gav ingen tillväxt. En mörk zon kunde ses från det område där hemolymfan hade placerats för att sedan fördelas med plastinös. Viable count för ursprungssuspensionen var 1,6 x 10 8 CFU/mL. Av de infekterade larverna som inkuberats i 22 C var det en larv med infektionsdos 10 7 bakterier/ml som avled under försökets gång (Fig. 4). Odling av den poolade hemolymfan 10 5 bakterier/ml visade 8,8 x 10 3 CFU/mL och poolad hemolymfa för 10 7 bakterier/ml visade 8,55 x 10 3 CFU/mL. En mörk zon kunde ses från det område där hemolymfan hade placerats från början för att sedan fördelas med plastinös. Ingen tillväxt av bakterier kunde ses inuti den mörka zonen. Viable count för ursprungssuspensionen var 1,2 x 10 8 CFU/mL. Den verkliga infektionsdosen (viable count) avvek från den förväntade koncentrationen för försöksuppställningen. Detta togs till hänsyn vid presentation av data i resultatdelen. 15

16 Diskussion Den här studien visade att det var möjligt att använda G. mellonella som anrikningsmodell av Francisella inför vidare identifiering genom högupplösta metoder. Stora skillnader kunde ses mellan infektion med F. hispaniensis och F. endociliphora och hur dessa växte i larven. En ny primer som är specifik för Francisella möjliggör en snabb screening av potentiella smittsamma prover, samtidigt som den kan användas för att detektera icke patogena Francisella-stammar. Ett pilotförsök med en förenklad metod för viable count kan ge möjlighet att odla större provmängder, vilket annars kan vara ett problem vid större försöksuppställningar. Formaterat: UmU Rubrik1 Infektion med F. hispaniensis medförde att 59 av 60 larver som infekterats föll bort inom tidsramen för försöket. Infektionsdosen tycktes påverka utfallet då larver med infektionsdos 10 8 bakterier/ml avled i högre takt än de med 10 4 bakterier/ml. I likhet med en studie där infektion med F. tularensis LVS studerats visade att tidpunkten larven avled på berodde på antalet injicerade bakterier (4). Larver som infekterats med lägst infektionsdos, 10 3 bakterier/ml, motsvarade en infektionsdos med ungefär 39 bakterier per larv. Detta tydde på att det endast krävdes trettiotalet injicerade bakterier för att bakterierna skulle kunna tillväxa i modellen. Men för att utvärdera om larven avled av infektion och inte av någon annan anledning bör överlevnadsanalys vid olika infektionsdoser göras. Att en larv fallit bort av annan anledning kan exempelvis bero på att larven blivit till puppa, att larven torkat eller att larven skadats i samband med infektionstillfället. Beräkning av CFU för larver med infektionsdos 10 6 och 10 5 bakterier/ml bekräftade tillväxt av bakterier. Även analys med realtids-pcr visade att andelen Francisella-positiva larver var hög. Det gick dock inte att kvantifiera mängden bakterier i enskilda larver med realtids-pcr eftersom standardkurvan endast täckte in lägre bakteriekoncentrationer. För att bestämma CFU i enskilda larver bör en ny standardkurva med högre bakteriekoncentrationer användas. Vidare försök kommer göras för att möjliggöra statistisk analys. 16

17 Infektion med F. endociliphora visade att bakterierna tenderade att inte överleva i modellen vid inkubation vid 37⁰C. Odling av den poolade hemolymfan från försöksdagens avslut visade att det endast fanns bakterier i de larver som inkuberades vid 22 C, men eftersom det odlade materialet kom från flertalet larver kunde inte CFU i enskilda larver beräknas. F. endociliphora analyserades inte med realtids-pcr eftersom bestämning av CFU för den poolade hemolymfan inte indikerade tillräcklig tillväxt för analys med realtids-pcr. Upptäckt och isolering av stammen F. endociliphora gjordes i samband med analys av endosymbionter i ciliater (11) och en möjlig orsak till att F. endociliphora tenderade att vara mindre virulent i larven kan vara att bakterien kan leva i symbios med sin värd och därför inte orsakar skada. För vidare utvärdering av infektion med F. endociliphora skulle fler försök behöva genomföras. Förslagsvis med längre försöksperiod för att kunna studera om bakterierna kan tillväxa i modellen eller om larvens immunförsvar tar hand om infektionen. En begränsning med längre försöksperiod kan vara att larver hinner utvecklas till puppa under försökets gång. Jämförelse av olika metoder för bestämning av viable count visade att det fanns en skillnad i känslighet mellan metoderna. Försöken visade att bestämning av CFU med förenklad metod beräknades till en tiopotens högre än motsvarande baserat på klassisk metod. För att utvärdera hur stor variationen är mellan metoderna bör fler jämförelsetest genomföras, men vid frågeställningar där ett grövre mått på bakteriekoncentrationer är tillfredsställande skulle den förenklade metoden kunna vara ett alternativ. Fördelar med den förenklade metoden är att mindre förbrukningsmaterial behövs och flera prover kan med fördel spädas samtidigt. Det är av större vikt att göra en mer precis bestämning av CFU vid beredning av exempelvis standardkurvor och infektionslösningar, i dessa fall bör viable count klassisk metod tillämpas. Eftersom OD endast är en uppskattning av bakteriekoncentrationen med avseende på absorbans finns flertalet felkällor som kan påverka resultatet. För att bättre kunna karakterisera primer GF1 undersöktes detektionsgränsen för F. tularensis LVS, F. hispaniensis och F. 17

18 endociliphora i larvhemolymfa. Inga resultat (Ct-värden) kunde erhållas vid CFU < 19 motsvarande Ct 37,73 i larvhemolymfa (standardkurvorna). Därför användes detektionsgränsen Ctvärde > 28 för primer GF1 vid analys av dessa provtyper. Ett prov med Ct-värde över 28 tolkades som negativt. Högre koncentrationer och eventuellt fler replikat av stammarna bör analyseras för att erhålla en standardkurva som täcker in ett större referensområde för att utgöra ett bättre underlag för kvantitativ analys. Primer ISFtu2 har tidigare använts för att analysera Francisella tularensis Typ A och Typ B i prover med mycket bakgrund som exempelvis vatten och myggor (14). Målsekvensen för ISFtu2 är ett repetitivt element vilken återfinns i många kopior i bakteriegenomet, detta har medfört att primern varit effektiv att använda. Målsekvensen för ISFtu2 finns däremot inte i F. hispaniensis. För att kunna analysera F. hispaniensis och andra stammar som inte tillhör F. tularensis har primer GF1 utvecklats. Primer GF1 amplifierar en sekvens som återfinns hos alla kända Francisella-arter, Typ A- och Typ-B-stammar, F. hispaniensis med flera (data visas ej, under utveckling). Jämförelse av ISFtu2 och GF1 i den här studien visade att primer GF1 var mindre känslig än ISFtu2 vid analys av F. tularensis LVS i hemolymfa. Skillnaden i Ct-värde var ungefär sex cykler, vilket motsvarade cirka hundra bakterier (Fig. 2). Troligen berodde skillnaden på att målsekvensen för ISFtu2 finns i ett större antal kopior hos F. tularensis LVS än målsekvensen för GF1 i samma bakterie. Resultaten i denna studie tydde på att primer GF1 fungerade där bakterieantalet var tillräckligt högt, det vill säga där målsekvensen fanns i detekterbara mängder. Vid test av annealingtemperatur för GF1 mot F. tularensis LVS och F. hispaniensis erhölls ett band av ungefär lika intensitet vid samtliga temperaturer (Fig. 3). Ett svagare band kunde ses vid 66 C med F. tularensis LVS. Detta kan ha berott på felkällor som exempelvis att gelen var skadad, eller att appliceringsmängden i brunnarna varit olika. För att utvärdera resultatet noggrannare bör upprepning av försöket göras. 18

19 Genom att inkludera en intern kontroll, IPC, i PCR-reaktionen kan ett mått på PCR-reaktionens funktion erhållas och därigenom ge information om något inhiberar reaktionen. Vid analys av larvhemolymfa erhölls höga Ct-värden för den interna kontrollen, jämfört med analys av positiv kontroll. Den positiva kontrollen innehöll endast renat DNA från F. tularensis LVS. Detta kan tyda på någon form av inhiberande faktor i hemolymfan. Ytterligare spädning av proverna innan analys med realtids-pcr kan vara en möjlig parameter att utvärdera, dock begränsas denna möjlighet av att känsligheten för GF1 i nuläget är låg vid detektion av små mängder DNA. Ett alternativ skulle kunna vara att testa smältkurveanalys SYBRGreen (7), men en begränsning med denna metod är att resultatet har lägre specificitet jämfört med probbaserad realtids-pcr (användes i denna studie). Annealingtemperatur och PCReffektivitet var troligen inte orsaken till lägre känslighet hos GF1-primern jämfört med ISFtu2. Skillnaden i känslighet beror sannolikt på antalet repetitioner av målsekvensen i bakteriegenomet, men vidare validering av GF1 bör göras innan generaliserande slutsatser kan dras. G. mellonella har använts som försöksmodell i flertalet tidigare studier. Ett exempel på detta är en studie där både larver och möss infekterats med Francisella philomiragia (13). Resultatet visade att infektion med bakterien var dödlig i båda modellerna. I studien föreslås att F. philomiragia skulle kunna användas som alternativ för de mer virulenta stammarna, speciellt vid studier av vanligt förekommande Francisella-stammar i miljöprover. F. philomiragia är en underart till F. tularensis och kan hanteras i laboratorium med riskklass 2. För utvärdering av infektion med F. hispaniensis och F. endociliphora i andra försöksmodeller, som exempelvis möss, behöver vidare studier göras. En källa till variation i studier av G. mellonella är att organismen ofta beställs från en utomstående leverantör och det är därför svårt att kontrollera larvernas tillväxtförhållanden. Exempel på detta är att larvens egen bakterieflora varierar med avseende på vilken föda de får (1). Ett annat exempel som kan medföra variation mellan studier kan vara att larverna är olika 19

20 långt utvecklade i larvstadiet. I fall där larver hunnit utvecklas till puppa är det tänkbart att larven innehåller färre bakterier i slutstadiet än om de hade fått inkuberas under en längre tid. En begränsning med analys med realtids-pcr är att metoden endast kan amplifiera målsekvensen och kvantifiera den. Med nyare sekvenseringstekniker som till exempel NGS kan all DNA i provet analyseras och en identifiering av provinnehållet kan göras (8). I miljöprover förekommer flertalet bakteriearter och för att selektera sjukdomsframkallande bakterier, som F. tularensis Typ A och Typ B, ifrån icke virulenta stammar är det användbart med en anrikningsmodell. G. mellonella skulle kunna vara en sådan modell. Erhållet material kan sedan användas för vidare analys och identifiering genom sekvenseringstekniker. Med en fungerande metod kan modellsystemet G. mellonella förbättra förmågan att bedöma risk för smitta då larven skulle kunna fungera som ett alternativ till djurförsök för att påvisa virulens. Sammanfattningsvis visade resultatet i denna studie att det fanns stora skillnader i hur bakterierna tillväxte i G. mellonella beroende på vilken Francisella-stam som larverna infekterats med. F. hispaniensis tenderade att tillväxa inuti modellen och infektionsdosen tycktes påverka hur snabbt larven avled efter infektionstillfället. Förekomst av Francisella i hemolymfan i slutstadiet kunde bekräftas genom realtids-pcr (primer GF1) och odling. Däremot indikerades ingen eller mycket liten tillväxt av F. endociliphora i larven. Vid anrikning av mer långsamväxande arter som F. endociliphora är det möjligt att bakterien inte kan tillväxa i modellen. Vidare studier bör göras för utvärdering av F. endociliphora. Konklusionen var att det var möjligt att använda G. mellonella för anrikning av F. hispaniensis, medan den mer långsamväxande arten F. endociliphora inte anrikades i modellen. Sådan anrikning av sjukdomsframkallande bakterier kan förbättra möjligheten till vidare analys av bakterieart som underlag för bedömning av risk för smitta. Primern GF1 fungerade för påvisning av Francisella och innebär en ny 20

21 möjlighet att snabbt kunna screena bakterieinnehåll i komplexa miljöprover. 21

22 Tack tillägnas Jag vill rikta ett stort tack till mina handledare Johanna Thelaus och Eva Lundmark för bra handledning och för att de med gott tålamod har svarat på frågor som uppkommit under arbetets gång. Formaterat: UmU Rubrik1 Formaterat: Radavstånd: exakt 18 pt 22

23 Referenser 1. Cook SM, McArthur JD. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 2013;4(5): Formaterat: UmU Rubrik1, Ingen numrering 2. Giannouli M, Palatucci AT, Rubino V, Ruggiero G, Romano M, Triassi M, Ricci V et al. Use of larvae of the wax moth Galleria mellonella as an in vivo model to study the virulence of Helicobacter pylori. BMC Microbiol. 2014;(14): Folkhälsomyndigheten. Säkerhetsdatablad smittämnen Francisella tularensis biosakerhet/sakerhetsdatablad-francisella-tularensis.pdf ( ). 4. Aperis G, Burgwyn Fuchs B, Anderson CA, Warner JE, Calderwood SB, Mylonakis E. Galleria mellonella as a model host to study infection by the Francisella tularensis live vaccine strain. Microbes Infec. 2007;9(6): Farlow J, Wagner DM, Dukerich M, Stanley M, Chu M, Kubota K, Petersen J et al. Francisella tularensis in the United States. Emerg Infect Dis. 2012;11(12): Folkhälsomyndigheten. Sjukdomsinformation om harpest. ( ). 7. Referensmetodik Klinisk mikrobiologi. Realtids-PCR. PCR ( ). 8. Behjati S, Tarpey PS. What is next generation sequenicing? Arch Dis Child Educ Pract Ed. 2013;98(6):

24 9. Lu H, Giordano F, Ning Z. Oxford nanopore minion sequencing and genome assembly. Genomics Proteomics and Bioinformatics. 2016;14(5): Huber B, Escudero R, Busse HJ, Seibold E, Scholz HC, Anda P, Kämpfer P et al. Description of Francisella hispaniensis sp. nov., isolated from human blood, reclassification of Francisella novicida (Larsson et al. 1955) Olsufiev et al as Francisella tularensis subsp. novicida comb. nov. and emended description of the genus Francisella. Intern J System Evol Microbiol. 2010;60: Schrallhammer M, Schweikert M, Vallesi A, Verni F, Petroni G. Detection of a novel subspecies of Francisella noatunensis as endosymbiont of the ciliate Euplotes raikovi. Micro Ecol. 2011;61(2): Sandström G, Tärnvik A, Wolf-Watz H, Löfgren S. Antigen from Francisella tularensis: nonidentity between determinants participating in cell-mediated and humoral reactions. Infect Immun. 1984;45(1): Propst CN, Pylypko SL, Blower RJ, Ahmad MM, Hoek ML. Francisella philomiragia infection and lethality in mammalian tissue culture cell models, Galleria mellonella, and BALB/c Mice. Front Microbiol. 2016;7: Lundström JO, Andersson AC, Bäckman S, Schäfer ML, Forsman M, Thelaus J. Transstadial transmission of Francisella tularensis holarctica in mosquitoes, Sweden. Emerg Infect Dis. 2011;17(7): Lauri A, Mariani PO. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes Nutr. 2009;4(1):1-12. Formaterat: UmU Rubrik1 24

25 Figur 1. Ct-värden erhållna med analys med realtids-pcr (primer GF1). Standardkurvorna F. tularensis LVS, F. hispaniensis samt F. endociliphora är analyserade i duplikat (F. endociliphora punkt (19; 37,73) är beräknad utifrån ett Ctvärde) och CFU är beräknat utifrån antalet CFU/reaktion. 25

26 Figur 2. Ct-värden erhållna med analys med realtids-pcr. Jämförelse av primer ISFtu2 och GF1 för standardkurva F. tularensis LVS analyserat i triplikat. Felstaplarna anger standardavvikelse. CFU är beräknat utifrån antalet CFU/reaktion. Analys med ISFtu2 punkt (0,58; 43,12) baseras på två Ct-värden. 26

27 Figur 3. PCR-produkt från respektive gradient 55,0-66,0⁰C innehållande templat från bakteriesuspension med F. tularensis LVS samt F. hispaniensis analyserade med GF1. K; negativ kontroll, S; molekylviktsstandard 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen). 27

28 3 5 7 A Dag ag Dag Figur 4. Överlevnadsdiagram för infektion av G. mellonella med olika infektionsdoser (bakterier/ml); A) Infektion med F. hispaniensis 37 C, B; Infektion med F. endociliphora 37⁰C och C) Infektion med F. endociliphora 22⁰C (försöket avslutades dag åtta). Dag ett avser dagen för infektionstillfället. B C

29 Figur 5. Andel Francisella-positiva larver; Ct-värde < 28 i slutstadiet. Erhållen hemolymfa från totalt 60 larver (tio larver per infektionsdos) infekterade med F. hispaniensis analyserades i duplikat med realtids-pcr (primer GF1). Ctvärde < 28 beräknades som positivt (värdena baseras på medelvärdet) baserat på detektionsgränsen vid analys av standardkurvan för F. hispaniensis. Formaterat: UmU Rubrik1, Radavstånd: enkelt 29