Strukturbiokemi NMR Göran Karlsson Inst. för Kemi och Biovetenskap, Avd. Moleklär bioteknik, Chalmers Svenskt NMR-centrum vid Göteborgs Universitet NMR-spektroskopi eciterat tillstånd h g = E = h n - N = N e E kt grundtillstånd massa g laddning spinn X-ra UV IR EPR NMR l(m) n(h) - - -9-8 -6-5 -4-3 -2 - -7 6 5 4 3 2 9 8 7 9 C-C RT 8 kärnor g ( 7 rad/s T) % n H 26.7 99.9 5 MH 3 C 6.7. 25 5 N -2.7.4 5 3 P.8 99.9 2 spinn = /2 magnetiskt moment udda masstal H, 3 C, 5 N, 9 F... E (T) n (MH) H.7 5 4. 6 8.8 8 2. 9 spinn, /2 magnetiskt moment elektriskt moment jämnt masstal, udda antal av resp kärnpartikel
Modeller kvantmekanisk modell vektormodell spinntillstånd B m nettomagnetisering Pulser (vektormodell) m Pulsens längd och intensitet avgör hur mcket m roterar. Rotationen är ortogonal mot magnetfältet och pulsriktning. hv m 9 8 Pulser (kvantmodell) m 8 hv -m populationsinvertering
Pulser (kvantmodell) hv m 9 m -m populationsutjämning och faskoherens Relaation T 2 entropisk transversell spinn-spinn -e -t/t 9 T förlorad koherens entalpisk longitudinell spinn-omgivning termisk jämvikt kemiskt skift H - C Bindningen förmedlas av elektroner som skärmar det ttre magnetfältet,. Kärnan känner ett effektivt magnetfält B eff. d + d - H - N d H - + O d- s = -B eff d (ppm)= n -n eff n Frekvens är olämpligt att mäta, då den är maskinberoende. Istället mäts det kemiska skiftet,d, i miljondelar (ppm) relativt en referenssubstans, TMS.
- - en vanlig aminosra Phe H N Ha O - N - C a - C - H H-C b-h I e - B ind H d(ppm) HN 6- Ha 4-6 Hb 3-4 Hg 2-3 CH3-2 aro 6-8 Ringströmmen inducerar ett magnetfält som förstärker det eterna magnetfältet utanför ringen. fouriertransform H A - C - C - H B sin 2pn A t FT sin 2pn B t FT -n n B teckenproblem -n A n A FT - diskret Fouriertransform, numerisk metod fouriertransform Roterande magnetisering genererar en ström. Summan av alla signaler genererar en FID (Free Induction Deca) teckenproblem t= sin 2pn A t i enhetscirkel t=t -n A n A
- fouriertransform Diskret datainsamling längs &-ael t= sin 2pn A t t=t teckendiskriminering t=t samplingshastighet avgör spektralvidd SW = 2DW terminologi SW = spectral width DW = dwell time NP = number of data points AT = NP * DW Resolution a NP -n A n A SW DW SW = 2DW (Nquist) t=t, 2t, 3t sammanfattning FT-NMR hn m FT -m t= DW Diskret datasampling tpiskt 24 (2 ) eller 248 punkter sw ~ 5 H DW = µs AT =,2 s T T 2
- - FID och spektrum D NMR spektrum FT av FID sinus steg fönsterfunktion relaation fasfel t faskorrigering DW för stor - vikning
- 7-7 - Utbte (Echange) En väteatom befinner sig i två olika omgivningar, A långsam, summa k e << n k e >> n A B A B n n A A B A B k e B snabb, medelvärde B A,B kemiskt skift H H I lösning sker en snabb reorientering av moleklen. Om alla orienteringar är lika troliga är rörelsen isotrop. Det kemiska skiftet blir ett medelvärde av alla möjliga enskilda kemiska skift. H I fast fas föreligger också alla orienteringar, men utan medelvärdesbildning. D pulsprogram hn m -m t= DW Relaationsväntetid Puls Datainsamling ~ s ~ µs ~ ms t
D pulsprogram t Relaationsväntetid Puls Datainsamling ~ s ~ µs ~ ms Protonens resonansfrekvens mäts under t D pulsprogram t Relaationsväntetid Puls Datainsamling ~ s ~ µs ~ ms D pulsprogram t Protonens resonansfrekvens mäts under t Under t sker en diskret sampling Signal, S(t ), amplitudmodulerad i tidsdomänen t Fouriertransform gör S(t ) => S(w ), frekvensdomän
2D pulsprogram t Protonens resonansfrekvens mäts under.. Under sker en diskret sampling, men t är en punkt... 2D pulsprogram t t + t t +2 t t +3 t S(t, ) 2D pulsprogram t m 9 t = 9
2D pulsprogram t m 9 t 9 = 9 t =t + t 9 m 9 t =t +2 t 9 m 2D pulsprogram t t + t t +2 t t +3 t Protonens resonansfrekvens mäts under t och Under t och sker en diskret sampling Signal, S(t, ), amplitudmodulerad i tidsdomäner t och Fouriertransform gör S(t, ) => S(w, w 2 ), två frekvensdomäner DW 2D data DW FT FTFTFTFT FT t FTFT FT t FTFTFTFT w w 2
Magnetiseringsöverf verföringring J-koppling genom binding ( 3) COSY TOCSY correlated spectroscop total correlated spectroscop NOE genom rmden (< 5Å) NOESY nuclear overhauser effect spectroscop J-koppling Magnetiska dipoler på kärnor kan påverka varandra och ge upphov till förändringar i kemiskt skift. Effekten överförs genom överlapp av elektronorbitaler och påverkas starkt av lokal geometri och därför antal bindingar. H A - C - C - H B H A - C - C - H B 3 J AB d A d B d A d B J-koppling J-koppling förmedlas genom bindningar. Antalet bindningar bör vara 3. 2 J HH 2-5 H 3 J HH 2-2 H J CH 3 H J NH 9 H H N Ha O - N 9 - C a 55 - C - 35 H-C b-h
Heteronukleär r NMR H magnetiserings överföring N t N F H F2 NOE nuclear Overhauser effect överförs genom rmden och är en tidsberoende intensitetsförändring i ett sstem av dipolärt kopplade signaler. H A.8-5 Å r H B -e -t/t NOE är starkt avståndsberoende, r -6, och är effektiv på avstånd mellan.8 och 6Å. NOESY CH 3 -N H CH 3 - CH 3 H b -N H H a -N H H a - H a aromat H 2 OF N H -N H smmetri H 2 O F2