Utvärdering intereferensmodulerad flödescytemetri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta 1 av 6 Svenskt Vatten Utveckling Sökande Johan Bengtsson, Vattenchef Organisation Trollhättan energi, medsökande: Göteborg stad (Kretsloppskontoret och Göteborg Vatten), Norrvatten och Vivab Projektledare Johanna Samuelsson Adress Box 933 46129 Trollhättan Tfn 0725195200 Fax 0520497640 E-post johanna.samuelsson@trollhattanenergi.se Ansökans titel Utvärdering av interferensmodulerad flödescytometri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta Projektets kostnad totalt 2,55 Mkr Sökes hos SV-Utveckling 1 Mkr Övriga finansiärer 1,55 Mkr Sökes hos övriga finansiärer 10 Mkr Vinnova Utmaningsdriven innovation för Online sensorsystem för resurseffektiv vattenhantering Projektstart (år/mån) 121015 Slutdatum (år/mån) 141015 Sammanfattning av projektet Projektet syftar till att utvärdera en mätteknologi för snabb detektion av fekal påverkan på råvatten för att förhindra vattenburen smitta samt jämföra styrkor och svagheter med etablerade enzymatiska teknologier. Mätteknologin är ett nytt sätt att mäta flödescytometri och baserar sig på interferensmodulering av ljus vilket möjliggör detektion av enstaka mikroorganismer och analys av större provvolym. I en förlängning har denna mätteknologi potential att anpassas även till specifik detektion av mikroorganismer (kryptosporidium) och virus. I projektet möts dricksvattenproducenter med stor kunskap från branschen och forskare/ingenjörer med stort mättekniskt kunnande. Ett samarbete särskilt intressant eftersom det utgår från kompetens som vattentjänstbranschen normalt inte samarbetar med, men som med förståelse för behoven kan hjälpa branschen att hitta lösningar från andra teknikområden. Vilken nytta kan projektets resultat ha för andra än sökanden? En snabb detektion av fekal påverkan på råvattnet för att förhindra vattenburen smitta är mycket intressant både för dricksvattenproducenter men också för samhället i övrigt då man kan förhindra kostsamma utbrott av sjukdom. Projektledare
25-12 Trollhättan energi, Johanna Samuelsson Utvärdering intereferensmodulerad flödescytemetri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta 2 av 6 Bakgrund: Inom ramen för ett VINNOVAfinansierat projekt (A-projekt inom Utmaningsdriven Innovation) har aktörer från VA-branschen, industri samt forskningsinstitut och universitet diskuterat behov av onlinemätningar för vattenkvalitet och tidiga varningssystem. Två områden har pekats ut som speciellt viktiga för övervakning av dricksvatten: Mikroorganismer/Mikrobiell smitta och Olja/petroleumprodukter. Ett varningssystem föreslås bestå av två steg: 1. Tidig varning: Snabb detektion och kommunikation att något har hänt. 2. Identifikation: Analysera art och omfattning inom minuter till någon timme efter varningen. En ansökan till VINNOVAs Utmaningsdriven Innovation B-projekt tar ett helhetsgrepp på resurseffektiv och säker vattenhantering både för råvatten och industriellt vatten. I denna ansökan till SVU söker vi finansiering specifikt för området mikrobiell smitta och utvärdering av en lovande mätteknik. Inom ramen för ett projektsamarbete med University of Dehli, Indien, har Imego tagit fram en enkel och känslig mätmetod baserad på flödescytometri för diagnos av TBC på Indiska landsbygden. Denna mätmetod har mycket hög känslighet för detektion av mikroorganismer och en stor potential både i sig själv men också som dellösning i ett mätsystem för tidig varning för mikrobiell smitta i råvatten. Känsligheten i kombination med den låga kostnaden möjliggör ett flertal mätpunkter för att skapa en bättre överblick av omfattning och ursprung. I detta projekt kommer vi att utvärdera denna mätmetod för vattentillämpning och utföra tester på råvatten. Tack vare sin enkelhet och känsliga detektion av mikroorganismer bedömer både vi och vattenbranschen att denna teknologi har stor potential som ett tidigt varningsystem för mikrobiell smitta. SVUs rapport Tidiga förvarningssystem- Är det något för våra kommuner från 2009 ger en mycket bra överblick över använding av tidiga förvarningssystem i Sverige och utomlands. I Sverige ligger Göteborg och Göta Älv långt framme vad gäller onlinemätningar. Man mäter här såväl traditionella vattenkvalitets parametrar som ph, konduktivitet, temperatur och turbiditet som bakterier. Bakteriedetektionen tar ca 12 h och det vore önskvärt med en betydligt snabbare detektion. Prognosmodellen Seatrack och doftbänkar är andra förvarningssystem som används. Vi vet att det pågår utveckling av andra tekniker för tidigt mikrobiell varning och onlineanalys. I jämförelse med några av det andra tekniker vi känner till har den mätteknik vi föreslår flera fördelar, i första skede kan den på enkelt och snabbt (inom minuter) sätt ge information om mikrobiell påverkan men också genom smart fluidik och val av molekylära prober utvecklas för specifik analys av omfattning och art. Interferens-modulerad flödescytometri Metoden baseras på flourescens-taggade antikroppar som specifikt märker in bakterierna, och instrumentet är byggt för att räkna enstaka bakterier i ett kontinuerligt provflöde. För att undvika de extrema krav på mekaniska toleranser som en traditionell flödescytometer för med sig så har två olika metoder tagits fram där provflödet har en större tvärsnittsyta: dels en variant där optisk interferens används för att skapa ett strukturerat excitationsmönster som tidsmodulerar signaturen från varje partikel (se Figur 1), och dels en variant med ett högupplöst digitalt mikroskop utnyttjats för att rumsligt isolera partiklar från bakgrund.
25-12 Trollhättan energi, Johanna Samuelsson Utvärdering intereferensmodulerad flödescytemetri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta 3 av 6 Figur 1. Interferensmodulerad flödescytometer principskiss. Figur 2. Mätuppställning: Interferens- respektive digitalt mikroskop metoden. I interferensmodulerad flödescytometri detekteras inmärkta partiklar genom att mäta emissionsljuset med en känslig och snabb detektor. När en partikel (mikroorganism) passerar genom excitationsfältet så omvandlas det rumsliga mönstret till en tidsvarierande oscillation. Den interferens-baserade metoden har flera fördelar; dels uppnås ett mycket stort fokaldjup eftersom interferensmönstret sträcker sig över hela den volym där laserstrålarna överlappar, och dels så finns möjlighet att särskilja olika typer av partiklar genom att montera flera detektorer med olika emissionsfilter och/eller vinkel mot provet. Denna metod ställer krav på lågfluorescerande material i mätkammaren, exempelvis glas av hög renhetsgrad. Glas är även fördelaktigt ur rengöringssynpunkt. Vi ser denna teknik som ett utmärkt val för att analysera relativt stora provvolymer med möjlighet att räkna enstaka mikroorganismer. Syfte och Mål: Syftet är att utvärdera interferensbaserade flödescytometri för tillämpning som snabb tidig varning, steg ett, för mikrobiell smitta. Målsättningen är en betydligt snabbare metod än vad som existerar i dagsläget vad gäller detektion av fekal påverkan. Utvärderingen inkluderar följande delmål: Delmål 1: Tydlig testplan som tagits fram tillsammans med referensgrupp. Delmål 2: 1:a version av mätuppställning klar. Delmål 3: Genomförda och utvärderade tester i lab enligt Delmål 1. Delmål 4: 2:a version av mätuppställning klar för fältmässiga förhållanden. Delmål 5: Genomförda tester i fält enligt Delmål 1. Delmål 6: Slutlig utvärdering Rapport där resultat redovisas och Plan för implementering
Utvärdering intereferensmodulerad flödescytemetri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta 4 av 6 Metod: Projektstyrning: Projektledning: Johanna Samuelsson (Trollhättan energi) Referensgrupp: Lena Blom (Kretsloppskontoret), Olof Bergstedt (Göteborg vatten), Lars Sandblom (Trollhättan energi), Anna Johnsson (Trollhättan energi), Kristina Dahlberg (Norrvatten), Alexander Keucken (Vivab), Thomas Pettersson (DRICKS Chalmers). Teknisk grupp: Koordinator Linda Olofsson (Acreo IMEGO), Dag Ilver (Acreo IMEGO), Teresita Qvarnström (Acreo NANO), Tommy Schönberg (Acreo NANO), Per Björk (Acreo NANO) Referensgruppen står för utvärderingen och agerar kravställare och rådgivare till den tekniska gruppen. Referensgruppen bidrar till utforming av tester, deltar i tester i fält samt bidrar till slutlig rapport och plan för implementering. Möten mellan projektledning, referensgrupp och tekniskgrupp sker minst fyra gånger per år. I början av projektet sker tätare möten i utformning av tester för att säkerställa relevans och utvärdering. Projektledare och den tekniska gruppen har månatliga avstämningar. Vid fälttester deltar representanter från referensgruppen. Testplan: Tydlig plan för labtester och fälttester tas fram tillsammans med referensgrupp. Kravspecifikation utarbetas och förslag på (icke-patogena) mikrobiella kontaminanter som troligtvis uppträder tillsammans med patogena kontaminanter som därigenom kan användas som markörorganismer (bakterier, E-Coli, jämför Göteborg Vattens teknologi i dagsläget). Detta skulle resultera i ett ickepatogent modellsystem som både är praktiskt under utvecklingsarbetet och är relevant som indikator för patogena kontaminationer. Vad gäller inmärkning behöver vi tillsammans med referensgruppen sammanställa önskade specificiteter, relevanta detektionsnivåer etc. Mätuppställning: För vattenmätningar så behövs en fluidiklösning där utformningen väljs för att passa ett större volymflöde, och hänsyn måste också tas till excitationsvåglängd samt detektionsgeometri och mekanisk monteringsmetod. Önskade specificiteter och relevanta detektionsnivåer kopplas till tillgängliga molekylära prober (antikroppar) och bidningsbuffert (blockering för att minimera falska positiva) samt möjligen även excitationsljuskälla och emissionsfilter anpassas. Justering av algoritmer och mjukvaran för att identifiera och räkna partiklar samt partikelräkning i realtid kan underlätta mätningar. Inför ett fälttest så skall uppställningen göras mekaniskt mer robust så att de optiska komponenterna hålls stadigt på plats. Tester och utvärdering lab: Tester i labmiljö ger oss möjlighet att karakterisera systemet under kontrollerade former och får en referenspunkt för kommande fälttester. Provtagning av råvatten kan ske på två olika sätt: batchvis respektive kontinuerlig analys. Vid batchvis analys tas ett prov ur ett flöde som blandas med en reagens och därefter analyseras. Vid kontinuerlig analys leds en liten del av flödet in till sensorsystemet där vätskan blandas med reagens och därefter analyseras. Fördelen med kontinuerlig analys är den mycket korta detektionstiden, men nackdelen är en högre reagensförbrukning. En möjlig kombination av dessa två analysmetoder är att kontinuerligt detektera förekomsten av partiklar som initierar provtagning och analys. Imego har välutrustade lab med nödvändigt infrastruktur för tester och utvärdering: våtlab, lab för bakterieodling, mikroskop samt optiska instrument.
Utvärdering intereferensmodulerad flödescytemetri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta 5 av 6 Tester och utvärdering fält: Exakt var och hur fälttester ska genomföras beskrivs i testplanen som utarbetas i början av projektet tillsammans med referensgruppen. Primärt finns ett förslag på Göta älv, Mälaren och Ätran. Resultatet från fälttesterna jämförs med labförsöken samt med analysresultat från Göteborg vattens tillämpningar med enzymatiska metoder för E. coli (Colifast från Colifast AS och Colilert från Idexx) samt flödescytometri för kontroll av avskiljning med mikroalger som surrogatorganismer. Utvärdering kommer att ske med avseende på parametrar såsom tid, känslighet, robusthet och enkelhet. Slutlig utvärdering -Rapport och Plan för implementering: Projektet avslutas med en beskrivande rapport som redovisar resultat från utvärdering och en implementeringsplan för råvattenövervakning. Utvecklingsmöjligheter efter avslutat projekt: -Multianalytdetektion: använding av flera ljuskällor/våglängder kan möjliggöra detektion av flera (patogena) organismer i ett och samma prov. -För att virusdetektion skall vara möjlig i flödescytometri krävs att viruspartiklar orsakar klustring av de fluorescenta nanopartiklarna som då bär antikroppar eller funktionella receptorer för virusets vidhäftningsprotein. För detektion måste klustren uppnå en viss storlek. En sådan utveckling innebär att koppla relevanta halter av virus som skall kunna detekteras (kunskap som tas fram inom VISK projektet) till klustringsmöjligheter. -Anpassning detektion av ultralåga nivåer (t ex Cryptosporidium). Koncentrering kan bli nödvändig före analys, t ex elektrostatisk eller filtrering. Modifiering av bindningsbuffert och anpassning av provet för att optimera antikropparnas funktion (Salinitet/jonstyrka) kan också behövas. Kostnadssammanställning och plan för finansiering: Tidsåtgång: Acreo IMEGO Acreo NANO Referensgrupp Delmål 1: Testplan 80 70 Delmål 2: 1:a mätuppställning 250 130 10 Delmål 3: Labtest 350 100 50 Delmål 4: 2:a mätuppställning 150 75 10 Delmål 5: Fälttest 200 120 Delmål 6: Rapportering 75 20 100 Acreo enligt projektgrupp ovan. Timkostnad 950 kr, inkluderar tillgång till lab och infrastruktur. Kostnader ksek (reducering av timtaxa inräknad): Acreo IMEGO Acreo NANO Referensgrupp Tekniskt arbete 880 260 140 Lab, infrastruktur etc 50 1 Teknisk koordinering 150 Rapportskrivning 70 20 100 Förbrukningsmaterial 20 10 Projektmöten 50 30 140 Resor 30 30 70 Investeringar 0 0 0 1 Tillgång till specifik utrustning.
Utvärdering intereferensmodulerad flödescytemetri som tidigt varningssystem för mikrobiell smitta 6 av 6 SUMMA 1200 400 450 Finansiering: Organisation Summa SVU 1000 ksek Trollhättan energi 200 ksek (100 ksek + 100 ksek egentid referensgrupp+tekniskt arbete) Kretsloppskontoret och Göteborg vatten 100 ksek (egentid referensgrupp+tekniskt arbete) Norrvatten 200 ksek (100 ksek + 100 ksek egentid referensgrupp+tekniskt arbete) Vivab 100 ksek (egentid referensgrupp+tekniskt arbete) Swedish ICT 400 ksek Imego, Acreo 500 ksek (reducering av timtaxa) Chalmers DRICKS 50 ksek (egentid referensgrupp) Tidsplan Arbete Uppstart Testplan Mätuppställning Halvårsrapport Tester lab och utvärdering Halvårsrapport Tid 2012 2013 2014 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Mätuppställning fälttester Halvårsrapport Tester fält och utvärdering Plan för implementering Slutrapport Projektet löper över två år och börjar med att ta fram en tydlig testplan. Parallellt ordnas mätuppställning och därefter utförs tester och utvärdering i lab. Inför fältstudierna kommer testplanen att uppdateras och mätuppställningen att göras mekaniskt mer robust. Fältstudierna påbörjas under andra året och löper fram till slutfasen av projektet. Projektresultaten summeras och presenteras i en slutrapport till SVU, tillsammans med en plan för implementering av metoden i råvattenövervakning.