Betalningssystem för sporer. Hur användbara och tillförlitliga är sporanalyserna?

Rapport nr 4941 Lund 1994-12-29 Betalningssystem för sporer. Hur användbara och tillförlitliga är sporanalyserna? Inger Andersson och Anders Christiansson Svensk Mjölk Forskning Telefon 771-1919. E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

SMR-5417/A-94 reg.nr 4941 Lund 1994-12-29 Betalningssystem för sporer. Hur användbara och tillförlitliga är sporanalyserna? Inger Andersson och Anders Christiansson SAMMANFATTNING Sporanalyser utförs för smörsyrajäsande klostridier och Bacillus cereus med rör(mpn)- metodik i leverantörmjölk. De använda metoderna är enkla och kan användas för att sortera ut leverantörer med höga sporhalter. Effekterna av ett analyssystem där man använder rör för analysen av sporer är ganska svåra att förstå för den oinvigde. Resultaten i en enstaka analysomgång kan vid vissa sporhalter tyckas förvillande slumpmässiga. I denna rapport rekapituleras den grundläggande statistiken runt sannolikheterna att få olika analysutslag vid olika sporhalter. Det demonstreras tydligt att analyssystemens uppläggning är sådan att leverantörer med mycket höga sporhalter i i stort sett alltid detekteras, samtidigt som leverantörer med låga eller mycket låga sporhalter ej riskerar att få utslag i analysen. Leverantörer med måttliga sporhalter kan ibland få utslag i analysen, men förekomsten av utslag är proportionell mot sporhalten och ger därför meningsfulla signaler om mjölkkvaliteten. Olika varianter av analyssystem och deras begränsningar och tillförlighet i olika tänkta betalningssystem beskrivs. Analysutslag vid olika sporhalter visas i kurvor och tabeller för system som innebär grundanalys + konfirmering, kontinuerlig uppföljning vid höga sporhalter och i olika system där rullande analysresultat används i avdragssystemet. Möjligheter att öka effektiviteten genom skärpning i avdragssystem beskrivs. Exempel ges både för analys av smörsyrasporer och Bacillus cereus.

2 Betalningssystem för sporer. Hur användbara och tillförlitliga är sporanalyserna? Inledning Inger Andersson och Anders Christiansson Smörsyrasporer och Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölken utgör ur produktteknisk synpunkt kvalitetsbegränsande faktorer vid tillverkning av ost respektive k-mjölk. Av denna anledning har metodik tagits fram av SMR för att i mjölkbedömningen kunna påvisa höga halter av dessa sporer. 1989 påbörjades ett projekt vid namn "Sporer i mjölk" där syftet var att pröva hur effekten av sporanalyser kopplade till rådgivning, och i ett senare skede kvalitetsbetalning, påverkar leverantörmjölkens innehåll av klostridie- och B. cereus-sporer. I projektet ingick mejeriföreningar från såväl södra och mellersta som norra Sverige. En lägesrapport presenterades 1992 (1). Vid detta tillfälle hade en av de deltagande föreningarna infört betalningssystem för klostridier. Sedan dess har sporbetalningssystem införts för klostridiesporer i flertalet mejeriföreningar och även för B. cereus i en mejeriförening. I samband med införandet av betalningsreglerna har det från lantbrukarhåll framförts synpunkter och farhågor angående analyssystemets tillförlitlighet. Flera föreningar har infört eller kommer att införa nya mjölkkvalitetsregler där man vill att såväl klostridiesporer som B. cereus-sporer ska ingå i betalningssystemet. Effekterna av ett analyssystem där man använder rör för analysen av sporer är ganska svåra att genomskåda för den oinvigde. Resultaten i en enstaka analysomgång kan tyckas förvillande slumpmässiga. För att ge en bättre förståelse för hur analyssystemen fungerar på längre sikt presenteras nedan några exempel på analysutfall ur statistisk synpunkt vid olika sporhalter och med olika tänkta betalningssystem. Syftet med denna rapport är att ge bl.a. medlemschefer ökad förståelse för systemen och ett ge ett underlag för att kunna värdera olika systemlösningar i förhållande till den egna mejeriföreningens kvalitetsprogram. Analysmetodik På grund av att sporhalterna i mjölken är låga i förhållande till totalantalet bakterier är det inte möjligt att analysera sporer med hjälp av bakterieräkningsprovet. I stället används rörmetoden (MPN-metoden) som bygger på att man anrikar och påvisar förekomst av sporbildare i större volymer mjölk i rör. För analys av klostridier används 3 rör med 1 eller 2 ml mjölk i varje rör. B. cereus-analysen utförs ofta med 6 rör med vardera 4 ml mjölk för psykrotrofa stammar. Anledningen till att man använder större volymer är att man vill kunna mäta lägre halter av B. cereus än klostridier. Genom att betingelserna i rören görs sådana att tillväxt av organismerna gynnas kan man få de ursprungligen låga halterna att öka, så att man kan påvisa förekomst eller frånvaro av organismen. För analys av klostridier använder man särskilda rör, där man kan påvisa om sporer förekommer med hjälp av den gasbildning som organismerna orsakar (1). Vid B. cereus-analys låter man organismen tillväxa i mjölken, varefter en droppe mjölk överföres till blodagar, där man efter inkubering kan påvisa om B. cereus fanns i röret (2). Med denna metodik kan man bara påvisa om någon spor förekommer i den mjölkvolym man analyserar. I ett visst intervall, när man har ungefär en spor per rör, kommer givetvis slumpen att spela stor roll för utslaget. Med hjälp av statistiska tabeller är det dock möjligt skatta den sannolika sporhalten i mjölken om flera rör med samma eller olika volymer analyseras. Teorin och statistiken kring MPN-metoder har tidigare redovisats utförligt (3). MPN-metodens

3 mätområde eller känslighet beror på den volym mjölk man har i rören. Med större volym kan man mäta lägre sporkoncentrationer. Precisionen i sporhaltsbestämningen ökar ju fler rör med en given mjölkvolym som man använder (3). Syftet med att införa betalningssystem för sporer i mjölk är att kunna ge en stark signal till de leverantörer vars mjölk innehåller så höga sporhalter att de är oacceptabla ur produktteknisk synpunkt, samt att ge en varningssignal till övriga leverantörer som ligger över den önskvärda nivån. För klostridiesporer är det önskvärt att sporhalten inte överstiger 5/l om Grevéostkvaliteten ska kunna bli godtagbar (4). För psykrotrofa Bacillus cereus-sporer är den produkttekniska gränsen 1-2 sporer/l (5). Dessa gränser är satta med hänsyn tagen till produktkvalitet men också till att man med en rimlig arbetsinsats ska kunna klara dessa halter i mjölkproduktionen. Sporhalter som ur produktsynpunkt är helt oacceptabla är för smörsyrasporer 2 sporer per liter och för B. cereus-sporer 1/l eller däröver. Statistik Följande resonemang baserar sig på klostridiesporanalyserna med 1 ml mjölk per rör, men statistiken gäller också för B. cereus även om mjölkvolymen därvid är större. Figur 1 sammanfattar sannolikheten att få, 1, 2 eller 3 positiva rör vid analys av 3*1 ml mjölk vid olika sporhalter i mjölken. När sporhalten per rör är hög är sannolikheten för tre jästa rör också hög. Vid en enstaka analys av 3*1 ml mjölk erhålls tre jästa rör med 95 om sporhalten är 41 sporer per liter mjölk. Vid lägre sporhalter minskar denna sannolikhet och vid 5 sporer per liter är den 6%. På grund av MPN-metodens slumpeffekter kan man därför inte med en enstaka analys med resultatet tre positiva rör hävda att sporhalten verkligen är hög i mjölken. Vid cirka 1 sporer/l framgår det att man på grund av slumpeffekter med ungefär lika stor sannolikhet kan få ett eller tre positiva rör (26 respektive 25 ), även om det sannolikaste utslaget är 2 positiva rör 44 %). Detta kan uppfattas som mycket förvillande och ge intrycket att slumpen spelar stor roll för alla analysresultat. Slumpen påverkar emellertid utfallet kraftigt endast inom ett begränsat sporhaltsintervall. Om ett MPNsystem ska användas i ett betalningssystem får slumpen inte bli avgörande för de leverantörer som bör bli föremål för avdrag. Figur 1. Sannolikhet för växt i, 1, 2 resp 3 rör vid analys av 3x1ml 1,9,8,7,6 + 3 +,5,4 1+ 2+,3,2,1,1,1,1 1 1 Sporhalt per ml

4 Det framgår av figur 1 att vid höga sporhalter får man nästan alltid tre positiva rör i analysen. Det är viktigt att de leverantörer som har acceptabel sporhalt i mjölken inte drabbas av avdrag p.g.a. slumpeffekter. Vid låga eller mycket låga sporhalter (5 respektive mindre än 1 sporer/l) får man aldrig eller mycket sällan tre positiva rör som analysresultat. I ett visst intervall med medelhöga sporhalter kommer emellertid slumpen att ha en viss betydelse. Detta är en inneboende svaghet i alla MPN-metoder. Sådana effekter finns även i bakterieräkningsprovet, men de är mycket mera uttalade för MPN-metoden. Å andra sidan är t.ex. 1 sporer per liter inte en helt acceptabel sporhalt varför det kan anses befogat att en leverantör med denna sporhalt ibland får en varningssignal. I denna rapport vill vi visa att dessa slumpeffekter kommer att ge utslag i form av 3 positiva rör med en frekvens som står i proportion till sporhalten och att de därför ger ändamålsenliga signaler i ett löpande analyssystem. Vi beskriver olika betalningssystemlösningar och visar effekten av dessa ur statistisk synpunkt. Några exempel på effekten av olika avdragssystem Det allra enklaste systemet skulle kunna vara analys av 3*1 ml mjölk och direkt avdrag vid 3 positiva rör. Ett sådant system är olämpligt ur statistisk, men också ur psykologisk synvinkel. Eftersom analysresultaten kommer att uppfattas som mycket varierande hos leverantörer med medelhöga sporhalter är det viktigt för förtroendet för metoden att avdrag inte baseras på en enda observation. Figur 2 visar sannolikheten att få tre positiva rör vid olika sporhalter. Risken att få tre positiva rör och därmed avdrag är 6% vid 5 sporer per liter, som anses vara en ur produktteknisk synpunkt godtagbar sporhalt. Detta är en alltför hög risk. Det innebär att om 6 analyser görs per år löper man vid denna sporhalt en 31%-ig risk att drabbas av minst ett avdrag under året. 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Figur 2. Sannolikheten att få tre positiva rör vid olika sporhalter vid analys av 3*1 ml mjölk med och utan konfirmering, samt vid analys av 3*,5 ml mjölk. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 3*1ml 3*1 ml konf. 3*,5 ml Om man minskar volymen mjölk som analyseras så minskas också metodens känslighet. Då blir också risken att leverantörer med låga sporhalter drabbas av avdrag mindre. Figur 2 visar sannolikheten att få tre positiva rör vid analys av 3*,5 ml mjölk. Vid 5 sporer per liter är risken för tre positiva rör endast 1%, vilket kan anses vara mera acceptabelt. Säkerheten för

5 leverantörer med acceptabelt låga sporhalter i mjölken är alltså tillgodosedd. I ett system med 6 analyser per år riskerar man om mjölkens sporhalt konstant är 5 sporer/l att få ett avdrag vart sextonde år. En stor nackdel är däremot att risken för avdrag vid halter i området 1-5 sporer per liter minskar kraftigt jämfört med analys av 3*1 ml (Figur 2). Eftersom flertalet leverantörer med förhöjd sporhalt i mjölken sannolikt befinner sig här ger inte analyser av 3*,5 ml signaler med avsedd kraft (jämför minskningen i sannolikheterna vid analys med de två volymerna), även om leverantörer med ännu högre sporhalter fortfarande drabbas kraftigt. 3 rör med konfirmering Ett alternativt sätt att öka säkerheten för leverantörer med sporhalter under 5/l är att göra konfirmerande analyser. Systemet bygger på upprepade observationer, varigenom de leverantörer som på grund av slumpen fått tre positiva rör i första analysen, trots låg sporhalt, bortsorteras. Effekten av detta förfarande framgår av Figur 2. Efter grundanalys med 3*1 ml görs ytterligare en analys (konfirmering) på mjölk från samma gård vid ett senare tillfälle, även denna med 3*1 ml mjölk. Sannolikheten för att få tre positiva rör även vid omprovet är beroende av sporhalten. Vid en konstant halt av 5 sporer per liter blir sannolikheten för tre positiva rör vid båda tillfällena,98*,98 dvs,96 (96%). Detta innebär att vid höga och mycket höga sporhalter kommer rörmetoden att i de flesta fall ge "rätt" utslag. Ett visst bortfall av leverantörer som har höga sporhalter och medelhöga kommer dock att ske på grund av slumpen i samband med omprovet. Ett sådant bortfall får accepteras för att garantera rättssäkerheten för de leverantörer som verkligen har låga sporhalter. Vid acceptabla sporhalter, såsom 5 sporer per liter eller lägre, minskar risken att få tre positiva rör dramatiskt. Sannolikheten att få tre positiva rör två gånger vid 5 sporer/l blir,6*,6 dvs,36 (,36%). Vid sporhalter mellan 5 och 4/l ökar risken för att få tre positiva rör vid två tillfällen med sporhalten. Här ligger naturligtvis att man med en viss slumpmässighet kan riskera att få tre positiva rör, men analysutslagen kan rättfärdiggöras med att leverantörer i denna grupp har för hög sporhalt i mjölken, även om den inte hos alla leverantörer är extremt hög. Det är därför befogat att de ibland drabbas av avdrag. Vid ännu högre sporhalter är sannolikheten att få tre positiva rör alltjämt mycket hög. I jämförelse med ett system där man analyserar 3*,5 ml mjölk utan konfirmering får man både ökad säkerhet för leverantörer med låga sporhalter och en högre frekvens avdrag vid mellanhöga sporhalter (Figur 2). Detta är viktigt om man vill ge så starka varningssignaler som möjligt till leverantörer i denna grupp. Olika avdragssystemlösningar baserade på konfirmering Det enklaste systemet bygger på att varje observation (analys + bekräftande analys) utgör en enhet. Avdrag görs för varje observation för sig. De statistiska utfallen vid olika sporhalter har redan visats i Figur 2. Förutom risken för avdrag vid varje observation är även effekten av systemet under en längre tidsperiod av betydelse. Det genomsnittliga antalet avdrag per år, om mjölkens sporhalt ligger konstant på samma nivå hela tiden, kan erhållas genom att multiplicera sannolikheten för avdrag vid en given sporhalt i Figur 2 med antalet analystillfällen. Ett exempel ges i Tabell 1 med sex analystillfällen. Det framgår tydligt att leverantörer med mycket höga sporhalter kommer att drabbas av många avdrag. Vid sjunkande sporhalt minskar risken för avdrag, även om enstaka avdrag även kan drabba leverantörer som har medelhöga sporhalter, t.ex. 1 sporer/l. Denna signal är dock ändamålsenlig eftersom den visar att sporhalten inte är helt tillfredsställande. Styrkan i signalen kommer att vara proportionell mot sporhalten.

6 Tabell 1. Analys av 3 x 1 ml, konfirmering av 3+ med 3 x 1 ml, avdrag vid 3+ i grundanalys och 3+ i konfimerande analys. 6 analysomgångar per år halt sannolikhet (%) sannolikhet (%) genomsnittligt sannolikhet (%) per för 3+ för avdrag antal avdrag per år för minst ett avdrag liter vid en analys vid en analysomgång under ett år 1.1... 2.6...2 3 1.7.3..2 5 6.1.4.2 2.2 7 12.8 1.6.1 9.4 1 25.3 6.4.4 32.7 2 64.6 41.8 2.5 96.1 3 85.8 73.6 4.4 1. 5 98. 96. 5.8 1. 7 99.7 99.5 6. 1. 1 1. 1. 6. 1. En annan variant av avdragssystem innebär att man inte betraktar varje observation som en enhet utan väljer att, så fort ett högt analysvärde påträffas, kontinuerligt göra uppföljande analyser tills förhållandena förbättras. Om avdrag görs först efter den andra observationen erhålls samma säkerhet som i det ovan nämnda systemet. Effekten av upprepade analyser visas i Figur 3. Vid mycket höga sporhalter kommer systemet snabbt att ge mycket effektiva signaler. Även vid mera måttliga sporhalter är sannolikheten för att få tre positiva rör vid flera tillfällen relativt hög. Systemet kommer därför att ge effektiva signaler även här. På samma sätt som tidigare är säkerheten för leverantörer med låga sporhalter väl tillgodosedd. 1 Figur 3. Sannolikheten att få tre positiva rör vid upprepade analyser av 3*1 ml mjölk. Uppföljningssystem där varje 3+utslag medför ytterligare en analys. 9 8 7 6 5 4 Grundanalys Uppföljning 1 Uppföljning 2 Uppföljning 3 Uppföljning 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Ett tredje alternativ är att betrakta observationerna (analys + konfirmerande analys) i ett rullande system. Ett skäl för detta kan vara att i det inledande skedet vid införandet av ett betalningssystem inte basera prisavdrag på en enstaka observation. I ett sådant system identifieras endast leverantörer som med stor säkerhet kan påvisas ha mycket höga sporhalter.

7 Prisavdrag följer först efter en serie analyser och drabbar endast de leverantörer som haft kontinuerligt dåliga produktionsförhållanden. Figur 4 visar sannolikheten att i en observationsomgång drabbas av avdrag om avdrag utgår när två av tre rullande observationer, inklusive den senaste, givit 3+3 positiva rör. Säkerheten för leverantörer med låga eller måttligt höga sporhalter är ännu högre i detta system än i ett system med avdrag efter en observation. Detta har varit styrkan i systemet, som utgjorde de första modellen för betalningssystem i sporprojektet. Tabell 2 visar effekten sedd under 6 observationstillfällen per år. Starka signaler, med genomsnittligt minst 1,7 avdrag per år erhålls vid 2 sporer/l eller däröver. På grund av det rullande systemet blir dock signaleffekten lägre än i ett system med avdrag direkt efter varje observation, även om systemet är bättre än vid analys av 3*,5 ml mjölk. Figur 4. Rullande system med analys av 3*1 ml mjölk med konfirmering. Avdrag när två av de senaste tre observationerna varit positiva. 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 3*1ml 3*1 ml konf. 3*,5 ml 3*1ml konf., rullande 2 av 3 Tabell 2. Analys av 3 x 1 ml, konfirmering av 3+ med 3 x 1 ml, avdrag vid 2 av 3 omgångar med 3+3 inklusive senaste. 6 analysomgångar per år halt sannolikhet (%) sannolikhet (%) sannolikhet (%) genomsnittligt sannolikhet (%) per för 3+ vid för 3+3 vid en för avdrag vid en antal avdrag / år för minst ett avdrag liter en analys analysomgång analysomgång under året 1.1.... 2.6.... 3 1.7.3... 5 6.1.4...2 7 12.8 1.6.5..3 1 25.3 6.4.8.5 4.6 2 64.6 41.8 27.6 1.7 85.6 3 85.8 73.6 68.5 4.1 99.9 5 98. 96. 95.9 5.8 1. 7 99.7 99.5 99.5 6. 1. 1 1. 1. 1. 6. 1.

8 Ytterligare en variant av rullande system är att låta en enkelanalys av 3*1ml mjölk vara grundobservation, men att sedan rullande göra avdrag baserat på 5 eller 6 positiva rör vid två observationer. Sannolikheten för avdrag vid varje analystillfälle visas i figur 5. I jämförelse med avdrag efter 3+3 positiva rör ökar avdragsrisken kraftigt vid sporhalter mellan 2 och 4/l. En nackdel är att risken att få avdrag vid 5 sporer/l blir 4%. Genom minskning av provvolymerna skulle dock detta system ge acceptabel säkerhet för leverantörer med låga sporhalter (jämför nedan, sid. 8). Tabell 3 visar effekten av det rullande systemet när 6 respektive 9 enkelanalyser görs per år. 1 9 8 7 Figur 5. Rullande system med analys av 3*1 ml mjölk. Avdrag vid 5 eller 6 positiva rör de senaste två omgångarna. 6 5 4 3*1ml 3*1 ml konf. Rullande 5 el. 6 rör 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Tabell 3. Analys av 3 rör x 1 ml, avdrag vid 5 eller 6 positiva rör sammanräknat vid två senaste observationerna. 6 respektive 9 analyser per år 6 analyser per år 9 analyser per år halt per liter sannolikhet (%) för 2+ vid ett analystillfälle sannolikhet (%) för 3+ vid ett analystillfälle sannolikhet (%) för avdrag vid ett analystillfälle genomsnittligt antal avdrag / år sannolikhet (%) för minst ett avdrag under året genomsnittligt antal avdrag / år sannolikhet (%) för minst ett avdrag under året 1 2.5.9...3..4 2 8.1.6.1.1.6.1.9 3 14.9 1.7.6.3 3.3.5 4.8 5 28.2 6.1 3.8.2 2.8.3 29.5 7 37.8 12.8 11.3.7 51.2 1. 65.9 1 44.1 25.3 28.7 1.7 86.8 2.6 95.2 2 3.4 64.6 81. 4.9 1. 7.3 1. 3 13.5 85.8 96.7 5.8 1. 8.7 1. 5 2. 98. 99.9 6. 1. 9. 1. 7.3 99.7 1. 6. 1. 9. 1. 1. 1. 1. 6. 1. 9. 1.

9 Möjligheter att öka metodens effektivitet Som framgår ovan är de olika avdragssystemlösningarna en avvägning mellan att ge effektiva signaler till rätt leverantörsgrupper och att skydda leverantörer med låga sporhalter från orättfärdiga avdrag. En följd av detta i kombination med statistiken för systemen blir att signalerna till en mellangrupp leverantörer kan bli svagare än önskvärt. Detta blir särskilt tydligt för mjölk med sporhalter mellan 2 och 4/l, där sannolikt en stor del av antalet leverantörer med sporproblem befinner sig. Signalerna kan förstärkas genom att utöka antalet provomgångar, se t.ex. tabell 3. Antalet avdrag blir direkt proportionellt mot antalet analyser. Ytterligare en möjlighet är att öka antalet rör per analysomgång, med bibehållande av samma volym mjölk. Om t.ex. 5 eller 6 positiva rör av 6 bli avdragsgrundande ökas precisionen i metoden vilket leder till att man i större utsträckning ger avdrag till leverantörer med mellanhöga sporhalter (jämför fig. 5). Känsligheten i analyssystemen kan generellt ökas genom att öka provvolymen i analysen. Vid analys av 3*2 ml mjölk erhålls 3 positiva rör med 65 redan vid 1 sporer/l, men samtidigt ökar risken att få avdrag vid 5 sporer/l till 25% (Figur 6). Risken blir 6,4% efter uppföljande analys (Figur 6), vilket är en oacceptabelt hög risk. Figur 6. Olika system med analys av 3*2 ml mjölk. 1 9 8 7 6 5 4 3*1ml 3*1 ml konf. 3*2ml 3*2 ml konf. 3*2ml rullande 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Figur 7 visar sannolikheten för att få avdrag efter en observation (analys samt uppföljningsanalys) vid analys av 3 rör med olika mjölkvolymer. Vid analys av 3*1,4 ml är risken för avdrag 1,6% vid 5 sporer/l och vid analys av 3*1,6 ml 2,7%. Detta motsvarar en risk att få ett avdrag var 12:e respektive 1:e år om 6 analyser görs per år. Genom att öka mjölkvolymen per rör upp till 1,6 ml kan alltså en ökad känslighet erhållas utan att mjölk med låga sporhalter drabbas av orättvisa avdrag. Om 2 ml mjölk analyseras kan säkerheten för leverantörer med låga sporhalter ökas genom att man använder rullande observationer (2 positiva av 3). Figur 6 visar att man förlorar obetydligt i signalstyrka till leverantörer som har sporhalter mellan 1-2 sporer/l jämfört med avdrag efter en observation med 2 ml mjölk, samtidigt som risken för avdrag vid 5 sporer/l minskar till,8%. Tabell 4 visar effekten av systemet med 6 analysomgångar per år. Jämfört med analys av 3*1 ml och avdrag

1 efter varje konfirmerad analysomgång ökar signalstyrkan kraftigt för leverantörer med 1 till 2 sporer/l i mjölken. Det bör påpekas att ovanstående statistiska överväganden är starkt beroende av vilken gräns man väljer för de produkttekniska kraven på mjölkråvaran. Om den produkttekniska gränsen sänks till 2 klostridiesporer/l innebär detta att t.o.m. en enkelanalys med 3*1 ml mjölk skulle kunna ge tillräcklig rättssäkerhet för leverantörerna. Sådana beslut måste dock fattas först efter att man har god kännedom om hur lågt sporhalten kan sänkas på gården med rimliga arbetsinsatser. 1 9 8 Figur 7. Sanolikheten att få 3 positiva rör vid analys av olika mjölkvolymer. 3 rör med konfirmering. 7 6 5 4 3 1, ml 1,2 ml 1,4 ml 1,6 ml 1,8 ml 2, ml 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Tabell 4. Analys av 3 x 2 ml, konfirmering av 3+ med 3 x 2 ml, avdrag vid 2 av 3 omgångar med 3+3 inklusive senaste. 6 analysomgångar per år halt sannolikhet (%) sannolikhet (%) sannolikhet (%) genomsnittligt sannolikhet (%) per för 3+ vid för 3+3 vid en för avdrag vid en antal avdrag / år för minst ett avdrag liter en analys analysomgång analysomgång under året 1.6.... 2 3.6.13... 3 9.2.8.1..9 5 25.3 6.4.8.5 4.6 7 42.8 18.3 6.1.4 31.4 1 64.6 41.8 27.6 1.7 85.6 2 94.6 89.5 88.5 5.3 1. 3 99.3 98.5 98.5 5.9 1. 5 1. 1. 1. 6. 1. 7 1. 1. 1. 6. 1. 1 1. 1. 1. 6. 1. Bacillus cereus Statistiskt sett fungerar B. cereus-analysen på samma sätt som klostridieanalysen. Eftersom de sporhalter man är intresserad av är lägre för B. cereus än för klostridier behöver man analysera

11 en större provvolym. Det mätintervall man är intresserad av är troligtvis också snävare. Figur 8 visar utfallet i ett betalningssystem där man analyserar 6*4 ml mjölk och där avdrag göres efter 5-6 positiva rör i grundanalys. Starka signaler ges ned till cirka 3 sporer/l. Vid 1 sporer/l är risken för att få minst 5 positiva rör 1,7%. Detta system har provats i praktiken i mjölkbedömning för analys av psykrotrofa B. cereus vid 8 C, med värmebehandling av provet vid 8 C i 1 minuter. 1 9 8 7 6 Figur 8. Effekt av olika analyssystem för B. cereus-sporer. Med 6 rör göres avdrag efter grundanalysen. 5 4 3 5 el. 6 rör 4ml 5 el. 6 rör 2ml 3*2 ml 3*2ml konf. 2 1 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 I samband med utveckling av snabbare analyssystem för B. cereus fann man att värmebehandling vid 72 C i 5 minuter gav högre analysvärden för sporhalten (6). Man fann också att anrikning vid 2 C gör det möjligt att analysera sporhalten efter 1 dygn, med svar efter 2 dygn. Tabell 5 visar en jämförelse mellan analysutslag för samma mjölkprover med de två analysmetodvarianterna. Den nya metoden ger högre frekvens höga sporhalter än den gamla metoden (5). Tabell 5. Fördelning av analysresultat vid analys av 9 leverantörmjölksprover med gammal och ny analysmetod för B. cereus-sporer. Metod Sporer /l, procentuell fördelning <52 52 112 178 255 347 458 62 85 115 >115 8 C 1 min. + 8 C/ 7dygn 24,4 1 1 111 6,7 8,9 5,6 11,1 5,6 4,4 2,2 72 C 5 min.+ 2 C/1 dygn 23,3 11,1 14,1 2,2 6,7 7,8 7,8 5,6 6,7 6,7 7,8 Med tanke på att ur rådgivarsynpunkt få en hanterbar frekvens prover med tre positiva rör har det föreslagits att minska volymen mjölk från 4 ml till 2 ml i den snabbare metoden. Valet av 6 rör i sporprojektet berodde ursprungligen på att B. cereus-analysvärdena fluktuerade kraftigt mellan grundanalys och uppföljande analys. För att kunna göra säkra mätningar vid ett enda tillfälle valdes 6 rör, men analysen blev därvid ganska dyr. De fluktuationer som noterades var till en del troligen betingade av analystemperaturen, vilket nu har eliminerats genom att ha en högre analystemperatur. Den nya metoden innebär att frekvensen höga sporhalter ökar. Det kan därför vara möjligt att istället använda 3 rör à 2 ml med konfirmering, men en viss osäkerhet kvarstår dock vad den naturliga variationen av B. cereus-sporer i tiden får för effekt i sådant fall. Figur 8 visar utfallet vid analys av 6 rör respektive 3 rör i ett sådant system. Såväl vid analys av 6 rör som vid 3 rör med konfirmering är säkerheten god vid sporhalter under 2/l. Vid analys av 3 rör med konfirmering blir det av statistiska skäl ett relativt stort bortfall

12 av positiva observationer i jämförelse med ett system där avdrag göras direkt vid 5 eller 6 positiva rör á 2 ml mjölk. Detta kan vara en nackdel med hänsyn till att snabbt ge signaler till stora leverantörsgrupper. Figur 9 visar hur frekvensen avdrag/anmärkningar blir i ett system med analys av 3*2 ml mjölk och kontinuerlig uppföljning när analysen ger 3 positiva rör (jämför figur 3). 1 9 8 Figur 9. Sannolikheten att få tre positiva rör vid upprepade analyser av 3*2 ml mjölk. Uppföljningssystem där varje 3+utslag medför ytterligare en analys. 7 6 5 4 3 Grundanalys Uppföljning 2 Uppföljning 3 Uppföljning 3 Uppföljning 4 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Kopplingen mellan 2 C- analyserna såväl som 8 C-analyserna och de produkttekniska kraven är idag dåligt utredda. Gränsvärdet 1 sporer/l grundar sig på jämförelser mellan sporhalten under vinterhalvåret, när sporbidraget från gårdarna oftast är litet, och sporhalten i konsumtionsmjölk under sommarhalvåret. Då emellertid pastöriseringsbetingelserna skiljer sig starkt åt mellan laboratorieanalysen och mejeripastöriseringen är en direkt jämförelse svår att göra, eftersom sporgroningen hos B. cereus påverkas av pastöriseringsbetingelser m.fl. operationer som sker på mejeriet. Det är därför klokt att i avvaktan på bättre kunskap använda den mera generösa analysvarianten med 2 ml mjölk vid användande av 2 C-metoden. Figur 1 visar att genom att analysera 3*3,2-3,4 ml mjölk kan signaleffekten skärpas för leverantörer med sporhalter mellan 3 och 2 sporer/l utan att leverantörer med låga sporhalter drabbas av avdrag. Vid 2 sporer/l är sannolikheten att få tre positiva rör 1,4% om 3*3,4 ml mjölk analyseras. Diskussion Valet analyssystem och avdragssystem kan påverkas av många olika faktorer. Den grundläggande faktorn är önskemålet att erhålla en mjölkråvara som motsvarar de produkttekniska kraven. Man ska dock betänka att det inte är nödvändigt att alla leverantörer behöver uppfylla detta krav, eftersom mjölkråvaran är utgör en blandning av samtliga leverantörers mjölk. Vid införandet av ett betalningssystem måste man ge lantbrukarna möjlighet att successivt anpassa sig till systemet. Sporer är en naturlig komponent i mjölkråvaran i den mening att mjölken alltid utsätts för en större eller mindre sporkontamination. Detta innebär inte att det är omöjligt att sänka sporhalten i mjölken. Det

13 kan ur praktisk synpunkt vara nödvändigt att, beroende på hur sporhalten fördelar sig i mjölken hos leverantörerna, anpassa den förväntade avdragsfrekvensen genom val av analysvolym och analysfrekvens, för att sedan när effekt av betalningssystemet erhålls öka kraven på låg sporhalt. Precis som totalantalet bakterier i mjölken sänkts genom stegvis ökande krav så kan också sporhalten sänkas. Det är härvid viktigt att känna till analysmetodens svagheter och att anpassa avdragens storlek efter den risk för felbedömning som föreligger i olika avdragssystem. Ovanstående beräkningar och exempel har grundat sig på antagandet att sporhalterna hållits på samma nivå vid varje analystillfälle. I realiteten är detta sannolikt inte fallet. Man kan därför förvänta sig att avdragsutfallen i verkligheten kommer att bli lägre än förväntat. Ovanstående beskrivningar visar dock att man kan använda MPN-analyser med god säkerhet i ett betalningssystem utan att leverantörer med låga sporhalter drabbas av avdrag. Genom olika typer av förändringar i analyssystemen finns det också möjligheter att skärpa kvalitetskraven. 1 Figur 1. Sannolikheten av få tre positiva rör vid analys av olika mjölkvolymer. 3 rör med konfirmering. 9 8 7 6 5 4 3 2 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,8 ml 3,2 ml 3,6 ml 4, ml 2 1 5 1 15 2 25 3 35 4 Referenser 1. Andersson, I., Christiansson, A., Everitt, B., Johnsson, G. & Johnson, U. (1992) Projekt sporer i mjölk - En lägesrapport. SMR reg.nr. 4888. 2. Christiansson, A., Andersson, I., Ekelund, K., Jönsson, L. & Månsson, E. (1992) Två metoder för bestämning av Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk. SMR reg.nr. 4883. 3. I. Andersson & A. Christiansson (1992). Användning av MPN-metodik för klassning av sporhalter i leverantörmjölk. Mejeriernas FoU-rapport, SMR reg.nr 4884.

14 4. Christiansson, A., Ekelund. K., Rydén, I., Andersson, U. & Alfredsson, S. (1992). Samband mellan sporhalt i ystmjölk, bestämd med olika metoder, och kvaliteten hos Grevé-ost. Del 2. En fördjupad studie av ostar vid KvB-ålder. SMR reg.nr 4891. 5. Andréasson, Y,. Bergwik, B-M. & Christiansson, A. (1991). Bacillus cereus i mjölk och grädde. Bekämpning genom dubbel värmebehandling. SMR reg.nr 4873. 6. Christiansson A. m.fl. (1995). Utveckling av nya, snabbare, analysmetod för Bacillus cereus-sporer i leverantörmjölk. Rapport under utarbetande.