Polymerase Chain Reaction The Polymerase Chain Reaction Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls
Kunskapsmål för detta avsnitt Från kursplan: Studenten skall kunna: förklara grundläggande principer för PCR, analysera PCR-resultat och dra slutsatser om hur reaktionen och arbetssättet kan modifieras för att nå ett optimalt resultat
Efter avslutad kurs skall studenten kunna: Tillämpa sina teoretiska kunskaper genom att planera och utföra grundläggande molekylärbiologiska metoder utvärdera resultat jämföra för- och nackdelar med olika metoder identifiera vilka moment som kan påverka resultatet.
Detta testas på tentan Du ska kunna redogöra för de tre stegen i en PCRcykel. Du skall kunna diskutera val av primerpar. Du skall kunna diskutera hur man optimerar annealingtemperaturen. Du skall kunna diskutera hur man arbetar för att undvika kontamination. Du skall kunna nämna exempel på användningsområden för PCR. Du skall kunna utvärdera ett resultat, diskutera och värdera sannolikheten för möjliga felkällor samt föreslå vad som bör ändras när man kör om analysen.
-Tillämpningar Diagnos av ärftliga sjukdomar (T2-lab) Diagnos av bakt/virusinfektion Rättskemiska analyser Sekvensering Kloning Inmärkning av probe Kvantifiering av genuttryck (RT-PCR) Med mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
DNA profiler princip (fig.a+b) Dagens DNA profiler amplifierar 13 olika STRs + X/Y markör
Jmf Brown fig. 16.2
Repetition av grunderna Syntes av ny sträng vad behövs? Vad händer om syntesen upprepas 30 gånger? Resultat Problem Behov av optimering
Repetition: syntes av ny sträng Templat: ssdna som fungerar som mall för den nya strängen Primer: oligonukleotid som binder komplementärt till templatet dntp s: nukleotider, byggstenar (Taq) DNA-Polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5 P och 3 OH
Vad behöver man i röret? Vad händer i röret? Templat (prov med DNA) Forward primer (startsekvens) Reverse primer (startsekvens) dntp s (byggstenar) Taq DNA polymeras www.ib.usp.br/evolucao/qtl/pcr.gif Buffert
Amplifiering!!! Markera 5 och 3 på varje sträng! Rita in vad som händer vid andra och tredje cykeln! Visa om strängen fortsätter Jmf Brown fig. 9.1-9.3 Andra cykeln Tredje cykeln
Fundera på: Vad är det som kopieras, dvs Vad består produkten av? Vad är vitsen med PCR? Varför gör man PCR? 1) 2)
Resultat Området mellan primrarna; målområdet, target amplifieras exponentiellt x2 x2 x2 x2 osv. De nya strängarna blir också templat i nästa cykel Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 10 9 kopior av målområdet
Resultatet analyseras ofta med elektrofores Se Brown fig. 9.4 Vad betyder ett band på gelen? Ex. PCR för att påvisa LL37 i rekombinant plasmid Om vi ser ett band på gelen efter elektrofores betyder det att: Det har bildats DNA-molekyler vid PCR-reaktionen. Primrarna måste ha bundit till DNA i provet Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna Avståndet mellan sekvenserna där primrarna har bundit är lika stort som längden på produkterna Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-dna fanns i provet
Exempel på resultat Vad har hänt i: A Brunn 5 och 6? MWM IV Molekylviktsmarkör med fragment av känd storlek (bp) B Brunn 1 och 2?
Problem vid PCR Ospecifika produkter För många produkter Optimering viktig! Carry-over kontamination Rätt!!! produkt från fel prov OBS! menar inte ospecifika produkter utan man får FÖRVÄNTAD PRODUKT av misstag Inhibering För lite/ingen produkt Rita hur en gel ser ut vid respektive problem Taq DNA polymeras saknar proofreading
Optimering av PCR-reaktion Fundera på varför man bör optimera resp faktor. Vad vill man uppnå/undvika? Val av primerpar Använd primerdesign-program Annealingtemperaturen (beror på primers) Mg 2+ -koncentration
Krav på primerpar Hybridisera till sekvens uppströms målområdet Forward primer Upper primer Samma sekvens som sense Hybridisera till sekvens nedströms målområdet Reverse primer Lower primer Samma sekvens som antisense 3 OH pekar mot varandra Fig. 9.5 Brown: Gene Cloning Träna på: Hur skrivs denna gensekvens? Hur skrivs beställning av primers?
Optimering av annealingtemperatur För låg temp ger.. För hög temp ger. Ta hänsyn till Tmvärdet Se fig. 9.8 och 9.9 i Brown
Primerlängd 8-mer ger statistiskt 46000 möjliga sekvenserr att hybridisera till i humana genomet Träna på: Hur många produkter kan bildas? Hur ser gelen ut? 17-mer har 1 chans på 17179869184 bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens Fig. 9.6 Brown Gene Cloning
Jämför olika templat Större risk att hitta delvis komplementär sekvens om templatet är humant DNA än om det är plasmid Varför?
Primerdimer Minskar känsligheten Osäker kvantifiering Ännu större risk för primerdimer vid multiplex PCR Träna: rita möjlig primerdimer i fig. 9.5!
Krav på primerpar Specifika för målområdet 18-25 nt Tm-värde som tillåter annealing vid 55-65 ºC (ungefär samma Tm) Tm ~ 2x(A+T) + 4x(G+C) ºC Ex. se fig.9.9 Brown 40-60 % GC undvik långa sträckor AT eller GC Undvik primerdimer Undvik sekundärstruktur
Viktigast är sekvens i 3 OH! Undvik: Mismatch Mer än 3 G/C Många A/T Polymeraset har viss aktivitet även vid låga temp. Kan starta syntes på felaktigt hybridiserad primer. Undviks med hjälp av: Hot Start PCR
Hot Start PCR För att undvika syntes av ospecifika produkter redan innan man startat temperatur-cykler. Dessa produkter skulle kunna fungera som primers i senare cykler Strategi: Polymeraset blockeras av en kemisk förening som förstörs vid upphettning Aktivering vid 95 ºC i 10 min.
Magnesiumjoner Mg 2+ är cofaktor till polymeraset Mg 2+ binds även till templat, dntp s och primers Måste optimeras
Vad gör DNA/RNA polymeras? 5 ->3 Polymerasaktivitet 3 ->5 Exonukleasaktivitet, proofreading Taq DNA-polymeras saknar denna aktivitet 5 -> 3 Exonukleasaktivitet Misinsertion Enzymet sätter in fel nukleotid i den nya strängen ( slarvigt enzym )
Spelar det någon roll att Taq-polymeras saknar proofreading? Beror på vad PCR-produkten skall användas till. Se fig. 9.15 i Brown Kloning Sekvensering
Pfu och Pwo DNA-polymeras Har proof-reading, kan repararera fel + Minskar felfrekvensen + Ökar utbytet, speciellt vid långa templat - Inte lika effektivt som Taq DNA-polymeras - Risk att enzymet degraderar primer - Kan ej använda märkta nukleotider?
Positivt prov Carry over kontamination En enda DNA-molekyl ger upphov till flera miljoner DNA-molekyler efter PCR!!! Negativt prov kontaminerat med PCR-produkter från positivt prov Resultat av kontamination Positivt svar trots negativt prov Falskt positivt svar
Rutiner för att undvika Carryoverkontamination: Separata rum för olika moment DNA extraktion prepcrrum spädning av primers och dntp s blandning av Master Mix (MM) PCR rum (tillsätter DNA till Master Mix) Detektion (elektrofores) Filterspetsar för all pipettering innan amplifiering Varför behövs ej filterspetsar efter amplifiering?
Dekontaminering a) Vid amplifiering används dutp, ger produkt med U a) b) c) b) Nya prov behandlas med enzym UNG Uracil DNA Glycosylas (AmpErase) som bryter ned U- DNA c) Carry-over kontamination förstörs
Kontroller Negativ kontroll Master Mix + vatten i st f templat Vad vill man kontrollera med negativ kontroll? Positiv kontroll Master Mix + den DNA-sekvens man vill detektera Vad vill man kontrollera med positiv kontroll?
Inhibering Ger lägre känslighet, risk för falskt negativa prov Inhibitorer Ämnen i provet: Hb, EDTA, heparin, urea Rester från DNAprep: SDS, NaCl, EtOH Föroreningar i reagens Positiv kontroll nödvändig, helst intern kontroll i varje prov
Intern kontroll Kontroll att PCR-reaktionen fungerar Tillsätts till varje prov som positiv kontroll Coamplifieras tillsammans med mål-dna Specifika prober för detektion av amplifikat av mål-dna resp. internkontroll Kan skilja på amplifikat från mål-dna resp intern kontroll Prov med neg. internkontroll analyseras om