Bestämning av syntetiska cannabinoider med gaskromatografi-masspektrometri

Institutionen för fysik, kemi och biologi Examenarbete Bestämning av syntetiska cannabinoider med gaskromatografi-masspektrometri Sandra Pettersson 2011-06-07 LITH-IFM-G-EX--11/2475--SE Linköpings universitet Institutionen för fysik, kemi och biologi 581 83 Linköping

Institutionen för fysik, kemi och biologi Bestämning av syntetiska cannabinoider med gaskromatografi-masspektrometri Sandra Pettersson Examensarbetet utfört vid Klinisk kemi, Sahlgrenska universitetssjukhuset, Göteborg 2011-06-07 Handledare Henrik Ryberg Examinator Roger Sävenhed

Avdelning, institution Division, Department Chemistry Department of Physics, Chemistry and Biology Linköping University Datum Date 2011-06-07 Språk Language Svenska/Swedish Engelska/English Rapporttyp Report category Licentiatavhandling Examensarbete C-uppsats D-uppsats Övrig rapport ISBN ISRN: LITH-IFM-G-EX--11/2475--SE Serietitel och serienummer ISSN Title of series, numbering URL för elektronisk version Titel Title Bestämning av syntetiska cannabinoider med gaskromatografi-masspektrometri (Determination of synthetic cannabinoids by gas chromatography-mass spectrometry) Författare Author Sandra Pettersson Sammanfattning Abstract This thesis has been performed at Clinical Chemistry at Sahlgrenska University Hospital in Gothenburg. The purpose of the project was to investigate new and alternative ways to determinate synthetic cannabinoids by gas chromatography-mass spectrometry. Currently, the possibilities to quantify synthetic cannabinoids are very limited. This can lead to an increased use of synthetic cannabinoids as the risk of detection is low, which may be known by drug users. The synthetic cannabinoids are sold mixed with different herbs and have varying names like Spice Gold, Spice Silver, K2, Smoke and Pot-pourri. The synthetic cannabinoids analyzed were JWH-018 and JWH-073, which are commonly found in seized Spice material. At intake of these drugs, usually through smoking, cannabis-like effects arise. This is because they bind to cannabinoid receptors in a similar way as THC does, which is the primary active cannabinoid of cannabis. For urine samples an analytical method would probably be the most sensitive if the major metabolite could be analyzed, as it is expected to be present in high concentrations in this sample type. Since information regarding the metabolism of synthetic cannabinoids is very limited there may be reasons to analyze the mother substance in urine. Further, in plasma and serum samples the mother substance is expected in high concentrations. Thus different ways to detect JWH-018 and JWH-073 directly were investigated in this project. Derivatization of JWH-018 and JWH-073 was the first step to get more selective and sensitive GC-MS analysis. Different derivatization-reagents were investigated, for example BSTFA and TFAA. The results show that the derivatization of JWH- 018 with BSTFA after reduction and extraction was successful. To achieve this, samples had to be heated at 115 C for 1-3 hours, but still the samples were not completely derivatized. The results indicate that JWH-substances are difficult to derivatized, but they are possible to derivatize with BSTFA. This could mean that a GC-MS-method maybe could be established for these substances, preferably trough TFAA-derivatization. Nyckelord Keyword Syntetiska cannabinoider, Spice, JWH-018, JWH-073, GC-MS (Synthetic cannabinoids, Spice, JWH-018, JWH-073, GC-MS)

Sammanfattning Detta examensarbete har utförts på Klinisk Kemi på Sahlgrenska universitetssjukhuset i Göteborg. Syftet var att undersöka nya och alternativa sätt för att bestämma syntetiska cannabinoider med gaskromatografi-massepktrometri. För närvarande saknas möjligheter att kvantifiera dessa ämnen. Detta kan leda till en ökad användning då risken för upptäckt är mindre, vilket till viss del är känt inom missbrukskretsar. De syntetiska cannabinoiderna säljs som örtblandningar och har varierande namn som bland annat Spice Gold, Spice Silver, K2, Smoke och Pot-pourri. De syntetiska cannabinoiderna som har analyserats var JWH-018 och JWH-073, vilka är vanligt förekommande i beslagtaget Spice-material. Vid intag av dessa cannabinoider, som oftast sker genom rökning, uppnås cannabisliknande effekter. Detta på grund av att de binder till cannabinoidreceptorerna likt THC, som är den primära aktiva substansen i cannabis. För urinprover skulle en mätmetod antagligen bli känsligast om huvudmetaboliten kunde analyseras, då denna förväntas förekomma i högst koncentrationer. Med tanke på att informationen om metabolisering av syntetiska cannabinoider är mycket begränsad så kan det finnas anledning att även mäta modersubstansen i urin. I provtyper som plasma och serum förväntas däremot modersubstansen förekomma i högst koncentrationer. I detta arbete försökte därför olika sätt utvecklas för att detektera modersubstanser för syntetiska cannabinoider. Derivatisering av JWH-018 och JWH-073 var ett första steg att gå till väga för att få substanserna mer selektiva och känsliga för GC-MS. Olika derivatiseringsreagens testades, till exempel BSTFA och TFAA. Resultaten visade att derivatisering med hjälp av BSTFA för JWH-018 efter reducering och fasseparering lyckades. Detta om proverna stod 1-3 timmar i värmeugnen och temperaturen höjdes upp till 115 C, dock gav det ingen fullständig derivatisering. Temperaturen var den faktorn som påverkade mer än vad tiden i värmeugnen gjorde. Utifrån resultaten visade det sig att JWH-substanserna är svårderivatiserade, men att det går att derivatisera med BSTFA och i en förlängning skulle kanske en GC-MS-metod kunna etableras för dessa substanser, främst med TFAA-derivatisering.

Abstract This thesis has been performed at Clinical Chemistry at Sahlgrenska University Hospital in Gothenburg. The purpose of the project was to investigate new and alternative ways to determinate synthetic cannabinoids by gas chromatography-mass spectrometry. Currently, the possibilities to quantify synthetic cannabinoids are very limited. This can lead to an increased use of synthetic cannabinoids as the risk of detection is low, which may be known by drug users. The synthetic cannabinoids are sold mixed with different herbs and have varying names like Spice Gold, Spice Silver, K2, Smoke and Pot-pourri. The synthetic cannabinoids analyzed were JWH-018 and JWH-073, which are commonly found in seized Spice material. At intake of these drugs, usually through smoking, cannabislike effects arise. This is because they bind to cannabinoid receptors in a similar way as THC does, which is the primary active cannabinoid of cannabis. For urine samples an analytical method would probably be the most sensitive if the major metabolite could be analyzed, as it is expected to be present in high concentrations in this sample type. Since information regarding the metabolism of synthetic cannabinoids is very limited there may be reasons to analyze the mother substance in urine. Further, in plasma and serum samples the mother substance is expected in high concentrations. Thus different ways to detect JWH-018 and JWH-073 directly were investigated in this project. Derivatization of JWH-018 and JWH-073 was the first step to get more selective and sensitive GC-MS analysis. Different derivatization-reagents were investigated, for example BSTFA and TFAA. The results show that the derivatization of JWH-018 with BSTFA after reduction and extraction was successful. To achieve this, samples had to be heated at 115 C for 1-3 hours, but still the samples were not completely derivatized. The results indicate that JWH-substances are difficult to derivatized, but they are possible to derivatize with BSTFA. This could mean that a GC-MS-method maybe could be established for these substances, preferably trough TFAA-derivatization.

Förord Denna rapport är ett examensarbete som omfattar 16 hp. Det är den avslutande delen för högskoleingenjörsprogrammet i kemisk analysteknik vid Linköpings universitet. Jag vill tacka min handledare Henrik Ryberg för att jag har fått möjlighet att utföra mitt examensarbete på Sahlgrenska universitetssjukhuset. Jag vill även ge ett stort tack till Roger Sävenhed som tog sig tid att vara min examinator och som har inspirerat och hjälpt till på många sätt under min studietid på LiU. Till sist tack till min familj och vänner som har varit ett stort stöd under studietiden. Linköping, 2011-05-24 Sandra Pettersson

Förkortningar GC-MS CP47,497-C6 CP47,497-C7 CP47,497-C8 CP47,497-C9 JWH-018 JWH-073 HU-210 JWH-250 THC CB 1 / CB 2 EI NCI PCI BSTFA TFAA NaBH 4 MeOH HOX MOX gaskromatografi-masspektrometri 5-(1,1-dimetylhexyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol 5-(1,1-dimetylheptyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol 5-(1,1-dimetyloktyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol 5-(1,1-dimetylnonyl)-2-((1R,3S)-3-hydroxycyklohexyl)-fenol naftalen-1-yl-(1-pentylindol-3-yl)-metanon naftalen-1-yl-(1-butylindol-3-yl)-metanon (6aR,10aR)- 9-(hydroxymetyl)- 6,6-dimetyl- 3-(2-metyloktan-2- yl)- 6a,7,10,10a-tetrahydrobenso[c]kromen- 1-ol 2-(2-metoxyfenyl)-1-(1-pentylindol-3-yl)-etanon -9-tetrahydrocannabinol cannabinoidreceptor-1/cannabinoidreceptor-2 elektronimpaktjonisering negativ kemisk jonisering positiv kemisk jonisering bis-(trimetylsilyl)-trifluoroacetamid trifluorättiksyraanhydrid natriumborhydrid metanol hydroxylaminhydroklorid metoxylaminhydroklorid

Innehållsförteckning 1 Introduktion... 1 1.1 Syfte... 1 1.2 Metod... 1 1.3 Begränsningar... 1 2 Bakgrund... 2 2.1 Cannabis... 2 2.2 Syntetiska cannabinoider... 3 2.3 Cannabinoidernas farmakologi... 5 2.3.1 Cannabinoidreceptorer... 5 2.3.2 Cannabis-metaboliter... 6 2.3.3 Metaboliter av JWH-018 och JWH-073... 6 2.4 Laboratorieanalyser för att påvisa cannabinoider... 7 3 Generell beskrivning av använda metoder... 8 3.1 Gaskromatografi... 8 3.1.1 Kolonnen... 8 3.1.2 Mobilfasen... 9 3.1.3 Injiceringsteknik On-column... 9 3.2 Masspektrometer som detektor vid GC-analys... 10 3.2.1 Joniseringstekniker... 11 3.3 Derivatisering... 12 4 Experimentellt... 14 4.1 Lösningar... 14 4.2 Instrumentella betingelser... 14 4.2.1 GC-MS system... 14 4.3 Metod... 14 5 Resultat... 17 6 Diskussion... 22 7 Slutsats och vidareutveckling... 24 Referenser... 25 Bilaga 1. Strukturformler för derivatiseringsreagens som huvudsakligen använts i projektet 28 Bilaga 2. Resultat av oderivatiserat JWH-073... 29 Bilaga 3. Resultat av oderivatiserat JWH-018... 30

1 Introduktion 1.1 Syfte Att kunna detektera syntetiska cannabinoider i prover så som urin och plasma är av stor betydelse inom missbruksvården. För nuvarande saknas möjligheter att kvantifiera dessa ämnen på ett tillfredsställande sätt, vilket till viss del är känt inom missbrukskretsar. Man kan därför förvänta en ökad användning av sådana droger eftersom risken för upptäckt är mindre. Syftet med examensarbetet var att undersöka nya och alternativa sätt för att detektera syntetiska cannabinoider i biologiska prov med hjälp av gaskromatografi-masspektrometri. I en förlängning skulle detta kunna innebära nya analysmetoder för syntetiska cannabinoider i urin och plasma. 1.2 Metod Efter att ha gjort en preliminär projektplan inleddes projektet med litteratursökning. Information om cannabinoider och syntetiska cannabinoider söktes samt provupparbetningsoch analysmetoder. För att få önskvärd selektivitet och känslighet provas olika derivatiseringsreagens och joniseringstekniker för substanserna. För att få en inblick i hur det laborativa arbetet för en analysmetod fungerar studerades en urinanalys-metod för cannabis som används på Klinisk Kemi på Sahlgrenska univeristetssjukhuset. De initierande försöken för de syntetiska cannabinoiderna utgick från deras cannabis-metod och modifierades efter hand. Rapporten skrevs kontinuerligt under arbetets gång. 1.3 Begränsningar Tre olika substanser valdes ursprungligen ut, cannabicyklohexanol (CP47,497-C8), JWH-018 och JWH-073, då dessa syntetiska cannabinoider har visat sig vara vanligt förekommande i beslagtaget Spice-material (1). Men på grund av ändrad lagstiftning i Kanada så försenades leveransen av cannabicyklohexanol och denna substans uteslöts därför vidare ur utvecklingsarbetet. I urin kan man förvänta sig att metaboliter av JWH-018 och JWH-073 finns i högre koncentrationer än ursprungssubstanserna, men när detta projekt startade var kunskapen om metaboliseringen av de flesta syntetiska cannabinoider väldigt begränsad. Därför begränsades projektet till att endast omfatta de ometaboliserade modersubstanserna. 1

2 Bakgrund 2.1 Cannabis Cannabis utvinns ur växten Cannabis sativa (figur 1). Plantan kan bli 5-6 meter hög och trivs bäst i subtropiskt torrt klimat. Cannabis har tidigare odlats legalt i många västländer, främst för framställning av hampfibrer till rep. EU kan tillåta odling av speciell hampa, fiberhampa, som får användas för framställning av fibrer för bland annat textil. Odling av cannabis får endast ske under mycket sträng kontroll och privat odling för drogframställning är straffbart (2). Figur 1. Cannabis sativa Cannabinoiderna brukar delas in i tre olika huvudgrupper: örtcannabinoider som man enbart finner i cannabisplantan, endogena cannabinoider som produceras naturligt i kroppen och syntetiska cannabinoider som tillverkas på laboratorium. Fler än 61 olika cannabinoider har identifierats i cannabisplantan. -9-tetrahydrocannabinol, cannabinol och cannabidiol är de vanligast förekommande cannabinoiderna. Den primära aktiva cannabinoiden som ger upphov till ett psykotiskt rus är -9-tetrahydrocannabinol, kallad THC (3). Ur cannabis framställs tre huvudtyper av drogberedningar, marijuana, haschisch (hasch) samt cannabisextrakt. Marijuana förekommer i växtform där plantan efter skördning torkas för att sedan söndersmulas eller malas ner. Det intas främst genom rökning i ren form eller blandat med tobak i cigaretter, så kallade joints. Haschisch (hasch) förekommer i kådform där kådan kan pressas till kakor som kan ätas eller rökas. Kvaliteten, det vill säga THC-halten, varierar beroende på vilken teknik som används vid framställningen. Haschkakorna är ibland stämplade med tillverkarens märke. Hasch i pulverform kan också påträffas men är ovanlig i Sverige. Pulvret sväljs direkt eller blandas i drinkar. Cannabisextrakt framställs genom att växtdelar läggs i lösningsmedel för att laka ur THC-innehållet. Efter filtrering indunstas lösningsmedlet och man får en sirapsliknande lösning med obehaglig lukt. Cannabisextraktet kan intas genom att det droppas på tobak och därefter röks. Cannabisextrakt är ganska ovanliga på den illegala narkotikamarknaden (2). 2

Effekterna börjar märkas inom ett par minuter vid rökning och vid oralt intag kan det ta upp till ett par timmar. Ruseffekten liknar eufori (lyckorus) och avkoppling, och varar några timmar. Det kan även ge muntorrhet, röda ögon, pratsamhet, sömnrubbningar, koncentrationsproblem och försämrat när- och långtidsminne. Effekterna varierar med dosen, administrationssättet, miljön och individens personlighet (4) (5). Vid långvarigt missbruk förvärras effekterna genom att missbrukaren då kan få abstinenssymptom i form av depression, hallucinationer, verklighetsuppfattningsstörning och psykoser. Även sinnesintrycken förvrängs och syn- och hörselupplevelserna påverkas, särskilt upplevelsen av musik och rytm, färg och form (2). 2.2 Syntetiska cannabinoider Syntetiska cannabinoider, även Spice, är syntetiska substanser som aktiverar cannabinoidreceptorer (läs mer i avsnitt 2.3.1 om cannabinoidreceptorer) och ger därmed ett cannabisliknande rus. Dessa verkar alltså på ett liknande sätt som det i cannabis naturligt förekommande THC. Ett vanligt tillvägagångssätt är att syntetiska cannabinoider blandas med ett lösningsmedel och sprayas på örter och säljs som örtblandning eller rökelse med varierande namn som till exempel Spice Gold, Spice Silver, Spice Diamond, Smoke, Ocean Blue, Genie, Pot-pourri och K2 där styrkan sägs vara skillnaden (6) (7). I beslagtagna blandningar har ett stort antal olika syntetiska cannabinoider identifierats. De vanligast förekommande är JWH-018, JWH-073 och CP47,497 (8). Ett företag från Frankfurt i Tyskland, THC-Pharma GmbH, var bland de första att identifiera JWH-018 som en primär psykoaktiv komponent i Spice och efter det har många andra laboratorier bekräftat förekomsten av syntetsika cannabinoider i Spice-blandningar (9). Syntetiska cannabinoider är eftertraktade av både unga personer som är nyfikna på droger och vana cannabismissbrukare. Att det används av cannbismissbrukare kan bero på att de vill undgå att bli testade positiv, då syntetiska cannabinoider inte kan påvisas vid rutin-drogtester. På grund av eftersläpande lagstiftning och skillnader i lagstiftning mellan olika länder kan en del syntetiska cannabinoider fortfarande vara legala. Efter förslag från Statens Folkhälsoinstitut har regeringen beslutat att klassificera vissa substanser som narkotika eller som hälsofarlig vara, detta på grund av snabb spridning och ökat missbruk av Spice. Den 15 september 2009 klassades sju olika Spice-substanser som olagliga i Sverige: CP47,497-C6, CP47,497-C7, CP47,497-C8, CP47,497-C9, JWH-018, JWH-073 och HU-210 (10). Ett år senare klassades ytterligare åtta substanser som olagliga (11). Efter lagstiftningen krävs tillstånd från Läkemedelsverket för att få importera, tillverka, exportera, handla eller inneha substanserna för vetenskapligt ändamål (10). Det syntetiska alternativet till cannabis har relativ stor spridning, de är åtkomliga på Internet och det är inga eller bara ett fåtal kontroller på webbsidorna. Dessa cannabinoider kan betraktas som nya designer drugs. Tillverkarna fortsätter producera nya substanser och ligger alltid ett steg före lagen (12). Nedan följer en tabell över huvudsubstanserna som har identifierats i Spice inklusive THC, vilka, förutom CP47,497, även är de substanser som analyserats i detta projekt. THC och de syntetiska cannabinoiderna är CB 1 och CB 2 agonister och är fettlösliga, opolära och små molkeyler med ungefär 20-26 kolatomer. De är rätt flyktiga och därmed rökbara (13). 3

Tabell 1. Information om THC, CP47,497, JWH-018 och JWH-073 THC Systematiskt namn: -9-tetrahydrocannabinol Kemisk formel: C 21 H 30 O 2 Molvikt: 314,45 g/mol Ki-värde: (bindnings-affiniteten): 10,2 nm (för CB 1 ) (13) THC kallas även Δ-9-tetrahydrocannabinol och är det huvudsakliga aktiva ämnet i cannabis. THC är fettlösligt och tas upp och lagras i små mängder i fettvävnader i kroppen. Det är en partiell agonist till CB 1. CP47,497 Systematiskt namn: 2-[(1R, 3S)-3-hydroxycyklohexyl]-5-(2- metyloktan-2-yl)fenol Kemisk formel: C 21 H 34 O 2 Molvikt: 318,492 g/mol Ki-värde: 9,54 nm (13) CP47,497 är en cyklohexylfenol och identifierades kort efter JWH-018 (12) och är jämförbar eller mer potent än THC (14). Det är en potent och selektiv CB 1 -agonist. JWH-018 Systematiskt namn: Naftalen-1-yl-(1-pentylindol-3-yl)metanon Kemisk formel: C 24 H 23 NO Molvikt: 341,45 g/mol Ki-värde: 9 nm för CB 1 (13) JWH-018 är den första substansen som rapporterades som aktiv substans i Spice, 2008 i Tyskland (12). Substansen tillhör gruppen aminoalkylindol. Den är potent och selektiv CB 2 - agonist och en potent CB 1 -agonist. JWH-073 Systematiskt namn: Naftalen-1-yl-(1-butylindol-3-yl)metanon Kemisk formel: C 23 H 21 NO Molvikt: 327,42 g/mol Ki-värde: 8,9 nm (13) JWH-073 är också en aminoalkylidol (en alkylhomolog av JWH-018) och agerar som en agonist för både CB 1 och CB 2. Den binder med högre affinitet till CB 1 än vad THC gör. 4

2.3 Cannabinoidernas farmakologi 2.3.1 Cannabinoidreceptorer En receptor är en proteinmolekyl som binder en specifik signalsubstans, kallad ligand, och vidarebefordrar signaler. Det finns specifika receptorer för cannabinoider. Det är de tre huvudgrupperna av cannabinoider, örtcannabinoider, endogena (kroppsegna) cannabinoider och syntetiska cannabinoider, som aktiverar cannbinoidreceptorerna. När dessa binder till receptorerna ger det upphov till farmakologiska effekter. Två huvudtyper av cannabinoidreceptorer har identifierats, CB 1 och CB 2 där CB 1 finns i hjärnan och orsakar de psykiska effekterna och CB 2 huvudsakligen i immunsystemet (15). Både CB 1 och CB 2 är G- proteinkopplade receptorer, som är den största familjen av receptorer. När G- proteinreceptorerna aktiveras av THC leder det till att nervcellens aktivitet dämpas vilket ger upphov till cannabiseffekterna (16). THC är en partiell agonist för CB 1 - och CB 2 -receptorer. En partiell agonist aktiverar en receptor men det medför inget maximalt svar medan en full agonist utlöser ett maximalt svar (17). Figur 2. Aktiva substanser i cannabis som föreställer nycklar passande i nyckelhålen som ska föreställa cannabinoidreceptorerna, där CB 1 främst finns i hjärnan och CB 2 i immunsystemet. * Cannabidol passar inte direkt till CB 1 och CB 2 men har indirekta effekter som fortfarande studeras. Man kan säga att cannabidiol är en indirekt antagonist för cannabinoid agonister. Man började förstå att endocannabinoider måste finnas då man visste om existensen av cannabinoidreceptorerna i hjärnan. De två främsta kroppsegna cannabinoiderna, vilka identifierades efter örtcannabinoiderna, är anandamid och 2-arakidonoylglycerol (figur 3) (18). Endocannabinoider är lipider. Anandamid metaboliseras lätt och har därför inte samma påverkningar på hjärnan som THC. Anandamid är en partiell agonist och 2- arakidonoylglycerol är en full agonist för både CB 1 och CB 2. Dessa finns inte lagrade i kroppen utan produceras och frisätts vid behov (19). 5

Figur 3. Kemisk struktur för (A) Anandamide och (B) 2-arakidonoylglycerol 2.3.2 Cannabis-metaboliter Efter intag sprids THC i kroppen. Det är fettlösligt och går snabbt över till hjärnan och distribueras främst till fettvävnader där det lagras. På grund av fettlösligheten sker omsättningen långsammare än för till exempel alkohol. Cannabis metaboliseras i levern. Successivt släpps substansen ut från fettvävnaderna och THC oxideras först till dess aktiva metabolit 11-OH-THC och sedan vidare till THC-COOH (11-nor- -9-karboxylsyra), se figur 4. Därefter konjugeras THC-COOH med en glukuronidgrupp för att få substansen vattenlöslig och möjliggöra utsöndring via urin (20). THC metaboliterna frigörs långsamt från vävnaderna och därför kan urinprover vara positiva under lång tid efter intag utan att ge upphov till ruseffekter (4). Figur 4. Strukturformler för (A) THC som vid metabolisering oxideras först till (B) 11-OH-THC och sedan vidare till (C) THC-COOH 2.3.3 Metaboliter av JWH-018 och JWH-073 Både JWH-018 och JWH-073 metaboliseras via oxidation och glukoronid-konjugering (21). Det finns lite information och redovisning om identifiering av hydroxylerade/konjugerade metaboliter av aminoalkylindoler. Ur en artikel från 20 april 2011 publicerad av American Chemical Society har resultat visat att efter intag av JWH-018 har glukuronerade konjugat av 6

5-(3-(1-naftoyl)-1H-indol-1-yl)-pentansyra och (1-(5-hydroxypentyl)-1H-indol-3-yl)(naftalen- 1-yl)-metanon utsöndras. Metabolit-profilerna som genererades då en person konsumerade en blandning av JWH-018 och JWH-073 gav liknande profil som när endast JWH-018 intogs. Oxiderade metaboliter av JWH-018 och JWH-073 gav samma mönster men JWH-018 metaboliterna utsöndrades vid lägre koncentration. Bristen på referenssubstanser för metaboliter av syntetiska cannabinoider har hindrat utvecklingen av standardiserade analysmetoder för kliniska och kriminaltekniska laboratorier (9). 2.4 Laboratorieanalyser för att påvisa cannabinoider Att med laboratorieanalys påvisa droger är arbetskrävande, relativt kostsamt och kräver oftast specialiserad utrustning såsom masspektrometri. Ett vanligt förfarande är därför att använda en billigare, enklare och mindre selektiv metod för att sålla ut prover. En sådan metod kallas vanligen för screening, men även begreppet sållning används. För cannabis baseras sållningsmetoden på immunologiska metoder där antikroppar identifierar THC-COOH. Den efterföljande kvantifieringen kallas verifiering, vilken oftast utförs med hjälp av GC-MS. Till verifiering går de positiva screeningresultaten (4). GC-MS (mer generell beskrivning om GC- MS beskrivs i avsnitt 3) är en analytisk teknik för separation, kvantifiering och identifiering av till exempel droganalyter, speciellt vid låga koncentrationer. Denna bestämning har hög selektivitet och känslighet. Syftet med verifieringen är att man vill minimera antalet falskt positiva prover, ge ytterligare information om identitet och försäkran om identiteten för det detekterade provet (22). GC-MS har visat sig vara en mycket känslig och reproducerbar metod och är på många laboratorier det huvudsakliga verktyget för verifiering av droger i urin. De flesta föreningarna i urin är konjugerade och ej flyktiga och måste därför dels hydrolyseras och dessutom derivatiseras innan analys med GC (23). Drogtester för detektion av syntetiska cannabinoider i urin är för närvarande inte helt utvecklat, utan dessa passerar vanligtvis oupptäckta vid missbruksanalyser. Det vanligaste för droger när de analyseras i urin är att modersubstansen förekommer i lägre koncentrationer än många metaboliter och då kan man förlita sig på att mäta den metaboliserade varianten av drogen som förekommer i högst koncentrationer, den så kallade huvudmetaboliten. Kunskapen om hur syntetiska cannabinoider metaboliseras är fortfarande inte så välutvecklad, men föreslagna hydroxylerade och karboxylerade metaboliter av JWH-018 och JWH-073 finns (21). I vissa laboratorium finns metoder för detektion av syntetiska cannabinoider i blod (24). Redwood Toxicology Laboratory har gjort analyser för syntetiska cannabinoider i urin och i oral vätska. För syntetiska cannabinoider i urin har de inga cut-off nivåer, så för JWH-018 och JWH-073 redovisas resultat som detekterad eller inte detekterad. I oral vätska har kvantitativa tester redovisats och cut-off nivån där är 0,5 ng/ml för JWH-018, JWH-073 och JWH-250. De har även redovisat att metaboliter av JWH-018 och JWH-073 i urin kan detekteras upp till 72 timmar efter intag av enstaka låg dos. Huvudsubstanser i oral vätska går att detektera 24-48 timmar efter intag (21). 7

3 Generell beskrivning av använda metoder 3.1 Gaskromatografi Gaskromatografi är en kromatografisk metod som separerar i huvudsak olika lågmolekylära föreningar som färdas med olika hastighet genom en kolonn beroende på deras fysikaliska egenskaper såsom kokpunkt och polaritet. En gaskromatograf (se figur 5) består av en injektionsport där prov som är i vätskefas injiceras genom ett septum in till en varm port och förångas för att sedan kunna transporteras i kolonnen med hjälp av en mobilfas. Förångningen kan ske med olika tekniker, där provet injiceras med split, splitless eller on-column teknik (i detta projekt användes on-column som beskrivs närmare i avsnitt 3.1.3). Provet separeras och detekteras i en detektor och ett kromatogram uppkommer på en dataskärm. För att föreningar ska kunna anlyseras med GC måste de vara flyktiga och termiskt stabila (24). Figur 5. Schematisk figur över en gaskromatograf (25). 3.1.1 Kolonnen Det finns två typer av kolonner, packad kolonn och kapillärkolonn. Vanligast är att man har en kapillärkolonn, där en tunn vätskefilm, den så kallade stationärfasen, ligger belagd på väggarna på kolonnens insida. Stationärfasen utgörs av en kiselpolymer, vanligen kiseloxid (SiO 2 ) som har olika funktionella grupper som metyl, fenyl och cyanopropyl. Kolonnen sitter i en ugn med en inställd temperatur vilket gör att analyterna förångas under transporten genom kolonnen och interagerar med den stationära fasen. Ju mer analyterna interagerar med stationärfasen desto längre tid kommer de att spendera i kolonnen och därmed ge separation av analyterna. Temperaturen kan ställas in i en temperaturgradient, där temperaturen höjs vartefter, vilket medför att alla analyter med kokpunkter inom temperaturintervallet förångas och separeras. Ju mer polär analyterna man vill separera är desto mer polär vill man att stationärfasen är och har man opolära analyter vill man ha en opolär stationärfas. Mängd och polaritet på stationärfasen, temperaturen på kolonnen och mobilfasens flödeshastighet är de huvudsakliga faktorerna för att få två analyter separerade från varandra. Kolonnens längd kan variera från 15-100 m, där 30 m är den vanligaste längden, och dess innerdiameter är 0,2-0,8 8

mm (26). Fördelar med kapillärkolonn är att de ger högre upplösning, kortare analystid och större sensitivitet än packade kolonner men nackdelen är att de har mindre provkapacitet (27). 3.1.2 Mobilfasen Gaskromatografen har en rörlig mobilfas, även kallad bärgas i form av en inert gas. Vanligast är helium, kvävgas eller vätgas, som transporterar analyterna från injektorn genom kolonnen till detektorn. Vid val av mobilfas vill man ha så liten teoretisk botten (plate height, H) som möjligt. Vid låg teoretisk botten kan fler jämvikter ställa in sig under separationen och det leder till en bättre separation och smalare toppar. Van Deemterkurvan (figur 6), visar hur H beror på flödeshastigheten (û) och valet av mobilfas. Snabbast separation sker med vätgas men är inte kompatibel med masspektrometrar som använder vakuumpump med olja då vätgasen bryter ner oljan. Det finns även oljefria lamell-vakuumpumpar men de är dyrare och är inte så vanliga. Vätgas är även olämpligt att använda på grund av risk för knallgasexplosion även om denna risk är liten. Kvävgas ger lägst H men endast vid låg flödeshastighet (27). Figur 6. Van Deemterkurva, där y-axeln är H (plate height) i mm och x-axeln flödeshastigheten av bärgasen i cm/s (28). 3.1.3 Injiceringsteknik On-column De olika injiceringsteknikerna som finns är split, split-less och on-column injektion. Vid oncolumn injektion, som har använts vid projektets analyser, injiceras provet direkt i kolonnen, till skillnad mot split och split-less där provet injiceras in i en injektor först. On-column injektion kan vara att föredra vid kvantitativa analyser, då denna ofta ger en känsligare metod. Det är även en bra injektionsteknik då man har prover som sönderfaller vid temperaturer som är högre än deras kokpunkt. Temperaturen på kolonnen är tillräckligt låg för att kondensera provet i ett smalt lösningsmedelsband i början av kolonnen. Uppvärmning av kolonnen initierar till kromatografi (27). 9

Figur 7. On-column injektion (29). 3.2 Masspektrometer som detektor vid GC-analys Analyterna går vidare från gaskromatografen in i masspektrometern genom en transfer line. Masspektrometern är en känslig detektor som ger både kvalitativ och kvantitativ information. Med denna teknik går det att studera molekylers massa och fragmentering, vilket kan ge information om molekylens identitet och struktur. De gasformiga analyterna joniseras, jonerna accelereras i ett elektriskt fält för att sedan separeras utifrån deras förhållande mellan massa (m) och laddning (z). En typ av massanalysator som är populär inom analytisk kemi är kvadrupolinstrument. Kvadrupolen består av fyra metallstavar som sitter parallellt med varandra där en växelspänning har lagts på mellan stavarna (se figur 8). Det är kvadrupolen som filtrerar och separerar jonerna. När jonerna når kvadrupolen får de en vågrörelse och beroende på jonernas masstal blir vågrörelsen olika för de lika jonerna. Joner som färdas genom kvadrupolen med rätt m/z uppnår en jämn vågrörelse och når detektorn medan resterande joner kolliderar med stavarna och neutraliseras och når aldrig detektorn. Genom att spänningen varieras kan olika masstal nå detektorn. Figur 8. Kvadrupolinstrument med fyra metallstavar och växelspänning (30). 10

Efter att jonerna har separerats i massanalysatorn träffar de detektorn som ger utslag med en intensitet som är proportionell mot hur mycket av varje jonslag som förekommer. Alla masspektrometrar är utrustade med ett vakuumsystem eftersom separation och detektering av joner kräver att de accelereras i ett elektromagnetiskt fält. Kollisionen med luftmolekyler skulle annars innebära att jonerna aldrig skulle kunna nå detektorn. Detektorn mäter intensiteten av jonerna och skickar informationen till ett dataprogram som samlar in datan. Ett vanligt sätt att återge masspektrometrisk data är i ett masspektrum. Ett masspektrum visas i figur 9. På ett masspektrum är kvoten m/z avsatt på x-axeln. Eftersom z ofta är 1 så är värdet på x-axeln lika som jonens massa, m. På y-axeln är den relativa jonintensiteten avsatt. Vilket betyder att den mest förekommande jonen bestäms till ett värde av 100 och de andra detekterade jonerna får ett värde som är relativt till detta. Man brukar använda sig av ett referensbibliotek för att tyda ett masspektrum. Figur 9. Masspektrum för bensoesyra. 122 motsvarar molvikten för bensoesyra. 105 visar att det finns en hydroxylgrupp, 77 visar att det finns en bensenring och 28 visar att det finns en karbonylgrupp i strukturen (31). Två av de vanligaste teknikerna för att samla in joner är fullscan och SIM. Fullscanning av joner ger registrering av ett intervall av joner inom de parametrar som angetts, till exampel 50-600 m/z. Kvadrupolen scannar över det valda masstalsintervallet så att alla joner registreras och hela spektra upptas. Att kvantifiera en förening vid fullscanning kan vara svårt då många föreningar har samma massa. Med SIM (selected ion monitoring) mäts endast en eller ett antal utvalda massor. Kvadrupolen hoppar mellan masstalen för de utvalda jonerna och dessa joner mäts under en längre tid jämfört med fullscanning, vilket ger ett enklare kromatogram och signalintensiteten blir högre för SIM än vad som observeras för fullscanning (27). 3.2.1 Joniseringstekniker För GC-MS är de vanligaste joniseringsteknikerna elektronimpaktjonisering och kemisk jonisering som kan vara inställd på positive mode där positiva joner mäts eller negative mode där negativa joner mäts. 11

Elektronimpaktjonisering (EI) Molekyler går in i jonkällan och bombarderas av elektroner som accelereras genom ett elektriskt fält på 70 ev. Så gott som alla stabila molekyler har ett jämnt antal elektroner och när en elektron lossnar kallas den resulterande katjonen (positivt laddad) med en oparad elektron för molekyljon och betecknas M +. Efter joniseringen har M + vanligtvis tillräckligt med inre energi kvar för att brytas ner till fragment (27). Alla molekyler kan fragmenteras med elektronimpaktjonisering vilket gör masspektrometri till en lämplig detektor vid gaskromatografi (32). Kemisk jonisering (CI) Kemisk jonisering ger normalt mindre fragmentering än EI, detta på grund av att lägre energi används vid processen. Jonkällan är fylld med reagensgas som vanligtvis är metan, men isobutan eller ammoniak används också. Joner produceras genom kollision av analyt med joner av reagensgasen. Negativ kemisk jonisering (NCI) väljer ut negativa joner. Om man har en analyt som joniseras väl under NCI så erhålls vanligen en högre känslighet än vid positiv jonisering, såsom elektronimpakt jonisering och positiv kemisk jonisering. Orsaken till detta är att de flesta molekyler generar mer positiva joner än negativa och bakgrundsbruset blir därför lägre vid negativ jonisering. Negativ jonisering fungerar ofta väl för föreningar med en elektronaffinitet högre än 0,5 ev, som till exempel halogenerade föreningar (33). 3.3 Derivatisering Alla analyter kromatograferar inte lika bra i GC så för att få analyterna i rätt kemisk form som är mer kompatibel för GC-miljö används derivatisering. Derivatisering ökar flyktigheten, stabiliteten och separationsselektiviteten hos analyten. De blir mindre polära så att de inte ska adsorberas till den stationära fasen vilket ger mer symmetriska och separerade toppar på kromatogrammet (34). Derivatiseringstiden varierar för de olika analyterna att bli fullständigt derivatiserade. Många analyter reagerar så fort reagenset har lösts medan andra analyter med sämre löslighet kräver uppvärmning, ca 70 C 20-30 minuter. Vid extrema förhållanden kan det krävas upp till 16 timmar för att driva hela reaktionen. Om inte derivatiseringen blir fullständig kan man tillsätta katalysator, höja värmeugnen till högre temperatur, låta proven stå under längre tid och/eller ha högre koncentration på reagenset (35). Beroende på vilka funktionella grupper som man vill derivatisera så finns olika derivatiseringsreagens att tillgå, vilka kan derivatiseras med hjälp av olika reaktioner. Silylering är en vanlig reaktion för GC-analyser och används för att skydda alkoholer, karboxylsyror, fenoler, aminer och amider. Vid silylering byts det aktiva vätet ut mot en alkylsilyl grupp, ofta trimetylsilyl (TMS, Si(CH 3 ) 3 ) (35). Se figur 10 nedan, reaktion för silylering. 12

Figur 10. Reaktionsmeaknism för silylering Två andra vanliga metoder för derivatisering är acylering och alkylering. Vid acylering används ofta perfluorerade reagens som ger stabila och flyktiga derivat med alkoholer, aminer och fenoler. Trietymamin (TEA) och trimetylamin (TMA) är baser som ofta tillsätts för att främja reaktionen. Önskvärt är också att katalysatorn har förmågan att sänka halten av syror som bildas som biprodukter vid derivatiseringsreaktionen, dels hjälper detta till att driva reaktionen fullständigt och dels förhindras att den analytiska kolonnen skadas. TFAA (trifluoroättiksyraanhydrid) är det reagens som är mest reaktiv och mest flyktigt vid acylering. Inga biproduker bildas vid derivatisering med TFAA. Aminosyror och steroider är analyter som är vanligast vid derivatisering med TFAA. Andra perfluorerade reagens som PFPA (pentafluorpropionsyraanhydrid), PFBCl (pentafluorobensoylklorid) och HFBA (heptafluorobutylsyraanhydrid) används för alkoholer, aminer och fenoler. Derivaten kräver låg analystemperatur (36). Vid alkylering byts det aktiva vätet ut på karboxylsyror, alkoholer, tioler och aminer mot en alkylgrupp (37). Oximering är en typ av derivatisering som används för ketogrupper där hydroxylaminsubstanser, till exempel metoxylaminhydroklorid (MOX). Hydroxylaminerna används med fördel tillsammans med en bas, som till exempel pyridin, för att hydroxylaminen inte ska vara i salt-form. Ketogruppen omvandlas till ett MO-TMS derivat efter tillsats av MOX som oximeringsreagens följt av silylering med TMS (38). Analyten är då termostabil och lämplig för GC-analys. Figur 11 nedan visar reaktionen för oximering. Figur 11. Reaktionsmekanism för oximering I bilaga 1 visas strukturformel för de derivatiseringsreagens som huvudsakligen användes under projektet. 13

4 Experimentellt 4.1 Lösningar De syntetiska cannabinoidsubstanserna JWH-018 och JWH-073 beställdes som Cerilliantampuller ifrån LGC Standards, Borås. Koncentrationen var 100 µg/ml. CP47,497 var tänkt att användas och beställdes även den ifrån LGC Standards, men kunde inte levereras inom projektets tidsram. Bensofenon, derivatiseringsreagens och övriga kemikalier fanns tillgängliga på laboratoriet på Sahlgrenska universitetssjukhuset. BSTFA derivatiseringsreagens innehöll: N,O-Bis(trimetylsilyl)-trifluoroacetamid, med tillsats av 1% Trimetylklorsilan som hjälper att driva silyleringen. JWH-018 Stam 1: 100 µg/ml Stam 2: Stam 1 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 1,0 µg/ml JWH-073 Stam 1: 100 µg/ml Stam 2: Stam 1 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 1,0 µg/ml Bensofenon Stam 1: 22 mg/ml Stam 2: Stam 1 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 220 µg/ml Stam 3: Stam 2 späddes 1:100 med MeOH vilket gav en koncentration på 2,20 µg/ml 4.2 Instrumentella betingelser 4.2.1 GC-MS system Analyserna utfördes på en TRACE GC Ultra gaskromatograf och en DSQ II Single quadrupol masspektrometer, båda ifrån Thermo Scientific (Waltham, Ma, USA). GC:n var utrustad med en J&W Scientific kolonn (Agilent, Santa Clara, CA, USA), HP5 MS 30 m 0,250 mm 0,25 µm, med en opolär 5% fenyl stationärfas. Som bärgas användes helium, 1,5 ml/minut. Injektionsvolymen var 1 µl och on-column injektion användes för alla analyser. Initialtemperatur för GC:n var 40 C i 1 minut därefter ökning med 20 C/minut till 190 C där den låg i 0 minuter och nästa ökning var på 15 C/minut till 295 C där den låg i 20 minuter. Mängd injicerat prov i autoinjektorn var 1 µl. Temperatur för transfer line var 280 C och jonkällans temperatur var 230 C. Om inte annat nämns så användes EI-jonisering för masspektrometern. All data samlades in fullscan-mode med massintervallet 50,0-650,0 m/z och bearbetades med hjälp av Xcaliburprogramvara (Thermo Scientific). 4.3 Metod Här beskrivs utförande vid försökens gång. All EtAc som använts är torkad genom tillsats av natriumsulfat, ca 100 g/l, om inte annat anges. 14

Olika derivatiseringsreagens testades för att få tillräcklig bra känslighet och selektivitet för substanserna. JWH-073 och JWH-018 har båda en liknande struktur på molekylen med en ketogrupp, vilken är den enda tillgängliga gruppen för derivatisering. Initialt så testades silylering och oximering för att derivatisera JWH-018 och JWH-073 substanserna. Då molekylen är något steriskt hindrad är det svårare att hitta ett derivatiseringsreagens som reagerar fullständigt med substansen. För att öka reaktiviteten hos substanserna provades reducering av ketogruppen till en hydroxylgrupp. Provupparbetning med silylering och oximering Referenssubstans späddes med MeOH 1:100 = stam 1. Stam 1 av referenssubstansen överfördes till provrör och indunstades till torrhet med vakuum i en SpeedVac. Olika volym referenssubstans av stam 1 överfördes till provrör, men vanligaste volymen var 200 µl. Derivatiseringsreagens tillsattes, både BSTFA, MOX och HOX testades. Därefter värmdes provet i en värmeugn där olika temperaturer och tider valdes mellan försökens gång. Efter derivatiseringen med BSTFA späddes provet cirka 1:5 med etylacetat. För övriga derivatiseringsreagens indunstades provet igen till torrhet under vakuum i en SpeedVac och löstes därefter upp i ett organiskt lösningsmedel lämpligt för injektion på GC:n, vanligtvis EtAc eller isooktan. Till sist sattes provet i autosamplern för analys med GC-MS Provupparbetning med reducering av ketonen Då varken BSTFA, MOX eller HOX gav bra resultat i de första försöken testades reducering med NaBH 4, där ketonen omvandlas till en hydroxygrupp, för att sedan derivatisera hydroxygruppen med BSTFA, PFBCl eller TFAA. Vid reducering tillsattes först reduceringsreagens, NaBH 4, till referenssubstansen stam 1 som fick stå i ca 5 min. Därefter indunstades provet till torrhet och sedan fortsatte samma upparbetningsmetod som innan (provupparbetning med silylering och oximering). Provupparbetning med fasseparering Då inte derivatisering av reducerat bensofenon fungerade så testades fasseparering för att bli av med överblivet reduceringsmedel och biprodukter som eventuellt kan interferera med derivatiseringen. Detta utfördes genom att lika volym av avjoniserat vatten och EtAc tillsattes efter reducering med NaBH4. Provet skakades och fick stå i ett par minuter varvid två olika faser skiktades i provröret. Organ-fasen överfördes till nytt provrör och indunstades till torrhet i en SpeedVac. Därefter tillsattes derivatiseringsreagens och provet värmdes i värmeugn vid olika temperaturer och tidsperioder. Varpå provet indunstades igen och löstes upp i ett organiskt lösningsmedel lämpligt för injektion på GC:n, vanligtvis EtAc eller isooktan. Till sist sattes provet i autosamplern för analys. Olika derivatiseringsreagens testades även här, BSTFA, PFBCl och TFAA. Bensofenon användes som en kontroll på att derivatiseringen fungerade och derivatiserades parallellt med de syntetiska cannabinoiderna när olika derivatiseringsreagens testades. Provupparbetningen gick till på samma sätt med reducering och fasseparering. Bensofenon har en ketogrupp som har en struktur liknande JWH-018 och JWH-073. 15

O Figur 12. Strukturformel för bensofenon, molvikt: 182 g/mol Efter ett par försök ändrades provupparbetningen genom att provet löstes upp i isooktan efter fassepareringen och indunstningen. En blandning med isooktan och trietylamin tillsattes till provet. Därefter tillsattes derivatiseringsregens och provet värmdes i en värmeugn vid olika temperatur och tidsperioder. Därefter tillsattes 5 %-ig ammoniaklösning och provet skakades tills vit rök hade försvunnit. Provet centrifugerades så två tydliga faser bildades. Isooktanfasen överfördes till en vial och sattes sedan i autosamplern för analys med GC-MS. Försöket gav ett lyckat resultat, därför har försök med JWH-substanserna därefter testats. Provupparbetningen gick där till på samma sätt med BSTFA och TFAA som derivatiseringsreagens och där temperatur i värmeugnen höjdes och tiden i ugnen förlängdes till 1-3 timmar. Nedan visas fullständig försöksgång för provupparbetning som gav resultat för derivatiserade JWH-substanser. 200 µl JWH-018 stam 2 överfördes till provrör. Ca 10 mg NaBH4 tillsattes och provet stod i ca 5 min. Provet tvåfasextraherades med hjälp av 1 ml etylacetat och 2 ml dh2o. Provet skakades och stod sedan i 5 min. EtAc-fasen överfördes till ett nytt provrör. EtAc-fasen indunstades vid 35 C i 15 min. För TFAA derivatisering löstes provet upp i 0,5 ml isooktan och 50 µl av 5 % trietylamin i isooktan tillsattes, varefter 20 µl TFAA adderades. För BSTFA derivatisering tillsattes 20-100 µl BSTFA till provet. Provet värmdes i värmeugn där temperatur från 70-115 C testades samt tiden varierade mellan 1-3 timmar. Efter uppvärmningen så späddes BSTFA-proverna ca 1:5 med EtAc innan de sattes i autosamplern för analys med GC-MS. Till TFAA-proven tillsattes 1 ml 5 % ammoniaklösning. Provet skakades tills all vit rök hade försvunnit. Provet centrifugerades ner så att två tydliga faser bildades och isooktan-fasen överfördes till en vial som sattes i autosamplern för analys med GC-MS. 16

Relative Abundance 5 Resultat Resultat på TIC-kromatogram och masspektran från olika derivatiseringsförsök visas i detta avsnitt. Försöken att derivatisera ketogruppen direkt med hjälp av BSTFA eller med oximeringsreagens resulterade inte i några detekterbara derivat. Därför övergick metoden till att försöka reducera ketogruppen kemiskt med hjälp av NaBH 4. Som en kontroll på att reducering och derivatiseringsbetingelserna var gynnsamma användes bensofenon parallellt med JWH-substanserna. Genom detta förfarande sågs att kvarvarande reduceringsmedel eller biprodukter ifrån reduceringen störde derivatiseringen och en tvåfasextrahering infördes. Resultat för oderivatiserad JWH-073 och JWH-018 visas i bilaga 2 och 3. RT: 12.00-17.00 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 14.11 14.14 12.25 12.54 12.84 13.86 15.55 15.29 15.81 15.07 15.20 15.85 15.91 14.80 14.69 14.74 16.17 16.27 14.44 14.51 16.55 14.35 0 12 13 14 15 16 17 Time (min) Figur 13. TIC-kromatogram av reducerat bensofenon, benshydrol NL: 3.75E7 m/z= 180.39-186.25 MS Der_BF_11 0418_henri ks Resultatet i figur 13 visar att reducering med NaBH 4 av bensofenon fungerade bra. 17

Relative Abundance Relative Abundance RT: 6.00-12.00 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 6.43 6.60 7.02 7.09 7.18 7.25 7.99 8.06 8.22 8.38 8.48 6 7 8 9 10 11 12 Time (min) 9.53 9.66 10.02 10.13 10.51 Der_BF_110418_henriks_1_100 #355-358 RT: 9.52-9.56 AV: 4 SB: 149 7.17-9.06 NL: 2.87E7 T: + c Full ms [50.00-650.00] 100 167.10 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 73.01 165.08 152.07 179.11 H 3 C H 3 C Si CH 3 O 241.14 256.17 74.07 257.19 104.07 115.04 139.05 63.02 181.11 211.12 258.18 286.11 100 150 200 250 m/z Figur 14. Resultat av reducerat bensofenon derivatiserat med BSTFA NL: 2.91E8 TIC MS Der_BF_11 0418_henri ks_1_100 Figur 14 visar kromatogram och spektrum från experiment där bensofenon reducerats till benshydrol och derivatiserats med BSTFA. Tydliga joner kan ses vid 256 m/z (183+73) som är benshydrol+tms, vid 167 m/z (183-16) som är benshydrol O, och vid 165 m/z (183-18) som är benshydrol H 2 O. 18

Relative Abundance Relative Abundance RT: 5.00-10.00 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 6.10 6.81 7.74 6.72 7.48 7.63 6.15 6.65 9.57 8.70 9.48 8.45 8.54 0 5 6 7 8 9 10 Time (min) 9.61 NL: 1.06E7 TIC MS BF_TFAA_ 110509_sp 01_bf_tfaa BF_TFAA_110509_sp01_bf_tfaa #142-145 RT: 6.80-6.84 AV: 4 SB: 69 5.08-5.94 NL: 8.38E5 T: + c Full ms [50.00-650.00] 165.08 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 152.11 O F F O O F 40 35 30 25 77.09 20 280.05 15 168.16 82.18 105.02 10 115.07 139.09 5 89.11 128.09 183.07 281.06 207.04 221.08 253.57 267.11 0 100 150 200 250 m/z Figur 15. Resultat av reducerat bensofenon derivatiserat med TFAA Liknande förfarande användes sedan för derivatisera med hjälp av TFAA. Figur 15 visar kromatogram och spektrum ifrån ett experiment där bensofenon reducerats till benshydrol och derivatiserats med TFAA. Tydliga joner kan ses vid 280 m/z (183+97) som är benshydrol+tfa, vid 167 m/z (183-16) som är benshydrol O, och vid 165 m/z (183-18) som är benshydrol H 2 O. 19

Relative Abundance Relative Abundance RT: 12.00-20.00 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 17.27 15.06 15.79 12.70 14.32 13.54 16.59 17.36 12.85 16.24 18.80 13.60 19.61 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Time (min) NL: 3.93E6 m/z= 287.70-288.70+ 325.70-326.70+ 414.70-415.70 MS Test_JWH_BSTF A_3 Test_JWH_BSTFA_3 #909-913 RT: 17.26-17.31 AV: 5 SB: 22 16.77-17.04 NL: 1.19E6 T: + c Full ms [50.00-650.00] 100 73.05 288.17 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 75.04 77.03 326.18 120.02 170.02 192.06 254.06 415.20 H 3 C Si O CH 3 CH 3 358.10 390.42 439.52 504.09 551.18 593.18 100 200 300 400 500 600 m/z Figur 16. Resultat av JWH-018 derivatiserat med BSTFA vid 115 C i 3 timmar N CH 3 Att överföra resultaten ifrån bensofenon till JWH-substanserna visade sig svårare än förutsett. Derivatisering med BSTFA av reducerat JWH-073 eller JWH-018 vid 70 C gav inget resultat. Därför provades derivatisering med TFAA och under olika förhållanden och med antingen pyridin eller trietylamin som katalysatorer. Dessa experiment gav heller inga noterbara derivat. Nästa steg var därför att prova mer extrema förhållanden. Derivatisering av reducerat JWH- 018 med BSTFA vid 115 C gav ett TMS-derivat. Figur 16 visar kromatogram och spektrum ifrån ett experiment där JWH-018 reducerats och derivatiserats med BSTFA. Tydliga joner kan ses vid 415 m/z som är JWH-018+TFA, vid 326 m/z (415-73-16) som är JWH-018 O. 20