Övergångar mellan vibrationsnivåer i grundtillståndet Infraröd spektroskopi
Lägre energier än VIS
Infraröd spektroskopi Övergångar mellan vibrationsnivåer i grundtillståndet Intensiteten är relaterad till övergångsdipolmomentet Dikroism kan observeras i orienterade tillstånd Polymerer ger nya egenskaper i spektra jfrt monomerer pga koppling mellan näraliggande övergångsdipolmoment
Intensiteten av ett vibrationsabsorbtionsband beror på storleken av övergångsdipolmomentet. μ ba = <Ψ b μ Ψ a > Hur ser vågfunktionerna ut för grundtillståndet och det exiterade vibrationstillståndet? OBS: Vi måste ta hänsyn till både kärnor och elektroner för vibrationsövergångar, eftersom det är kärnorna som vibrerar! v v Ψ(r e, r n )
Born-Oppenheimer-approximationen Vi kan dela upp den totala vågfunktionen i ψ för elektronernas och N för kärnornas bidrag (r e : elektronkoordinater, r n : kärnkoordinater). Då kan vi skriva vågfunktionen som Ψ (r e, r n ) = ψ (r e, r n ) N (r n ) och övergången som ψ (r e, r n ) N v (r n ) ψ(r e, r n ) N v (r n ) Tillstånd v Tillstånd v
Intensiteten av ett vibrationsabsorbtionsband beror på storleken av övergångsdipolmomentet. μ ba = <Ψ b μ Ψ a > Hur ser vågfunktionerna ut för grundtillståndet och det exiterade vibrationstillståndet? OBS: Vi måste ta hänsyn till både kärnor och elektroner för vibrationsövergångar! Born-Oppenheimer-approximationen: Vi kan dela upp den totala vågfunktionen i Ψ för elektronernas och φ för kärnornas bidrag (r: elektronkoordinater, R: kärnkoordinater). Då kan vi skriva övergången som
Om kärnorna står still beror övergångsdipolmomentet endast av Ψ, och blir 0 eftersom φ v, v är ortogonala Men om kärnorna får vibrera kan man visa med hjälp av taylorutveckling att väntevärdet blir följande: Ändringen i dipolmoment då kärnorna ändrar läge
Om kärnorna står still beror övergångsdipolmomentet endast av Ψ, och blir 0 eftersom N v,n v är ortogonala ψ*n v * μ ψ N v dτ = ψ* μ ψ dτ N v * N v dτ Men om kärnorna får vibrera kan man visa med hjälp av taylorutveckling (där q = 0 är kärnornas jämviktsposition) att väntevärdet blir följande: ψ*n v * μ ψ N v dτ = ψ*[δμ(r e )/δ q] q=0 ψ dτ N v * q N v dτ ändringen i dipolmoment då kärnorna ändrar läge Om molekylens dipolmoment ändras under vibrationen sker alltså IR-absorbtion!
Om molekylens dipolmoment ändras under vibrationen sker alltså IR-absorbtion: Klassisk analogi: μ = qr, δμ/δr = q R +q -q Ju större laddningar, desto större dipolmoment desto större absorbtion!
Biomolekylära IR absorbtionsband
Vi kan se ändringar i molekylbindningskaraktär Identifiering av syntetiserade substanser (-OH, -COOH, -COH) Karakterisering av material (de flesta absorberar IR) Kovalenta bindningar: enzymatiska omvandlingar Icke-kovalenta bindningar: vätebindningar Isotopshift ( 1 H mot 2 H) Hydrofoba bindningar: membraner, lipider Proteinstrukturer Biomolekylära interaktioner
Hur ser provcellen ut? Mätningar i KBr pellet: enklast I lösning: fysiologiskt, dock H 2 O- absorbtion Välj fönster med omsorg! Måste vara transparenta (BF,CaF, ZnSe, NaCl osv) Kyvettlängd ~6 μm ATR (attenuated total reflection): En film av proteinet eller membranytan läggs på IRSkristallen
Vatten-effekter
IR FT-IR Svepa över våglängdsområdet med en våglängd i taget Antal lyckade experiment är få Fourier Transform - teknik Varje experiment lyckas! Stort antal exp för att täcka våglängdsområdet Lågt signal/brus Tar tid de flesta experiment ger inget resultat Ett accord av frekvenser Vi får snabbt ett resultat! Summering av många experiment ger hög känslighet
Första experimentella bekräftelserna på Watson-Crick basparning kom från IR-spektroskopi A+U G+C GC AU
1:1 binding av baser: bevis från IR-titreringar VanHolde s 455
Linjärpolariserat ljus har stor användning inom IR, eftersom vi kan orientera våra prover på provcellen : A II och A kan relateras till den molekylära orienteringen.
Linjärdikroism för orienterade DNA-molekyler Vilken kurva visar T och vilken visar T II med helixaxeln?
Linjärdikroism för orienterade DNA-molekyler ger stigningsvinkeln T : T II : VanHolde s 471 Vibrationer i bas-planet ger större absorbans/minskad transmittans då ljuset är polariserat parallellt med baserna (vinkelrät mot helixaxeln) eftersom det då är parallellt med övergångsdipolmomentet. Ur skillnaden mellan T II och T kan vinkeln mellan basplanet och helixaxeln beräknas.
Kovalenta bindningar: intermediat och produkter i enzymatiska reaktioner Barth et al., JBC 1997 Differensspektra av två Ca2+-release reaktioner från fosforylerat (tunn linje) och icke-fosforylerat ATPas (tjock linje)
Tidsupplösta spektra (0.3-0.4 ms diff) av bakteriorhodopsins olika ljus-inducerade fotointermediat
Kan struktur avläsas? Poly-g-benzyl-L-glutaminsyra Heldragen linje: ljus polariserat parallellt med fiberriktningen Streckad linje: polariserat ljus ortogonalt mot fiberriktningen Tsuboi, J. Poly. Sci., 1962
Hur känsligt är IR för sekundärstruktur? β-sheet Random coil α-helix
Övergångsdipolernas samverkan eller motverkan gör övergångarna tillåtna eller förbjudna Antiparallellt β-sheet α-helix Miyazawa, J Chem Phys, 1960 D 10 > D 30 > D 20
Hur utvärdera sekundärstruktur? -Utvärdering av andraderivatan -Fourier self-deconvolution (spectral deconvolution)
Exempel på utvärderingsprocess Steg 1 Steg 2 irreguljär β-sheet Olika sorters β-sheet
Membranproteiner vi kan studera både proteinet β-sheet/turn α-helix Dynamic / 3 10 helix Random coil Dynamic/3 10 -helix Bundle Monomer
och dess effekt på lipiden ATR dikroism spektra av multibilayer utan och med protein: en organisering! Sal-Man et al., Biochemistry 2002, Preassembly of membrane active peptides is an important factor in their selectivity toward target cells.
Denatureringar Nativt tendamistat: denatureringsmittpunkt 82 ºC Muterat tendamistat: Lägre denatureringstemp, aggregering vid högre temperaturer
Vilken ger differensspektra?