Biokemisk analys och separationsteknik VT08

Biokemisk analys och separationsteknik VT08 Rening, inmärkning, analys av affinitetsliganden Z inför detektion av IgG Institutionen för Bioteknologi Kungliga Tekniska Högskolan Jesper Gantelius Marcus Gry Björklund Karin Larsson Anna Konrad Nina Kronqvist Maja Neiman Johanna Steen Cecilia Eriksson Sophia Hober Med ett stort tack till tidigare assar: Malin Andersen, My Hedhammar, Ronny Falk, Mats Lindskog, Anders Andersson, Björn Renberg, John Löfblom, Torun Engfeldt, Erik Vernet, Tove Alm, Sebastian Grimm, Margareta Ramström, Caroline Grönwall, Mikaela Friedmann, Pawel Zajac, Per-Åke Löfdahl seppen@biotech.kth.se

Introduktion Ett omfattande forskningsarbete pågår runt om i världen för att skapa affinitetsligander till proteiner av analytiskt intresse. En molekyl som vunnit i popularitet är proteinet Z, vilken binder med hög affinitet till human IgG. Z används frekvent i en rad detektionsoch reningsmetoder, och i denna laboration används Z för koncentrationsbestämning av IgG. Ett sätt att skapa en detektionsmetod för proteiner är att märka in affinitetsligander med en fluorescerande grupp. Fluoroforen gör att liganden blir detekterbar och man kan på så vis studera dess inbinding till sitt målprotein. En fluorescerande grupp kan exciteras av fotoner av en karakteristisk våglängd. Då fluoroforen faller tillbaka till sitt grundtillstånd emitteras fotoner av lägre energi, dvs längre våglängd. Det finns många olika fluorescerande grupper, alla med olika spektra, dvs exitations- och emissionsvåglängd. Figur 1 (1) Excitation av en fluorofor genom absorption av ljus. En elektron exciteras till singlettillstånd, S 1 '.(2) Energin från S 1 ' avges delvis och ger ett tillstånd som kallas relaxerad singlet (S 1 ). (3)Elektron går från S 1 till S 0 och emitterar ljus. Denna laboration syftar till att ge en inblick i hur man går till väga för att nå ett slutmål med en laboration detektion av protein i en okänd lösning genom produktion, rening och inmärkning av ett protein. Vilka kontrollsteg behövs för att du ska kunna lita på dina resultat? Här studerar vi effektiviteten av inmärkningen samt hur den biologiska aktiviteten påverkas av de kovalent bundna fluorescerande grupperna. 2

Ni kommer att arbeta med proteinet Z. Det härstammar från en bakteriell receptor som heter ProteinA och sitter på ytan av Stafylokocker. Denna receptor har fem subenheter som alla har affinitet till IgG. En av dessa, B-domänen, har använts som bas för att skapa Z. Skillnaden mellan B och Z är att en glycin i B-domänen av stabilitetsskäl har bytts ut mot en alanin. Z är ett relativt litet och mycket stabilt protein som består av 58 aminosyror. Staphylococcal protein A Ss E D A B C X M Signalsekvens Immunoglobulinbindande domäner Förankring i cellväggen Z Figur 2 Schematisk bild av ProteinA. Domänen består av tre α-helixar och binder IgG med hög affinitet (K d ~ 20 nm). I det proteinkonstrukt ni kommer att arbeta med har Z fuserats med en His 6 -tag för att proteinreningen ska kunna genomföras under denaturerande förhållanden. Detta görs med hjälp av en IMAC-kolonn (Immobilized Metal Affinity Chromatography). Detta konstrukt finns i två olika versioner. Ett konstrukt innehåller en cystein som kan utnyttjas för inmärkning (kallas Cys-variant) och det andra konstruktet saknar cystein. Där utnyttjas de primära aminogrupperna vid inmärkningen. His 6 Z -SH His 6 Z Figur 3 Schematisk bild av de två Z-konstruktionerna. Tiolgruppen som kommer att användas för inmärkning symboliseras av SH. Var kommer fluoroforerna att sitta efter inmärkning av vildtypsvarianten? Ni kommer att arbeta antingen med Cys-varianten eller med wt-varianten av Z. En effekt av att utnyttja de primära aminerna är att den fluorescerande gruppen kan binda på flera olika ställen i proteinet vilket kan vara en fördel eftersom den fluorescerande signalen blir starkare. Samtidigt riskerar man att denna inmärkning stör vid ytan som binder till målproteinet. Ni kommer efter inmärkning och efterföljande rening att analysera er produkt med hjälp av masspektrometri och biosensoranalys för att ta reda på effektiviteten av inmärkning och dess påverkan på affiniteten. Det fluorescerande proteinet kommer sedan att 3

användas för att bestämma IgG-koncentrationen i en lösning. Detta görs med Gyrolab Bioaffy-teknik, där IgG fästs på en 15 nl liten kolonn i en mikrostruktur. När ert inmärkta prov sedan appliceras kommer den inbundna mängden Z, och därmed fluorescensen, att avspegla antalet IgG som fastnat på kolonnen. Koncentrationen bestäms genom att jämföra ert fluorescensvärde med en standardkurva som skapas vid samma tillfälle med hjälp utav ett antal kända IgG-koncentrationer. Figur 4 Den tredimensionella strukturen av Z-domänen. De aminosyror som deltar i bindningen till IgG är ritade som bollar (space fill). 4

Laborationen i grova drag: För att minska omfånget på laborationen är målproteinet producerat i förväg. Ni kommer att få en suspension med lyserade E. coli celler. Suspensionen ska centrifugeras och proteinet framrenas. Det finns två olika varianter av proteinet, Cys respektive wt. Varje grupp kommer endast att jobba med en av varianterna, men i slutrapporten ska teorin bakom båda inmärkningsmetoderna och dess följder redovisas. Reningen sker med hjälp av proteinets His 6 -tag i kombination med IMAC. Efter detta reningssteg utförs ett buffertbyte på gelfiltreringskolonn. Därefter används SDS-PAGE för att kontrollera proteinets renhet samt för att uppskatta dess koncentration. Koncentrationen bestäms även med UV absorbans. Det renade proteinet märks sedan in med en fluorescerande grupp. Inmärkningen genererar varianter med olika många fluoroforer (ingen, en eller flera) och dessa separeras med hjälp av HPLC. Med hjälp utav masspektrometri fastställs proteinvarianternas massa och på så vis kan slutsatser dras kring hur många fluorescerande grupper de respektive varianterna har bundit till sig. De olika fraktionerna från HPLC-reningen frystorkas efter mass-analysen för vidare inför vidare analys och slutanvändning. Affiniteten för de olika Z varianterna studeras och jämförs med BIAcore. Slutligen kommer ni att använda ert egenhändigt inmärkta protein för att koncentrationsbestämma IgG i en, för er, okänd lösning. För att kunna bedöma hur laborationen gått och vilka steg som är kritiska kommer ni att beräkna utbytet över de olika momenten. 5

Dagsplanering Lab 1 Redovisning reningsuppgift Teorigenomgång av labben Kontrollskrivning Konstruktion av flödesschema i labbparen Konstruktion av tabell för beräkning av utbyten Tillredning av buffertar inför de kommande labbmomenten Lab 2 Centrifugering av de lyserade E. coli-celler som producerat proteinet Z Rening av proteinet med hjälp av IMAC. Detta sker med små sprutkolonner och självdropp i ett pumpfritt system Buffertbyte av proteinlösningen med hjälp av en gelfiltreringskolonn Analys av mängden utvunnet protein med hjälp av UV-absorbansmätning Lab 3 Inmärkning av proteinet med fluorescerande grupp samt efterföljande gelfiltrering för att rena bort icke inmärkt fluorofor Analys av cellysat och det renade materialet med hjälp av SDS-PAGE Beräkna teoretiska molekylmassor för oinmärkt och inmärkt protein mha bilagorna. Lab 4 HPLC-rening av det inmärkta proteinet för att separera olika varianter. Masspektrometrianalys för att ta reda på hur många fluorescerande grupper det sitter på de olika varianterna. Lab 5 Koncentrationsbestämning med hjälp av en Nanodrop-spektrofotometer. Affinitetsstudie av de olika Z-varianterna med hjälp av Surface Plasmon Resonance (SPR, Biacore). Slutmålet med era fluorescensinmärkta proteiner: Bestämning av IgG-koncentration i ett okänt prov med hjälp av ett Gyrosinstrument. Lab 6 Genomgång och diskussion av labbrapporterna. Inför detta tillfälle ska ni vara så gott som färdiga med rapporten. Labstädning. 6

Hemsida Era primärdata kommer att distribueras via Bilda. Där laddas även rapporterna upp inför de olika rättningsmomenten. Ställa frågor angående laborationen gör ni bäst genom att maila till seppen@biotech.kth.se Riktlinjer för rapportskrivning Samtliga delmoment i denna labb ska redovisas i en sammanhängande rapport. Det är viktigt att rapporten skrivs genomtänkt och välstrukturerat. Observera att rapporten ska kunna följas och labben upprepas av någon som inte har gjort laborationen och inte har tillgång till labbkompendiet. Laborationerna behandlar de flesta tekniker som ingår i kursen. Genom att förstå teorin bakom laborationerna, och presentera en bra rapport, är mycket vunnet inför den kommande tentaläsningen. Passa på att utnyttja labbassarna för frågor, och se till att komma mycket väl förberedd till varje labtillfälle. Labbrapporten vill vi ha i PDF-format. Ni kommer att få tillbaka rapporten med kommentarer via era e-mail adresser (i PDF-format). Endast rapporter i elektroniskt format beaktas. Läs igenom hela rapporten innan den lämnas in, och se till att de olika avsnitten utgör en bra helhet. Vid den första inlämningen kommer ni studenter att korrekturläsa varandras rapporter. Här är det absolut inte tänkt att ni ska gå in och rätta stavning, utan ni ska koncentrera er på de saker som skulle kunna förbättra förståelsen av rapporten. Ni ska även granska beräkningarna och kontrollera att samtliga resultat finns redovisade. Kommentarerna skickas laddas upp på Bilda enligt labbschemat och vidaredistribueras av kursansvarig. Om ni händelsevis inte vill ta era kollegors kommentarer i beaktande måste anledningen till detta redovisas vid den andra inlämningen, som sker till labbassen, tillsammans med konstruktiva argument. Efter denna andra inlämning har assarna 2 veckor på sig att rätta era rapporter. I samband med det stämmer ni träff med labbassen för en muntlig genomgång av rapporten. Efter genomgången har ni en vecka på er att lämna in en ny version. Denna version ligger sedan till grund för betygssättningen. Vid varje efterföljande retur sjunker betyget automatiskt med en grad. Var därför noga med att följa de anvisningar ni fått vid retur. 7

Nedan följer de avsnitt som rapporten skall innehålla. Introduktion Här beskrivs tillvägagångssättet och målet med laborationen, i korta ordalag. Båda inmärkningsmetoderna ska behandlas i introduktion och diskussion. Material och metoder Här beskrivs det praktiska i laborationen i en löpande text. Utförande, kemikalier, material och apparater ska redovisas. Med hjälp av detta avsnitt ska momenten kunna upprepas utan hjälp av den ursprungliga labbmanualen. Viktiga parametrar för att kunna genomföra t.ex. ett proteinreningsmoment är flöde, buffertsammansättning, ph, fraktionsvolymer. Detta ska inte vara en direkt kopia av labbpeket, utan en saklig beskrivning av förfarandet ska redovisas med era egna ord.viktigt att tänka på är att i Material och Metoder skall varken teori bakom försöken, resultat eller diskussion tas upp. Resultat Här sammanfattas resultaten och primärdata redovisas. Underlag för resultat (diagram, eventuella gelbilder m.m.) och beräkningar kan redovisas i form av numrerade bilagor. Referenser till dessa bilagor skall finnas i resultatavsnittet. Samtliga beräkningar skall - Redovisas tydligt med tillhörande formel - Vara lätta att följa - Innehålla enheter - Innehålla tydliga förklaringar till varifrån primärdata och konstanter är tagna - Redovisas med lämpligt antal värdesiffror Samtliga proteinmängder anges i gram. Diskussion Här ska alla resultat kommenteras och slutsatser dras. Exempel på punkter som hör hemma i diskussionen är: - Vad har varit syftet med att använda de olika metoderna? Vilka är deras fördelar respektive nackdelar jämfört med andra tillgängliga metoder? Kompletterar de varandra? Jämför speciellt de olika koncentrationsbestämningsmetoderna som använts. Har ni fått rimliga värden? - Vilket var utbytet i de olika stegen? I vilket steg förlorades mest material? Varför? Blev resultatet det ni förväntade er? - Gick något fel? Varför? - Kan några slutsatser dras om hur inmärkningen påverkat ert protein? - Fördelar respektive nackdelar med de olika inmärknigsmetoderna. 8

Utvärdering av laborationen. Här ges synpunkter på hela labbkursen. Ge gärna förslag inför kommande kursomgångar. Följande resultat skall redovisas i rapporten: Flödesschema Tabell med utbyten. Samtliga beräkningar som ligger till grund för rapporten skall redovisas. Kromatogram efter IMAC rening: y-axeln Abs, x-axeln ml. Mängden renat protein efter IMAC, anges i gram. Här antar vi att utbytet över IMAC-kolonnen är 100%. Relatera även den utvunna mängden till odlingsvolymen (g/liter odling). SDS-PAGE som visar utgångsmaterial och renhet. Tolkning av resultatet. Mängden utvunnet protein efter buffertbyte samt beräkning av utbytet över SEC-steget. Detta ska sedan relateras till odlingsvolymen (g/liter odling). Hur mycket protein hade ni fått om ni gått vidare med hela mängden? Kromatogram från HPLC reningen. Redovisa den uppskattade mängden utvunnet material från de olika topparna. Specificera topparna. Det ska vara möjligt och enkelt att se vilken topp i vilken bilaga ni diskuterar i rapporten. Mängden utvunnet protein efter inmärkning, SEC och HPLC, beräknat med hjälp av koncentrationsbestämningen från Nanodrop-mätningarna och HPLCdiagrammet. Här beräknas utbytet sammantaget över de tre stegen. Detta för att ni inte har någon information om delstegen. Även här ska ni relatera siffrorna till odlingsvolymen (g/liter odling). Hur mycket inmärkt protein hade ni fått om ni gått vidare med hela mängden? Tolka MS-spektren genom att jämföra massan för topparna (m/z) med den teoretiska massan för proteinerna och den kopplade fluoroforen. Det ska vara möjligt och enkelt att se vilken topp i vilken bilaga ni diskuterar i rapporten. Redovisning och tolkning av Biacore-data. Beskriv kurvorna och vad man kan utläsa ur dem. Plotta jämviktrespons mot koncentration så att det nya diagrammet visar skillnaderna mellan de inmärkta och oinmärkta Z-varianterna. Glöm inte att hänvisa till bilaga med primärdata! Redovisa standardkurva samt erhållet koncentrationsvärde för den okända IgGlösningen. Samtliga punkter under rubriken Efter denna dag ska ni ha.. Som sista uppgift i resultatdelen ska ni redovisa hur stor odling ni skulle behöva om ni med detta protokoll ska rena fram 10 mg enkelinmärkt protein. Tag hänsyn till förluster under labbens gång, och fundera över om några av stegen skulle kunna optimeras för storskalig produktion. 9

Lab 1) Teorigenomgång, förhör och buffertblandning Första tillfället inleds med ett kontrollförhör på labbkompendiet samt på säkerhetsföreskrifterna. Därefter redovisas proteinreningsuppgiften. Ni ska sedan gruppvis göra ett flödesschema över hela laborationen samt en tabell för beräkning av utbyten över de olika stegen. KOM VÄL FÖRBEREDD och TAG MED EGEN LABBROCK. Preparation av buffertar PBS, ph 7.2-7.4 (Fosfatbuffrad salin; 10 mm fosfat, 154 mm NaCl) 1) Blanda 100 ml 1 x PBS från en 10 x PBS-lösning 5 mm NH 4 Ac, ph 5,5 1) Blanda 100 ml 5 mm NH 4 Ac från en 5 M NH 4 Ac-lösning (fyll ej upp 100 ml från början). 100 μl NH 4 Ac + upp till 90 ml med MilliQ 2) Ev. kalibrera ph-metern. 3) Ställ ph till 5,5 4) Slutjustera volymen Efter denna dag ska ni ha: Skapat ett flödesschema för hela laborationen där samtliga moment och provtagningar finns utmärkta. Märk även ut vid vilka steg ni ska göra utbytesberäkningar. Detta flödesschema kommer att underlätta för er att följa alla moment under labbens gång, och den ska bifogas i labbrapporten. Gjort en tabell för utbutesberäkningar över de olika stegen samt sammanlagt över hela laborationen. Denna tabell ska bifogas i labbrapporten. 10

Lab 2) IMAC-rening av odlat protein, buffertbyte samt koncentrationsbestämning His 6 -Z respektive His 6 -Cys-Z har odlats i 50 ml TSB (Tryptic Soy Broth) innehållande jästextrakt och kanamycin på skak i 37 C. Odlingen inducerades med IPTG vid OD 600 1 och flyttades till 25 C. Efter 18 timmar på skak i 25 C togs ett 25 μl cellprov ut för senare analys och därefter centrifugerades cellerna ner. Pelleten löstes sedan upp i ca 10 ml lysisbuffert (6M Guanidium hydroklorid, ph 8,0). Till de celler som producerat His 6 -Cys-Z tillsattes β-merkaptoetanol till en slutkoncentration av 10 mm. Båda cellvarianterna lyserades därefter i 2 timmar på skakbord i 37 C. Cell-lysaten frystes in i -20 C och tinades i rumstemperatur på laborationsdagen. IMAC-rening Här skall du rena fram Z och bli av med de övriga proteinerna från E. coli cellerna. Histidiner kan binda till tvåvärda joner, så med hjälp av His 6 taggen kan du binda upp Z på en IMAC kolonn som exempelvis innehåller cobolt-joner (Co 2+ ). I en His 6 tagg sitter sex histidiner i rad vilket gör att proteinet binder ganska hårt till matrisen. Man kan alltså tvätta ordentligt utan att proteinet lossnar. Detta gör reningsmetoden selektiv. Tips: tryck aldrig på med tummen för att öka flödet i kolonnen det medför bara att matrisen packas hårdare och flödet minskar! 1) Sönderdela DNAt med hjälp av att föra provet upp och ner genom en kanyl för att sänka viskositeten. 2) Späd proteinlösningen till 20 ml med lysisbuffert (6M Gua-HCl, ph 8.0). 3) För över provet till ett SS-34-rör. Märk röret genom att skriva på en tejpbit. Tips: dubbelvik en liten flik på tejpen så att den går lätt att ta bort! 4) Centrifugera i SS-34 alt. JA 17-rotorn: 11000xg, 10 min, 4 C. 5) För över supernatanten (innehållande proteinerna) till ett 50 ml-rör. Avdöda celler i pelleten genom att tillsätta Desidos. 6) Filtrera proteinlösningen med 1,2 μm sprutfilter 7) Filtrera proteinlösningen med 0,45 μm sprutfilter. 8) Öppna IMAC-kolonnen (Talon-Co 2+ matris) och häll av vätskan. 9) Pulsa kolonnen enligt nedanstående. Här är det viktigt att låta varje buffert rinna igenom fullständigt innan du sätter till nästa. För att inte slösa tid: Tryck ej på med tummen! 10 ml lysisbuffert 10 ml elueringsbuffert (8 M Urea, ph 5,0) 10 ml lysisbuffert 10 ml elueringsbuffert Tips: använd hävert i stegen 10-12 10) Jämvikta kolonnen med 25 ml lysisbuffert 11) Ladda provet på kolonnen 12) Tvätta med 25 ml lysisbuffert 11

13) Eluera proteinet med 7 x 1 ml elueringsbuffert 14) Pulsa återigen kolonnen enligt punkt 9 15) Tvätta kolonnen med 10 ml avjonat vatten 16) Tvätta kolonnen med 5 ml 20 % EtOH och för på ytterligare 1 ml precis innan kolonnen försluts. Kolonnen förvaras i EtOH i kylskåp 17) Tvätta slangarna från eventuellt använd hävert med vatten - även på utsidan naturligtvis Koncentrationsbestämning Här använder vi UV-absorbans för att uppskatta mängden protein. Detta steg är viktigt för att efterföljande analyser ska bli korrekta, så var nogranna med pipetteringen och välj rätt blank! Extinktionskoefficienten för ert protein kan ni hitta i en bilaga till denna manual. Den information som finns där är framtagen via en hemsida med många praktiska verktyg för forskning inom proteinkemi; http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Koncentrationsbestämning eluerat protein 1) Mät Abs 280nm på de eluerade proteinfraktionerna. Mät den mest koncentrerade fraktionen extra noggrant, gör (om det behövs) en spädning av en delmängd av provet så att absorbansen hamnar inom spektrofotometerns noggrannhetsområde (0,1<Abs<1). 2) Tag ut 8µl av den mest koncentrerade fraktionen till ett nytt eppendorfrör och spara för gelanalys nästa dag. Buffertbyte med gelfiltrering (SEC) Det är inte optimalt att förvara proteinet i elueringsbufferten. Här skall du därför använda SEC, Size Exclusion Chromatography, för att byta buffert till PBS. Denna metod används för att separera molekyler med avseende på storlek. De stora molekylerna tar den snabbaste och bredaste vägen ut. De små molekylerna tar sig in i porerna på partiklarna. Vägen blir både längre och krångligare varför dessa kommer ut ur kolonnen sist. 1) Jämvikta kolonnen (NAP-10) med 15 ml 1xPBS, ph 7,2-7,4, låt all vätska rinna igenom. 2) Tillsätt 1 ml prov från fraktionen med högst proteinkoncentration till kolonnen, låt kolonnen återigen rinna klart. I det fall provvolymen är mindre än 1ml: tillsätt prov, låt kolonnen rinna klart, tillsätt den mängd 1xPBS som krävs för att få en total provvolym om 1 ml och låt kolonnen rinna klart. 3) Eluera provet med 1,5 ml 1xPBS till eppendorfrör. Märk röret! 4) Ta ut 8 µl buffertbytt prov till ett nytt rör och spara för gelanalys nästa dag. 5) Tvätta slangarna med vatten och 20% EtOH. 12

Koncentrationsbestämning buffertbytt protein Mät absorbansen vid 280 nm på det buffertbytta provet. Gör eventuellt en spädning av en delmängd av provet så att absorbansen hamnar inom spektrofotometerns mätområde (0,1<Abs<1,0). Kylförvaring av alla prov! Märk rören ordentligt! Efter denna dag ska ni ha: Ritat ett kromatogram för IMAC-reningen med hjälp av er uppmätta absorbans. Räknat ut mängden framrenat protein efter IMAC rening (som här antas vara lika med mängden producerat protein). Glöm inte att alla fraktioner ska vara med i denna beräkning! Diskuterat varför proteinet inte bör förvaras i sin elueringsbuffert Räknat ut mängden framrenat protein efter gelfiltrering Beräknat den provvolym som behövs till inmärkningen nästkommande labbdag Räknat ut utbytet över gelfiltreringskolonnen. Var medvetna om att ni gick vidare med en delmängd av provet! Tagit ut prover för SDS-PAGE analys: efter IMAC (från fraktionen med högst koncentration) efter SEC Bestämt tidpunkt för Lab4 13

Lab 3) Inmärkning av protein Inmärkning av protein med fluorofor Möjligheten att kovalent koppla molekyler till proteiner utnyttjas ofta för t.ex. inbindning av proteinet till en fast yta eller, som i detta fall, för att kunna detektera proteinet. Vanligast är att man utnyttjar proteinets primära aminer eller cysteiner. I denna laboration ingår båda dessa två typer av kopplingskemier. Du kommer bara utföra en av dem i praktiken, men se till att lära dig teorin bakom båda. Fluoroforen Cy5 NHS. MW=753 Da Alt 1. Koppling till amin med Cy5 på Zwt 1) Ta ut 50 nmol His 6 -Zwt. 2) ph vid inmärkningen ska vara 9,3. För att höja ph används en 1 M Natriumbikarbonatbuffert. Slutkoncentrationen av natriumbikarbonat ska vara 0,1M i provet. Späd med 1 PBS för att få en slutvolym på 400 ul. 3) Lös upp fluoroforen i 210 µl DMSO. OBS! Fyra grupper kommer att dela på en vial med fluorofor! 4) Tillsätt 50 μl Cy5 till proteinet. Kläd röret i folie för att skydda fluoroforen mot ljus. Vänd försiktigt på röret några gånger, tills färgen blandats ordentligt. Inkubera i RT och vänd, hela tiden försiktigt, på röret ungefär var femte minut 5) Låt proteinet märkas in i 30 min 6) Separera proteinet från överskott av fluorofor samtidigt som du utför byte till en mer lämplig (varför?) buffert: Jämvikta NAP10-kolonn med 15 ml 5 mm NH 4 Ac, ph 5,5 7) Tillsätt provet till kolonnen, låt rinna klart. Tillsätt ytterligare NH 4 Ac till en totalvolym om 1 ml, låt rinna klart 8) Eluera med 1 ml av 5 mm NH 4 Ac till folieklätt rör. Märk röret! Kolonnen behöver inte tvättas efter detta steg, den skall slängas 9) Frys provet vid 80 C i 30 min 10) Frystorka till nästa dag 14

Alt 2. Reduktion + koppling till tiol med Cy5 maleimide på ZCys Cysteininnehållande proteiner bildar lätt dimerer genom att tiolgrupperna oxideras till disulfider. När man använder tiolbaserad kopplingskemi är det viktigt att se till att det finns fria tioler! Här används TCEP (Tris-2-carboxethyl-phosphine) för att reducera disulfiderna. Det är viktigt att alla lösningar hålls så fria från luft som möjligt i närvaro av syre fungerar inte reaktionen optimalt. 1) Ta ut 50 nmol His 6 -Z-Cys och späd till en totalvolym av 400 μl i PBS, ph 7,2-7,4. 2) Väg upp 10 mg TCEP (M W 286,7 g/mol) och gör en 50 mm stamlösning i avluftad PBS. (1 lösning till 4 grupper). Dragskåp! 3) Tillsätt 50 μl TCEP 50mM (50x molärt överskott) till proteinet. 4) Låt proteinet reduceras i 10 min i rumstemperatur. 5) Lös under tiden upp en vial Cy5 maleimide (1 mg) i 50 μl DMSO. Dragskåp! 6) Tillsätt 10 μl Cy5-maleimide lösning till det reducerade proteinet. Kläd röret med folie för att skydda fluoroforen mot ljus. 7) Låt proteinet märkas in i 37 C 1h. 8) Späd provet till en totalvolym av 1 ml i PBS, ph 7,2-7,4. 9) Jämvikta NAP10-kolonn med 15 ml 5 mm NH 4 Ac, ph 5,5. 15

10) Tillsätt 1 ml prov för att separera proteinet från överskott av fluorofor. 11) Eluera med 1,0 ml av 5 mm NH 4 Ac till folieklätt rör. Märk röret! Kolonnen behöver inte tvättas efter detta steg, den skall slängas. 12) Frys provet vid 80 C i 30 min. 13) Frystorka till nästa dag. SDS-PAGE-analys Ni använder SDS-PAGE för att kontrollera att reningen har gått bra och för att jämföra koncentrationsbestämning på gel med den från absorbansmätning. Ni skall jämföra hur många olika proteiner provet innehåller före och efter IMAC-reningen och även kontrollera att målproteinet finns kvar efter buffertbytet. Polyakrylamidgel-elektrofores är en metod som används för att separera proteiner efter storlek. SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) är en detergent som används för att denaturera proteiner och förse dem med negativa laddningar. Den förvärvade laddningen är proportionell mot antalet aminosyror. Då ett elektriskt fält läggs mellan elektroderna kommer proteinerna i gelen vandra mot den positiva elektroden. Proteiner av olika storlek kommer ha olika lätt att ta sig genom polyakrylamidgelen. I motsats till SEC, där man också separerar proteinerna med avseende på hydrodynamisk storlek, använder man här den laddning som proteinerna har efter SDS-behandling för att separera dem, genom att lägga en spänning över gelen. Instrument: PhastSystem för gelelektrofores, Amersham Biosciences 1. Molekylviktsmarkören innehåller proteiner med storlekarna 14, 20.1, 30, 45, 66 och 97 kda. Koncentrationen av varje protein i blandningen är 1µg/µl. 2. De prover som ska analyseras är: Cellpellet (från assarna) IMAC renat protein (från fraktionen med högst koncentration) SEC renat protein Molekylviktsmarkör 3. Wt-konstruktet: Blanda 8 µl IMAC resp. SEC renade proteinproverna med 5xRED så att slutkoncentrationen blir 1xRED 4. Cys-konstruktet: Blanda 8 µl IMAC resp. SEC renade proteinproverna med 5xOX så att slutkoncentrationen blir 1xOX 5. Lös upp cellpelleten i 25 µl 5xRED + 25 µl vatten. 6. Värm proven i 95 C i 5 min, spinn ned 15 s. 7. Ladda 1 μl av varje prov (cellpellet, IMAC-renat spädd 5x, SEC-renat spädd 5x, samt markör) på gelen (20% homogen gel) Skriv upp provordningen! 8. Kör gelelektrofores enligt förprogrammerat protokoll. 9. Efter avslutad elektroforeskörning, färga in gelen med Coomassie blue i framkallningsenheten. 10. Uppskatta koncentrationen på proteinet (genom att jämföra intensiteterna på gelen) och jämför med absorbansmätningen. 11. Förvara Phast-proverna i kylskåp. Märk rören! Efter denna dag ska ni ha: Räknat ut vilka olika molekylvikter ni kan förvänta er efter inmärkningen (till er hjälp har ni molekylvikterna i bilagor). Veta varför man ibland reducerar provet före inmärkning Förstått var man finner primära aminogrupper i ett protein. Hur många har Z? 16

Förstått hur Coomassie infärgning fungerar. Förstått hur SDS-PAGE fungerar Analyserat era prover med hjälp av SDS-PAGE. Är provet rent? Ni ska även ha uppskattat proteinkoncentrationen med hjälp av gelen. Stämmer de två olika värdena ni har fått fram för koncentration överens? Diskuterat hur det kommer sig att vi använder 1 ml i elueringssteget vid buffertbyte istället för den volym om 1.5 ml som använts i tidigare gelfiltreringssteg? Lab 4) HPLC-rening av inmärkt protein och masspektrometri Nu skall ni studera hur inmärkningen av proteinet har gått. Här använder vi Reversed Phase HPLC (High Performance Liquid Chromatography) för att separera oinmärkta proteiner från enkel- eller flerinmärkta med avseende på dess hydrofobicitet. Instrument: HP 1090, Hewlett-Packard Kolonnmatris: Reversed Phase polystyren/divinylbensen Lösningsmedel: A 0,1 % TFA-H 2 O B 0,1 % TFA-acetronitril Gradient: 25% B 0-5 min 25-45% B 5-40 min 45-100% B 40-41 min 100% B 41-46 min 100-25% B 46-47 min 25% B 47-50 min Detektion vid λ = 220 nm och λ = 280 nm, samt registrering av absorbansspektra för topparna. 1) Lös upp det frystorkade, inmärkta proteinet i 75 μl 0,1% TFA-acetonitril + 225 μl 0.1% TFA-H 2 O. 2) Filtrera provet genom ett 0,45 μm filter. 3) Tag ut 220 μl och sätt till en HPLC-vial, kontrollera att det inte är någon luftbubbla i botten. 4) Injicera provet och starta gradienten. Injektionsvolymen är 200 µl. 5) Följ separationen på datorskärmen och samla upp toppar i mikrocentrifugrör. Märk rören med retentionstid och namn. Notera vilka toppar som innehåller inmärkt protein. Spara kromatogram, spektra för topparna samt den integrerade topparean. Dessa data får ni sedan som pdf-filer via Bilda. 6) Välj ut fraktioner till MS-analys. 17

Masspektrometri (MS) Med masspektrometri kan molekylers massa bestämmas mycket noggrant. Här använder vi MS för att via proteinets massa beräkna hur många fluorescerande grupper vi har lyckats koppla på. I labben joniseras proteinerna med Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI). Först blandas provet med en så kallad matris, en lösning innehållande en organisk syra som absorberar ljus i UV-området. Blandningen läggs på en s.k. MALDI-target, en platta av stål. När vätskan i blandningen evaporerar kristalliseras provmolekylerna och matrisen. Plattan sätts därefter in i masspektrometern. Där beskjuts provet med intensiva, korta laserpulser. Prov- och matrismolekylerna lämnar target (desorberas) och energiöverföring sker mellan matris- och analytmolekyler vilket leder till jonisering. Jonerna accelereras i ett elektriskt fält, och får därmed en hastighet som beror av massa-överladdning (m/z). Genom att mäta tiden det tar för jonerna att passera genom ett flygrör fram till detektorn kan man bestämma m/z. Denna typ av massanalysator kallas för time-of-flight (TOF) MS. Då vi använder MALDIn kommer vi främst att få enkelladdade joner. Den teoretiska massan för ert protein hittar ni i en bilaga till denna manual. Även här har informationen tagits fram via hemsidan http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Olika modifieringar av proteinsekvensen kan ha skett i olika stadier av denna labb. Vid produktion i E.coli klyvs formylmetioninet bort. Det händer även att peptidkedjan går sönder och att modifieringar av His-taggen skett i E.coli. För att ni lättare ska kunna tolka spektra och de massor ni har fått fram kan ni använda en lista på aminosyrornas massor som finns som bilaga till labbmanualen. Spektra från era analyserade proteiner kommer att finnas tillgängliga via Bilda. Instrument: Bruker Biflex IV MALDI-TOF masspektrometer Material: Era utvalda prover från HPLC-reningen En mättad lösning av matrisen α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Såväl oinmärkta som inmärkta fraktioner från HPLC-reningen kommer att analyseras med MS. Blanda 1 µl av ert prov med 1 µl CHCA-matris. Pipettera över 1 µl av blandningen på MALDI-targeten. Låt torka! Nu är det dags att köra MS. Er labbledare kommer att instruera er vidare i hur ni använder instrumentet. Efter MS-körningen överlämnas utvalda fraktioner till labbassen för frystorkning. Efter denna dag ska ni ha: Ha en teori om hur många varianter inmärkt/oinmärkt protein ni har fått. Veta vad man detekterar vid 220 respektive 280 nm. Tolka MS-spektren genom att relatera massan för de otransformerade topparna (m/z) med den teoretiska massan för proteinerna och den kopplade fluoroforen. Förklara vad som bidrar till molekylmassorna för proteinerna från de olika MS topparna och dra slutsatser från detta. Dragit slutsatser om vad som har eluerats ut i de olika topparna under HPLC-reningen. Stämmer data med vad som förväntades i teorin? Valt vilka toppar som ska frystorkas till BiaCoren. Veta hur ni beräknar koncentrationen av inmärkt och oinmärkt protein med Nanodropspektrofotometern. 18

Lab5) Biosensoranalys av proteinernas affinitet samt bestämning av IgG-koncentration i okänt prov med Gyrolab BioAffy-teknik Biacore Biacore är ett optiskt biosensorinstrument som baseras på SPR (Surface Plasmon Resonance) vilket åskådligör bindningen mellan två eller flera molekyler. Detta sker i realtid utan använding av inmärkning. Med denna teknik kan man detektera proteiner, peptider, nukleotider, fettsyror och även små, organiska molekyler, exempelvis olika läkemedelskandidater. Z s ligand IgG har här kopplats kovalent på en dextrantäckt guldyta. Ni använder alltså Biacore för att studera hur inmärkt respektive icke-inmärkt Z binder in till sitt målprotein IgG. Syftet med analysen är att detektera eventuella skillnader mellan de två inmärkta varianterna samt oinmärkt Z med avseende på affinitet till IgG. 1) Börja med att lösa upp det frystorkade provet i 150 µl 1*HBS (5 mm Hepes, 150 mm NaCl, 3,4 mm EDTA, 0,005% P20), ph 7,2-7,4. 2) Bestäm proteinkoncentrationen på era prover genom att mäta absorbansen vid 280 nm. Cy5-fluoroforen absorberar ljus både vid 220 nm och 280 nm vilket får till följd att en spektrofotometrisk koncentrationsbestämning av inmärkt protein vid dessa våglängder kommer att bli felaktig. Ett sätt att lösa problemet är att uppskatta fluoroforkoncentrationen i provet genom att absorbansmätna vid både 280nm och 650nm och använda absorbansen vid 650nm - där endast fluoroforen och inte proteinet absorberar - för att korrigera den apparenta proteinkoncentrationen. Alltså: mät absorbansen vid 280 nm (A 280 nm tot ) och 650 nm (A 650 nm Cy5 ). Proteinets absorbans vid 280 nm (A 280 nm prot ) beräknas därefter utifrån: A 280 nm tot = A 280 nm prot + A 280 nm Cy5 (1) A 280 nm Cy5 = 0.03 x A 650 nm Cy5 (2) (1) + (2) A 280 nm prot = A 280 nm tot - 0.03 x A 650 nm Cy5 A 280 nm prot kan därefter användas för att beräkna proteinkoncentrationen i provet. Spektrofotometern ni använder är en så kallad Nanodrop, där absorbansen mäts från en applicerad provdroppe om 1.5 µl. De främsta fördelarna med instrumentet är att ingen kyvett behövs samt att en mycket liten provvolym går åt. Strålgången vid mätningen är 1 mm, ha det i åtanke vid beräkningar med Lambert-Beers lag. 3) Gör spädningar av provet till 1 μm, 500 nm, 100 nm och 10 nm i en total mängd av 500 μl (om koncentrationen är för låg kan provet spädas till mindre volym, dock behövs minst 250 μl) av vardera koncentration i eppendorfrör. Proverna ska spädas med 1*HBS. Filtrera det första provet i de båda spädningsserierna och gör sedan vidare spädningar. För över proven till vialer. 4) Docka in chipet om det inte är indockat och kör Prime. Detta steg tvättar systemet med 1*HBS. 5) Titta igenom programmet och skriv in var man ska sätta proverna 6) Starta Biacoren 19

Det kan vara svårt att utifrån sensorgrammen bestämma om det är någon skillnad mellan de fyra olika proverna. Ett sensorgram för varje variant med koncentrationer kommer att finnas på hemsidan. Utifrån dessa sensorgram ska ni plotta jämviktrespons mot koncentration så att det nya diagrammet visar skillnaderna mellan de inmärkta och oinmärkta Z-varianterna. Se bild: R U 1μM 500nM 100nM 10nM Time [sec] R U Variant A Variant B 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 log [C] 20