Kvalitativ analys. Kvantitativ analys. Biokemisk analys och separationsteknik. GLP = Good Laboratory Practice. GMP = Good Manufacturing Practice

Relevanta dokument
Biokemisk Analys och Separationsteknik

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Övningstentafrågor i Biokemi, Basåret VT 2012

Cellen och biomolekyler

Proteiner. Biomolekyler kap 7

Proteiner. Biomolekyler kap 7

Jonbyteskromatografi

Lite basalt om enzymer

Från DNA till protein, dvs den centrala dogmen

DEN MINSTA BYGGSTENEN CELLEN

Biologi 2. Cellbiologi

Proteinstruktur samt Hemoglobin

BASÅRET KEMI B BIOKEMI VT PROTEINER OCH ENZYMER (sid )

Transkription och translation. DNA RNA Protein. Introduktion till biomedicin Jan-Olov Höög 1

Från DNA till protein, dvs den centrala dogmen

Rening av proteiner: hur och varför?

Downstream Processing

Omentamen 3p mikrobiologi inom biologi 45p, Fråga 1 (2p) Fråga 2 (2p) Fråga 3 (2p)

lördag den 4 december 2010 Vad är liv?

Biomolekyler & Levande organismer består av celler. Kapitel 3 & 4

Så började det Liv, cellens byggstenar. Biologi 1 kap 2

Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Intracellulära organeller, proteinmodifiering och transport, endo/exocytos Kap10 + delar av kap 13

Analys av nukleinsyra. Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls

Resultat:... (Cellbiologi:... Immunologi...) Betyg...

Expression, produktion och rening av Fatty acid binding protein (FABP) från ökenmyran Cataglyphis fortis

Frå n åminosyror till proteiner

Ke2. Proteiner. Pär Leijonhufvud. Förstå proteinernas och aminosyrornas kemi och betydelse i levande organismer (och samhället) (alanin)

Svar till övningstentafrågor i Biokemi, Basåret VT 2012

Kromatografimetod. Separation genom olika distribution av molekyler mellan en mobil fas och en stationär fas

Kromatografi. Kromatografi

c) Hur förskjuts jämvikten av en tryckförändring? Motivera svaret. (2) Jämvikten förskjuts åt vänster om trycket ökar:

DNA-labb / Plasmidlabb

Info r prov i cellbiologi Biologi B

Proteinstruktur och Hemoglobin

Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

BASÅRET KEMI B BIOKEMI VT 2012

VIKTIGT ATT DU FYLLER I DETTA PÅ SAMTLIGA SIDOR SOM LÄMNAS IN! Efternamn: Mappnr: Förnamn: Personnr: Totalpoäng: Betyg: F Fx E D C B A

Cellbiologi: Intracellulär sortering och cellsignalering

Från Växt till Läkemedel - en resa med kvalitetskontroll

Cellbiologi. Cellens delar (organeller)

1. a) Markera polära och icke-polära delar i nedanstående molekyl. Vilken typ av ämne är det, och vad heter molekylen? (2p)

Medicinsk grundkurs. Cellen och genetik. Datum

Mutationer. Typer av mutationer

TENTAMEN I STRUKTURBIOLOGI

Proteiner Äggvitan består av proteinet ovalbumin. Farmaceutisk biokemi. Insulin är ett proteinhormon. Gly. Arg. Met. Cys. His. Gly.

NUKLEINSYRORNAS UPPBYGGNAD: Två olika nukleinsyror: DNA deoxyribonukleinsyra RNA ribonukleinsyra

Tentamen i KEMI del B för Basåret GU (NBAK10) kl Institutionen för kemi, Göteborgs universitet

Introduktion till laboration Biokemi 1

Sluttentamen Biokemi BI1032, 14:e januari 2010, Max = 100 p. Preliminära gränser: 3 = 55p; 4 = 70p; 5 = 85p.

Metabolism och energi. Hur utvinner cellen energi från sin omgivning? Hur syntetiserar cellen de byggstenar som bygger upp dess makromolekyler?

Fråga 3 Varje korrekt besvarad delfråga ger 0,4 p. Det är inget avdrag för felaktigt svar. (2p) En organism som bara kan växa i närvaro kallas

Laboration v.40 Detektion av Legionella pneumophilia med nestad PCR

Biomätteknik TFKE37 Tentamen 22 oktober 2009

Anolytech ANK-Anolyt för bättre djurhälsa och ökad produktion. Enkelt, miljövänligt och ekonomiskt.

Felveckning och denaturering av proteiner. Niklas Dahrén

TENTAMEN I INTRODUKTION TILL BIOMEDICIN FREDAGEN DEN 9 OKTOBER 2009 kl Efternamn: Mappnr: Förnamn: Personnr:

Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3

5. Transkriptionell reglering OBS! Långsam omställning!

Prokaryota celler. Bakterier och arkéer

Tentamen 3p mikrobiologi inom biologi 45p, Fråga 1 (2p) Fråga 2 (2p) Fråga 3 (2p)

Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering

Hierarkisk proteinstruktur. Hierarkisk proteinstruktur. α-helix Fig 3-4. Primärstruktur Fig 3-3

Skrivning i termodynamik och jämvikt, KOO081, KOO041,

PROVGENOMGÅNG AVSNITT 1 BIOLOGI 2

Laboration: cellskada/celldöd

STOCKHOLMS UNIVERSITET INSTITUTIONEN FÖR BIOLOGISK GRUNDUTBILDNING

Vad är liv? Vad skiljer en levande organism från en icke-levande?

Övergångar mellan vibrationsnivåer i grundtillståndet. Infraröd spektroskopi

Cellbiologi. Cellens delar (organeller)

Centrala Dogmat. DNA RNA Protein

Biologiska membran Kap 10 fig10-1, 15, 18, 19 & med tillhörande beskrivningar. Övrigt är repetition.

Kunskapsmål ht (reviderade )

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

Kvalitetssäkring och Validering Molekylära Metoder. Susanna Falklind Jerkérus Sektionen för Molekylär Diagnostik Karolinska Universitetslaboratoriet

KOMMENTARER TILL KAPITEL 6

För godkänt resultat krävs 20 p och för väl godkänt krävs 30 p. Max poäng är 40 p

få se en naturvetenskaplig forskningsmiljö och träffa människorna i den miljön.

Konc. i början 0.1M 0 0. Ändring -x +x +x. Konc. i jämvikt 0,10-x +x +x

) / (c l) -A R ) = (A L. -ε R. Δε = (ε L. Tentamen i Biomätteknik (TFKE37), 9 januari Uppgift 1 (10p)

Delprov Dugga med svarsmallar Biokemi BI0968, 8:e dec 2008, Max poäng = 50 p. Preliminära betygsgränser: 3 = 27p; 4 = 35p; 5 = 43p.

Fig 1-29 Alla celler har utvecklats från samma urcell för ca 3,5 miljarder år sedan Fem kungadömen och Tre domäner

Upplev Skillnaden. Total Purity System

Introduktion till labkursen på Biokemi 1

OBS! Under rubriken lärares namn på gröna omslaget ange istället skrivningsområde.

Tentamen i Molekylär Cellbiologi

Mikrobiologins tekniksprång Dr. Erik Nygren SP Food and Bioscience

Rening, inmärkning och användning av ett målprotein

Vad är MHC? MHC och TCR struktur. Antigen processering och presentation. Kursbok: The immune system Peter Parham

Kapitel 16. Löslighet och komplex

KOMMENTARER TILL KAPITEL 6

9/22/12% Introduk.on%.ll%biokemi% Varför%behöver%vi%veta%något%om%biokemi?% Biokemi%Q%Introduk.on%

VI-1. Proteiner VI. PROTEINER. Källor: - L. Stryer, Biochemistry, 3 rd Ed., Freeman, New York, 1988.

Kapitel Var är vi i kursen???

Tentamen i Immunteknologi 28 maj 2003, 8-13

Klipp-och-klistra DNA: fixa mutationen med gen editering DNA, RNA och Protein

DNA-analyser: Introduktion till DNA-analys med PCR och gelelektrofores. Niklas Dahrén

Område: Ekologi. Innehåll: Examinationsform: Livets mångfald (sid ) I atomernas värld (sid.32-45) Ekologi (sid )

Resultat:... (Cellbiologi:... Immunologi...) Betyg...

VI MÅSTE PRATA MED VARANDRA CELLENS KOMMUNIKATION

Transkript:

Biokemisk analys och separationsteknik FDA (Food and Drug Administration), Läkemedelsverket GLP = Good Laboratory Practice GMP = Good Manufacturing Practice SOP = Standard Operating Procedures Kvalitativ analys Kvantitativ analys

Kvantitativ analys Välja metod: Tillgång på utrustning Detektionsgränser metod/prov Antal prover Graden av komplexitet i provet Tänkbara risker metod/prov Kända/publicerade metoder Fel i analysen Noggrannhet hos laboranten instrumentet metoden

Minska de systematiska felen genom Blankprov Referens Mer än en metod SOP Metodens kvalité Reproducerbarhet/precision Noggrannhet Detektionsgräns Analytiskt fönster Specificitet Robusthet

Proteinernas/DNAts omgivning är viktig Önskvärda egenskaper hos en buffert:! Vattenlöslig! Inte giftig! Buffertkapacitet vid önskat ph-intervall och temperatur! Hög renhet hos ingående kemikalier! Ej absorbera UV eller synligt ljus Buffertkapacitet mycket viktig Koncentrations och temperaturberoende Konduktivitets [ms/cm] beroende In vivo modeller (vivus-levande) Man försöker studera händelser i ett normalt system hela organismer cellkulturer In vitro modeller!(vitrum-glasflaska, glaskärl) Förenklade, cellfria system används för att studera ett visst förlopp cellhomogenat delar av organ

Cellkulturer Mikrobiella kulturer (jäst, svampar, bakterier) Vävnadskulturer av växter Mammaliecellkulturer Att odla: #Batch #Fed-batch #Kontinuerlig För att kartlägga en viss funktion i en cell Mutationer " I genomet " Addera en funktion via plasmid Olika typer! Punktmutationer! Deletioner Effekt! Icke konditionella! Konditionella! Supressorkänsliga mutationer (sus)

1 500 ggr (0.2µm)! Ljusmikroskopi! Faskontrastmikroskopi! Polariserat ljus! Konfokalmikroskopi Mikroskopering 200 000 ggr (1nm)! Elektronmikroskopi! Transmissions elektronmikroskopi (TEM) (!!4*10-3 nm) tungmetaller! Scanning elektronmikroskopi (SEM) Ny teknik! Atomic force mikrosopi (AFM) lateralt 0.5-1 nm, vertikalt 0.1-0.2 nm 0.1nm 1nm 10nm 100nm 1µm 10µm 100µm 1mm Viruses Yeast Small molecules Globular proteins Ribosomes Bacteria Plant cells Embryos Organelles Animal cells Electron microscope Light microscope MRI Human eye

To Perform High Quality Immunohistochemistry On Selected Human Tissues And Cells HPRK300030:!-HER-2 Subcellular localisation: plasma membrane RT4 (Human epithelial urinary bladder carcinoma)

Elektronmikroskopbild av rer Provberedning (1) Vävnadsfixering! kemisk (formaldehyd, glutaraldehyd) omgivande material vax el dyl! frysning Tunna skivor! Ljusmikroskopi =5-10µm, mikrotom! TEM "100nm, ultramikrotom

TMA - production Collection of tissues Annotation TMA design Analysis TMA construction TMA sectioning Provberedning (2) Färgning: Ospecifik:! Kemikalier som binder - eller +-laddade molekyler! ph indikatorer Specifik:! Utnyttja protein-protin interaktioner (Antikroppar)! Koppla ett signalprotein till en molekyl med känd/okänd lokalisering (GFP)! Utnyttja enzymatiska reaktioner (utfällning)

Proteinlokalisering P.Samuelson et al. Färgen berättar om ph i organellen ph"5 lysosom ph"5,5-6,5 endosom

Separation och analys av DNA/RNA Bygger på laddning och storlek. DNA och RNA negativt laddat Aminosyror är optiskt aktiva undantag glycin Aminosyror i proteiner har alltid L-form

Aminosyror har flera pk a Glycin katjon zwitterjon anjon pi där aminosyran är oladdad Alifatiska aminosyror Aromatiska aminosyror

Laddade aminosyror Polära aminosyror Peptidbindning

Peptidbindning Endast ett pka relevant för de flesta aminosyrorna Undantag är de N- och C-terminala Disulfider stabiliserar proteinstrukturer

Primär, sekundär, tertiär, kvartenär Proteinmängden viktig för att tolka resultat Absorbansmätning, UV-ljus! Peptidbindning!=190 nm! Aromatiska sidogrupper!=280 nm Korrektionsfaktor för det önskade proteinet kan användas, förutsätter relativt rent material. Nukleinsyror absorberar också (260nm/280nm) Lowry:! Beroende av peptidbindningar och aromatiska aminosyror (Cu 2+ => Cu + ) BCA! Bicinchoninic acid, liknar Lowry (Cu 2+ => Cu + ) Bradford Coomassie Brilliant Blue, binder till arg och lys. Absorbtionsmax ändras vid inbindning! Bra standardkurva nödvändig Aminosyra analys! Provet degraderas till aminsyror och mängden av varje komponent bestäms mha kromtografi

Att extrahera ut sitt målprotein (1) Extraktionsbuffert Isoton lösning: jonstyrka 0.1-0.2 M, ph 7-8! Antioxidant, förhindra oxidation av fria S-grupper. DTT, "-merkaptoetanol, cystein, GSH! Enzyminhibitorer för att undvika nedbrytning av protein/dna/rna PMSF, DFP, IAA, Cystatin Låg temperatur (4 C) hämmar också enzymatisk aktivitet! Enzymsubstrat, co-faktorer tillsätts för att stabilisera målproteinet! EDTA för att förhindra oxidation av thioler, -SH! Polyvinylpyrrolidone (PVP) används till växtceller, fällning av fenolinnehållande ämnen! Natriumazid, lösningar som ska sparas under längre perioder Att extrahera ut sitt målprotein (2) Membranproteiner kräver särskild omtanke Perifera, binder till ytan genom elektrostatiska interaktioner och vätebindningar! går att få loss genom att öka salthalten (!1M NaCl) Integrerade, sträcker sig genom membranet, långa sekvenser med hydrofoba aminosyror! detergenter behövs, oftast får man prova sig fram till vad som passar målproteinet SDS, CTAB, CHAPS, Nonidet-40, Triton-X

Att extrahera ut sitt målprotein (3) Slå sönder cellen Mammalieceller (!10 µm)! är sköra och lätta att slå sönder Växtceller (!100 µm)! har rigida cellväggar, deras storlek gör att de ändå går ganska lätt att slå sönder Bakterier (!1-4µm)! tåliga och ganska svåra att förstöra! Grampositiva! Gramnegativa Svampar och jästceller är också relativt tåliga Metoder för att krossa cellerna (1) Mixa i hushållsmaskin Vävnadsdelar blandas med lämplig buffert.! Både för stor och liten skala Krossa tillsammans med slipmedel (sand el dyl) i en mortel (växtceller och bakterier)! Liten skala Glaskulekvarn! Mellan och stor skala Tryckförändring French press! Liten skala HPH! Mellan och stor skala

Metoder för att krossa cellerna (2) Enzymatiska metoder Lysozyme används för att bryta ner peptidoglycan! Gramnegativa bakterier behöver även behandlas med detergent och EDTA (Ca+)! Liten skala Lyticase eller zymolyase används till jästceller! Kompletteras med osmotisk shock! Liten skala Sonikering Ultraljud, >20kHz, skjuvkrafter! Liten skala ty hög värmeutveckling Osmotisk shock Cellerna utsätts för hög osmotisk potential och sedan mycket låg, membranet går sönder. Periplasmatiska proteiner! Liten och mellan skala