Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Absorbansmätningar XXXXXX och YYYYYY Årskull: Laborationsrapport Laborationsdatum: Inlämnad Godkänd Handledare:
Moment I: Ljusabsorption i kyvetter 1) Tabell 1. Uppmätta absorbansvärden för en plastkyvett, glaskyvett och kvartskyvett vid olika våglängder. Våglängd Abs Abs Abs (nm) plastkyvett glaskyvett kvartskyvett 200 3,381 3,344 0,696 205 3,584 3,536 0,494 210 3,708 3,489 0,398 215 3,562 3,386 0,315 220 3,615 3,534 0,266 225 3,587 3,653 0,239 230 3,871 3,7 0,212 235 3,671 3,486 0,17 240 3,601 3,488 0,13 245 3,643 3,676 0,105 250 3,913 3,703 0,099 255 3,91 3,645 0,068 260 4,024 3,638 0,066 265 3,913 3,548 0,064 270 3,708 3,578 0,065 275 3,752 3,452 0,064 280 3,537 3,345 0,06 285 3,453 2,79 0,06 290 2,289 1,924 0,057 295 1,532 1,278 0,056 300 0,91 0,86 0,056 305 0,725 0,577 0,057 310 0,633 0,385 0,051 315 0,578 0,264 0,05 320 0,536 0,19 0,048 325 0,501 0,136 0,049 330 0,472 0,102 0,049 335 0,446 0,08 0,048 340 0,421 0,069 0,049 345 0,402 0,06 0,048 350 0,385 0,053 0,048
2) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 200 220 240 260 280 300 320 340 Abs plastkyvett Abs glaskyvett Abs kvartskyvett Figur 1. Visar absorption som funktion av våglängden för de olika kyvettyperna. 3) Kvartskyvetten går att använda i nästan hela våglängdsspektrat som undersöktes. Möjligtvis att den absorberar lite för mycket i sig själv vid våglängderna mellan 200 och 250 nm. Plastkyvetten och glaskyvetten däremot, som följdes åt ganska bra, absorberade väldigt mycket i sig själv från 200 nm till cirka 280 nm. Därefter skedde en kraftig minskning av absorbansen. Dock var absorbansvärdena nere under 0,5 först vid våglängden 305 nm (glaskyvett) respektive 330 nm (plastkyvett). Skulle man fortsätta mätningen upp på längre våglängder ser det ut som att både glas- och plastkyvetten skulle komma ner närmare noll i absorbansvärde. Alltså lämpar sig plast- och glaskyvetter bäst vid absorbansmätningar över cirka 300 nm. Moment II: Våglängdsscanning med U1100 1) Tabell 2. Uppmätta absorbansvärden för protein vid olika våglängder efter blank med H 2 0 respektive Bio-Rad Våglängd (nm) Abs med H 2 O som blank Abs med Bio-Rad som blank 400 0,561-0,096 410 0,605-0,113 420 0,681-0,137 430 0,766-0,167 440 0,84-0,193 450 0,89-0,213 460 0,915-0,224 470 0,918-0,227 480 0,899-0,221 490 0,866-0,208 500 0,823-0,182 510 0,785-0,146
520 0,758-0,091 530 0,755-0,012 540 0,783-0,095 550 0,834 0,214 560 0,884 0,32 570 0,919 0,396 580 0,938 0,44 590 0,947 0,459 600 0,956 0,457 610 0,967 0,442 620 0,985 0,417 630 1,001 0,384 640 1,003 0,349 650 0,982 0,314 660 0,931 0,281 670 0,853 0,252 680 0,751 0,226 690 0,641 0,205 700 0,527 0,184 710 0,422 0,164 720 0,33 0,144 730 0,255 0,125 740 0,194 0,105 750 0,15 0,091 2) absorbans 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2400 500 600 700-0,4 våglängd (nm) Abs med H2O som blank Abs med Bio-Rad som blank Figur 2. Visar absorptionen som funktion av våglängden för mätningarna av et med H 2 O resp. Bio-Rad som blank. 3) Absorbansmätning av proteinar blandade med Bio-Rad bör mätas vid cirka 600 nm eftersom båda graferna uppvisar höga absorbansvärden där. Anledningen till att grafen som är blankad med H 2 O uppvisar så mycket högre absorbansvärden än den andra grafen är att den även visar Bio-Rads absorbans i en. Därför är den övre grafen ej användbar när man vill räkna ut proteinkoncentrationen i et. Grafen som är blankad med Bio-Rad visar däremot endast proteinets absorbans och kan därför användas vid beräkning av proteinets koncentration i et. Vid våglängder mellan 400 nm och 540 nm absorberar en
blankad med Bio-Rad mindre ljus än blanken vilket ger negativa absorbansvärden. Därav grafens utseende. Metod III : Val av våglängdsfilter 1) Tabell 3. De färgade arnas absorbansvärde vid 405 nm. Absorbans vad 405 nm 1 0,225 0,17 0,064 0,157 2 0,222 0,172 0,063 0,161 3 0,226 0,169 0,06 0,156 4 0,228 0,171 0,066 0,157 5 0,23 0,173 0,065 0,169 6 0,225 0,17 0,062 0,155 7 0,226 0,173 0,066 0,156 8 0,226 0,173 0,062 0,158 9 0,229 0,175 0,064 0,157 10 0,229 0,171 0,063 0,156 medel 0,227 0,172 0,064 0,158 median 0,226 0,172 0,064 0,157 std 0,0024 0,0018 0,0019 0,0041 Tabell 4. De färgade arnas absorbansvärde vid 450 nm. Absorbans vad 450 nm 1 0,198 0,067 0,188 0,14 2 0,198 0,068 0,188 0,142 3 0,202 0,068 0,188 0,147 4 0,203 0,068 0,186 0,142 5 0,203 0,068 0,187 0,142 6 0,202 0,068 0,187 0,14 7 0,202 0,068 0,188 0,14 8 0,203 0,068 0,187 0,14 9 0,203 0,068 0,188 0,14 10 0,204 0,068 0,188 0,138 medel 0,202 0,068 0,188 0,141 median 0,203 0,068 0,188 0,140 std 0,0021 0,0003 0,188 0,138
Tabell 5. De färgade arnas absorbansvärde vid 492 nm. Absorbans vad 492 nm 1 0,104 0,19 0,561 0,058 2 0,105 0,193 0,563 0,058 3 0,106 0,194 0,561 0,058 4 0,107 0,193 0,564 0,058 5 0,107 0,196 0,56 0,058 6 0,107 0,195 0,56 0,058 7 0,106 0,194 0,562 0,058 8 0,107 0,194 0,559 0,058 9 0,107 0,194 0,561 0,057 10 0,107 0,194 0,561 0,057 medel 0,106 0,194 0,561 0,058 median 0,107 0,194 0,561 0,058 std 0,0011 0,0016 0,0015 0,0004 Tabell 6. De färgade arnas absorbansvärde vid 540 nm. Absorbans vad 540 nm 1 0,061 0,519 0,59 0,008 2 0,061 0,524 0,593 0,007 3 0,062 0,52 0,59 0,007 4 0,064 0,519 0,595 0,007 5 0,063 0,527 0,589 0,007 6 0,063 0,524 0,59 0,007 7 0,063 0,522 0,592 0,007 8 0,063 0,523 0,59 0,007 9 0,063 0,522 0,59 0,007 10 0,063 0,523 0,592 0,007 medel 0,063 0,522 0,591 0,007 median 0,063 0,522 0,590 0,007 std 0,0009 0,0025 0,0019 0,0003 2) Se under respektive tabell 3) Vi bedömer att vi inte har några extremvärden som behöver testas med Q-test.
4) 0,7 0,6 absorbans 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 vid 405 nm vid 450 nm vid 492 nm vid 540 nm Figur 3. Diagrammet visar medelvärdet av de olika färgarnas absorbans vid de olika våglängderna. Den a en bör mätas vid 405 nm eftersom den uppvisar högst absorbans då. Dess absorbans minskar sedan med ökande våglängd. Den en skall mätas vid 540 nm. Absorbansen där är betydligt högre än vid de andra våglängderna. Absorbansen vid de olika våglängderna följer inget tydligt mönster. Den a en kan mätas vid 492 nm eller 540 nm, men har lite högre absorbans vid 540 nm. Absorbansen vid de här våglängderna är betydligt högre än vid 405 nm och 450 nm. Den a en bör mätas vid 405 nm men har relativt låga absorbansvärden vid alla fyra våglängderna.