COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, version 2.0. COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: Wash Buffer ART: US: 83314

COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, version 2.0 PCX FÖR IN VITRO DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. Beställnings- COBAS AmpliPrep/ PCX 96 Tests P/N: 03576698 190 information COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Avsedd användning COBAS AmpliPrep System PWR 4 Liters P/N: 03309380 123 Wash Reagent COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR hepatit C virustest (HCV), version 2.0 (v2.0) är ett kvalitativt in vitro test för detektion av hepatit C virus-rna i humanserum och -plasma med hjälp av COBAS AmpliPrep instrument för provbehandling och COBAS AMPLICOR analysator för amplifiering och detektion. Förekomsten av HCV-RNA är bevis på aktuell HCV-infektion i patienter med kliniska och/eller biokemiska symtom på leversjukdom. Testet utnyttjar omvänd transkription av mål-rna för att generera komplementär DNA (cdna), amplifiering av mål-cdna genom polymeras-kedjereaktion (PCR), och nukleinsyrahybridisering för detektion av HCV-RNA i humanserum eller -plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-analys, v2.0 är inte avsedd för screening av blod eller blodprodukter för förekomst av hepatit C-virus. Sammanfattning och förklaring av test Hepatit C-virus infekterar 170 miljoner människor över hela världen och har beskrivits som en viruspandemi, med en prevalens som är fem gånger större än HIV-1-infektioner 1. HCV är ett enkelsträngat, positivt RNA-virus med en genom på ca 10 000 nukleotider, kodade för 3 000 aminosyror 2. I egenskap av ett genom virus kan HCV transporteras i blod och blodprodukter. Utbredd användning av blodscreening för HCV har på ett markant sätt minskat risken för transfusionsassocierad hepatit. Incidensen av HCV-infektion är störst i anknytning till intrevnöst drogmissbruk och mindre utsträckning vid annan perkutan exponering 4. Den globala prevalensen av HCV-infektion, som fastställs med användning av immunoserologi, varierar från 6 % till 28 % i Egypten, 1,8 % i USA 1 och 1,1 %-1,2 % i Frankrike 3. Mellan 75 % och 80 % av seropositiva patienter är också viremiska 1,3. P/N: 03576167 190 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 1/48

Metodprinciper Förekomsten av anti-hcv-antikroppar i patienter som infekterats med HCV har lett till utvecklingen av immunserologiska tester specifika för dessa antikroppar 4,5. Implementering av dessa analysmetoder har redan minskat incidensen av posttransfusionshepatit världen runt. Tilläggstestning har utförts med hjälp av RIBAanalys (recombinant immunoblot assay) för att utvärdera prov som är upprepat reaktiva vid antikropps-screening-analys. Nyligen gjorda utvärderingar har visat att tolkningen av tilläggstestet beror på patientens riskstatus. Bland blodgivare från en lågriskpopulation bekräftades till exempel i vissa fall endast förekomsten av 50 % RIBA-reaktiva prover av en HCV-RNA-analys 6,7,8. Detta innebär att ett positivt RIBA-resultat inte är en sann indikator av en aktiv HCV-infektion eftersom återhämtade patienter kan förbli anti-hcv-positiva under många år 5. Dessutom har ej fastställbara resultat av tilläggstester erhållits både för nyligen infekterade personer som undergår serokonversion samt för personer med en kronisk HCVinfektion 9,10. Immunserologisk analys är ett mått på aktuell och/eller tidigare exponering för HCVinfektion, men den kan inte diskriminera mellan dessa två. För tillfället är en immunologisk analysmetod för direkt detektion av HCV-antigen inte tillgänglig. Vid fall av akut HCV-infektion är det möjligt att individer inte kan producera antikroppar mot HCV 11, vilket gör det omöjligt att diagnostisera aktuell HCV-infektion med hjälp av immunserologisk teknik. Å andra sidan kan detektion av HCV-RNA nukleinsyraanalys ge bevis på aktuell infektion. Med hjälp av nukleinsyraanalys är det möjligt att detektera HCV-viremi före immunologisk serokonversion 12,13. Eftersom nukleinsyratester kan användas för direkt detektion av HCV-RNA, dvs. oberoende av patientens immunstatus, är en nukleinsyrabaserad analys ett viktigt hjälpmedel vid detektion av HCV-RNA hos patienter med nedsatt immunförsvar 8. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR hepatit C-virustest (HCV), version 2.0 (v2.0) är ett nukleinsyraamplifieringstest för detektion av hepatit C virus-rna i humanplasma eller -serum. Provpreparation är automatisk med hjälp av COBAS AmpliPrep instrument. Amplifiering och detektion har automatiserats med hjälp av COBAS AMPLICOR-analysator. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 är baserad på fem huvudprocesser: provpreparation för att erhålla HCV-RNA; omvänd transkription av mål-rna för att generera kompletterande DNA (cdna) 1 ; PCR-amplifiering 1 av mål-cdna med hjälp av HCV-specifika kompletterande primers; hybridisering av de amplifierade produkterna till oligonukleotida detektionsprober som är specifika för målet(en); och detektion av de probinriktade amplifierade produkterna med hjälp av kolorimetrisk bestämning. Med COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, går det att få en automatiserad provpreparation, följd av automatiserad omvänd transkription, PCRamplifiering, hybridisering och detektion av HCV-mål-RNA och HCV intern kontroll-rna. Reagensen i master mixen innehåller ett primerpar som är specifikt för både HCV och HCV intern master mixen-rna. Detektionen av amplifierad DNA utförs med hjälp av målspecifika oligonukleotida prober som tillåter fristående identifikation av HCV amplicon och HCV intern kontrollamplicon. Detektion av amplifierad HCV intern kontroll-dna utförs enligt användarens godtycke. 2/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 Val av mål Val av mål-rna-sekvens för HCV beror på identifikation av regioner inom HCVgenomen som uppvisar maximal sekvenskonservering bland de olika HCVgenotyperna 14,15,16. Olika oligonukleotider används vid provpreparation för att fånga HCV-RNA och HCV intern kontroll-rna; som primers vid omvänd transkription och amplifiering av HCV-RNA och HCV intern kontroll-rna; och vid detektion för att fånga in amplicon under amplifieringen av omvänt transkriberat HCV-RNA och HCV intern kontroll-rna. Följaktligen är lämpligt val av preparationsprob, primers och detektionsprob av kritisk vikt för analysens förmåga att finna och detektera alla HCV-genotyper. HCVgenomens 5'-oöversatta region (UTR) har visat sig ha den högsta konserveringen av RNA-sekvensen bland kända HCV-genotyper 18,19. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, utnyttjar en biotinyl preparationsprob, ST101BP, för att fånga in RNA under provpreparation. För omvänd transkription och PCRamplifiering, definierar primers KY78 och KY80 en sekvens av 244 nukleotider inom den synnerligen konserverade 5'-UTR av HCV-genomen 13. ST101BPpreparationsprobsekvensen ligger utanför amplifieringsregionen och finns på det mest konserverade området inom 5'-UTR 19. Provpreparation Omvänd transkription och PCR-amplifiering COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, utnyttjar automatisk provpreparation med COBAS AmpliPrep instrument med hjälp av DNAprobinfångningsteknik. COBAS AmpliPrep instrument utnyttjar förhöjd temperatur och en kaotropisk lösning för att frigöra HCV-RNA från viruspartiklar och för att skydda RNA mot RNaser i plasma och serum. Ett känt antal HCV interna kontroll- RNA-molekyler introduceras i varje prov med lyseringsreagenset och det biotinyla preparationsprobreagenset. Temperaturen sänks sedan för att tillåta hybridering av HCV-RNA och HCV intern kontroll-rna till den biotinyla preparationsproben, ST101BP. Hybriderad ST101BP:HCV-RNA och ST101BP:HCV interna kontroll- RNA komplex binds sedan vid streptavidin-belagda magnetpartiklar. COBAS AmpliPrep instrumentet separerar de streptavidin-belagda magnetpartiklarna med bundet RNA från resten av reaktionsblandningen och tvättar de magnetiska partiklarna före återsuspension av det behandlade provet. Det behandlade provet, som innehåller de streptavidin-belagda magnetiska partiklarna med bundet HCV- RNA och HCV intern kontroll-rna, läggs sedan till amplifieringsblandningen. HCV mål-rna och HCV intern kontroll-rna utsätts sedan för omvänd transkription, amplifieras och detekteras med COBAS AMPLICOR analysator med hjälp av amplifierings- och detektionsreagens från testsatsen. Omvänd transkription De omvända transkriptions- och amplifieringsreaktionerna utförs med det termostabila rekombinanta enzymet Thermus thermophilus DNA polymeras (rtth pol). I närvaro av mangan (Mn 2+ ) och under lämpliga buffertförhållanden har rtth pol både omvänd transkriptas- och DNA-polymerasaktivitet 1. Detta tillåter både omvänd transkription och PCR-amplifiering i samma reaktionsblandning. Behandlade prover läggs till amplifieringsblandningen i amplifieringsrör (A-rör) i vilka både omvänd transkription och PCR-amplifiering sker. Nedströms- eller antisensprimern (KY78) biotinyleras vid 5'-änden; uppströms- eller sensprimern (KY80) biotinyleras inte. Reaktionsblandningen värms upp för att tillåta nedströmsprimern att hybridisera särskilt till HCV mål-rna och till HCV intern 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/48

kontroll-mål-rna. I närvaro av Mn 2+ och överflödiga deoxynukleosid trifosfater (dntps), inklusive deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytidin och deoxyuridin (i stället för tymidin) trifosfater, förlänger, rtth pol den värmebehandlade primern så att en DNA-sträng (cdna) bildas som är komplementär med RNA-målet. Amplifiering av mål Efter omvänd transkription av HCV-mål-RNA och HCV intern kontroll-rna, värms reaktionsblandningen för att denaturera RNA:cDNA-hybriden och exponera primarmålsekvenserna. Medan blandingen svalnar hybridiserar uppströmsprimern (KY80) specifikt till cdna-strängen, rtth pol förlänger primerna och en andra DNA-sträng syntetiseras. Detta fullgör den första PCR-cykeln och resulterar i en dubbelsträngad DNA-kopia av målområdet för HCV-RNA och HCV intern kontroll- RNA. Reaktionsblandningen värms åter upp för att separera resulterande dubbelsträngad DNA och exponera primermålsekvenserna. Medan blandningen svalnar hybridiserar primers KY78 och KY80 till mål-dna. rtth pol, i närvaro av Mn 2+ och överflödig dntps förlänger hybridiserade primers längs målmallarna för att producera en 244-basparig dubbelsträngad DNA-molekyl som benämns en amplicon. COBAS AMPLICOR analyzer upprepar denna process automatiskt under ett bestämt antal cykler, där varje cykel fördubblar mängden amplicon-dna. Nödvändigt antal cykler har förprogrammerats i COBAS AMPLICOR analysator. Amplifiering sker endast i HCV-genomområdet mellan primers; hela genomen amplifieras ej. Intern kontrollamplifiering Vid enzymbaserade amplifieringsprocesser, till exempel PCR, kan effektiviteten påverkas av eventuella inhibitorer i provet. HCV intern kontroll har lagts till COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, för att tillåta identifikation av behandlade prover innehållande ämnen som kan störa PCR-amplifieringen. HCV intern kontroll är en RNA-transkription med primerbindningsområden som är identiska med de i HCV-målsekvensen: en randomiserad intern sekvens av liknande längd och baskomposition som HCV-målsekvensen, ett unikt probbindningsområde som differentierar HCV intern kontroll från mål-amplicon. Dessa funktioner valdes för att garantera ekvivalent amplifiering av HCV intern kontroll och HCV-mål-RNA. HCV intern kontroll-rna introduceras i varje prov med lyseringsreagenset och verkar som en extraktions- och amplifieringskontroll för varje självständigt behandlat prov. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av målnukleinsyra från provet uppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, med hjälp av AmpErase (uracil- N-glykosylas), enzym och deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet registrerar och katalyserar destruktionen av DNA-strängar som innehåller deoxyuridin 20, men inte DNA som innehåller deoxytymidin. Deoxyuridin finns inte i naturligt förekommande DNA, men finns alltid i amplicon eftersom deoxyuridintrifosfat används som ett dntp i master mix reagenset i stället för tymidintrifosfat. Endast amplicon innehåller därför deoxyuridin. Deoxyuridin gör att kontaminerande amplicon kan förstöras av AmpErase-enzym före amplifiering av mål-dna. AmpErase-enzym, som inkluderas i master mix reagenset, katalyserar klyvningen av deoxyuridin innehållande DNA vid deoxyuridinresterna, genom att öppna deoxyribos-kedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmningen under det första termiska cykelsteget vid alkaliskt ph för master mixen, bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxyuridin-positionen, vilket gör att DNA inte kan amplifieras. AmpErase- 4/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 enzymet är inaktivt vid temperaturer över 55 ºC, d.v.s. under alla termiska cykelsteg, och förstör därför inte mål-amplicon. Efter amplifiering denatureras restenzym genom tillsats av denatureringslösning, vilket förhindrar degradering av målamplicon. AmpErase-enzym i COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, har demonstrerats inaktivera minst 10 3 kopior av deoxyuridin-innehållande HCV-amplicon per PCR. Hybrideringsreaktion Efter PCR-amplifiering tillsätter COBAS AMPLICOR analysator automatiskt denatureringslösning till A-rören för kemisk denaturering av HCV-amplicon och HCV intern kontroll-amplicon för att bilda enkelsträngad DNA. Alikvoter av denaturerad amplicon överförs sedan till detektionskoppar (D-koppar). En suspension av magnetiska detektionspartiklar belagda med oligonukleotid detektionsprob, specifik för HCV-amplicon (KY150) eller HCV interna kontrollamplicon (SK535), tillsätts i de enskilda D-kopparna. Biotin-märkt HCV och HCV intern kontroll-amplicon hybridiseras till de målspecifika oligonukleotidadetektionsprober bundna vid de magnetiska detektionspartiklarna. Hybridiseringen av amplicon till den målspecifika proben ökar testets specificitet i stort. Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen tvättar COBAS AMPLICOR-analysator de magnetiska detektionspartiklarna i D-koppen för att avlägsna icke-bundet material och lägger därefter till avidin-hrp-peroxidaskonjugatet. Avidin-hrpperoxidaskonjugatet binds vid biotin-märkt amplicon, som hybridiserats till de målspecifika oligonukleotida detektionsproberna bundna vid de magnetiska detektionspartiklarna. COBAS AMPLICOR analysator avlägsnar obundet konjugat genom att tvätta de magnetiska detektionspartiklarna och sedan lägga till en substratlösning innehållande väteperoxid och 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) till varje D-kopp. I närvaro av väteperoxid katalyserar det partikelbundna hrpperoxidaset oxidationen av TMB för att bilda ett färgat komplex, vars absorption mäts av COBAS AMPLICOR analysator vid en våglängd på 660 nm. 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/48

Reagenser COBAS AmpliPrep/ PCX 96 tester P/N:03576698 190 COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Reagenser för provberedning och kontroller HCV CS1, v2.0 (HCV kulreagenskassett, version 2.0) Natriumfosfatbuffert Natriumklorid < 5 % suspension Dynabeads (paramagnetiska partiklar) belagda med streptavidin < 0,05 % tvättmedel 0,09 % natriumazid HCV CS2, v2.0 (HCV lyseringsreagenskassett, version 2.0) Tris-HCl-buffert 44 % guanidintiocyanat 2,5 % ditiotreitol < 10 % polyetylenglykol < 0,5 % tvättmedel + Xn 44 % (v/v) guanidintiocyanat 2 x 48 tester 2 x 48 tester Hälsoskadlig HCV CS3, v2.0 HCV multireagenskassett innehållande: HCV PROBE, v2.0 (HCV probreagens, version 2.0) Tris-HCl-buffert < 0,001 % HCV-specifik oligonukleotidpreparation prob ST101BP EDTA 0,09 % natriumazid HCV IC, v2.0 (HCV intern kontroll, version 2.0) Tris-HCl-buffert < 0,001 % Aurintrikarboxylsyra < 0,001 % icke-infektiös transkriberad RNA in vitro (mikrobiell) innehållande HCV-preparationsprob och HCV primer bindesekvenser och ett unikt detektionsprobbindningsområde. < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,09 % natriumazid 1 x 96 tester 1 x 4,8 ml 1 x 4,8 ml 6/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 HCV DIL, v2.0 (HCV provspädningsvätska, version 2.0) Tris-HCl-buffert < 0,001 % Aurintrikarboxylsyra < 0,005 % biotin < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,09 % natriumazid 1 x 7,2 ml HCV (+) C, v2.0 8 x 0,9 ml (HCV positiv kontroll, version 2.0) < 0,001 % armerat RNA -konstrukt innehållande HCV-sekvenser (ickeinfektiös RNA i MS2-bakteriofag) Negativ humanplasma, icke-reaktiv enligt US FDA-licensierade analyser för antikropp till HCV, antikropp till HIV-1/2, HIV p24 antigen och HBsAg; HIV-1 RNA, HCV-RNA och HBV-DNA som inte är detekterbar med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 CAP ( ) C 8 x 0,9 ml [COBAS AmpliPrep negativ kontroll (humanplasma)] Negativ humanplasma, icke-reaktiv enligt US FDA-licensierade analyser för antikropp till HCV, antikropp till HIV-1/2, HIV p24 antigen och HBsAg; HIV-1 RNA, HCV-RNA och HBV DNA inte detekterbar med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 Amplifierings- och detektionsreagenser HCV MMX, v2.0 8 x 0,7 ml (HCV master mix, version 2.0) Bicinbuffert 16 % DMSO Glycerol < 0,01 % rtth DNA polymeras (rtth pol, mikrobiell) Kaliumacetat < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005 % KY78 och KY80 primers (KY78 är biotinyl) < 0,01 % AmpErase enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiell) 0,05 % natriumazid HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganlösning, version 2.0) < 2 % mangan Ättiksyra Amarant-färg 0,05 % natriumazid 8 x 0,1 ml 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 7/48

CX PS1, v2.0 1 x 100 tester (HCV probsuspension 1, version 2.0) MES-buffert < 0,4 % suspension Dynabeads (paramagnetiska partiklar) belagda med HCV-specifik oligonukleotidfångstprob KY150 0,09 % natriumazid CX4, v2.0 (HCV probsuspension 2, version 2.0) Natriumfosfatbuffert < 0,2 % lösningsförmedlare 42,2 % natriumtiocyanat + Xn 42,2 % (v/v) natriumtiocyanat 1 x 100 tester Hälsoskadlig IC PS1 1 x 100 tester (Intern kontrollprobsuspension 1) MES-buffert < 0,4 % suspension Dynabeads (paramagnetiska partiklar) belagda med intern kontroll-specifik oligonukleotidfångstprob SK535 0,09 % natriumazid IC4 (Intern kontrollprobsuspension 2) Natriumfosfatbuffert < 0,2 % lösningsförmedlare 24,9 % natriumtiocyanat DN4 (Denatureringslösning) 1,6 % natriumhydroxid EDTA Tymolblå + Xi 1,6 % (v/v) natriumhydroxid 1 x 100 tester 1 x 100 tester Irriterande CN4 (Avidin-hrp-peroxidaskonjugat) Tris-HCl-buffert < 0,001 % Avidin-hrp-peroxidaskonjugat Bovint serumalbumin (från däggdjur) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1 % fenol 1 % ProClin 150 SB3 (Substrat A) Citratlösning 0,01 % väteperoxid 0,1 % ProClin 150 3 x 100 tester 5 x 75 tester 8/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 SB (Substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) 5 x 5 ml T 40 % (v/v) dimetylformamid (DMF) Giftig R: 61-20/21-36 Kan ge fosterskador. Farligt vid inandning och hudkontakt. Irriterar ögonen. S: 53-45 Undvik exponering - Begär specialinstruktioner före användning. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. COBAS AmpliPrep System PWR 4 liter P/N: 03309380 123 Wash Reagent COBAS AmpliPrep System Tvättreagens Tris-HCl-buffert < 2 % kaliumacetat < 0,05 % tvättmedel 0,3 % natriumazid + Xn 0,3 % (v/v) natriumazid Hälsoskadlig COBAS AMPLICOR WB 500 tester P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR Tvättbuffert US: 83314 WB 2 x 250 tester (10X-tvättkoncentrat) < 2 % fosfatbuffert < 9 % natriumklorid EDTA < 2 % tvättmedel 0,5 % ProClin 300 Varningar och försiktighetsåtgärder Denna analys skall användas med humanserum eller -plasma som enbart insamlats i antikoagulangten EDTA. Heparin har visat sig hämma PCR och får inte användas med denna procedur. Pipettera inte med munnen. 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 9/48

Du får inte äta, dricka eller röka inom laboratoriet. Använd skyddshandskar för engångsbruk, skyddsrock och ögonskydd vid hantering av prover och satsreagens. Tvätta händerna grundligt efter hantering av prover och satsreagens. Undvik mikrobiell och ribonukleas kontamination av reagens när du avlägsnar alikvoter från reagensflaskor. Användning av sterila pipetter för engångsbruk och RNas-fria pipettspetsar rekommenderas. Samla inte reagens från olika satser eller olika flaskor inom samma sats. Använd inte reagens (inklusive kassetter) från olika satser under samma körning. Öppna inte COBAS AmpliPrep-kassetter. Byt inte ut, blanda, avlägsna eller lägg till flaskor. Kassera oanvänd reagens och avfall i enlighet med vedertagna lagar och förordningar. Använd aldrig en sats efter utgångsdatum. Varuinformationsblad (Material Safety Data Sheets = MSDS) kan erhållas från ett lokalt Roche-kontor. Arbetsflödet i laboratoriet måste gå i en riktning, från pre-amplifieringsområdet till post-amplifieringsområdet (amplifiering/detektion). pre-amplifieringsaktiviteter inkluderar reagenspreparation och provpreparation. Tillbehör och utrustning måste dediceras till varje pre-amplifieringsaktivitet och får inte användas för andra ändamål eller flyttas mellan områden. Handskar måste användas inom varje arbetsområde och måste bytas innan man lämnar området. Utrustning och tillbehör som används för reagenspreparation får inte användas för prov- och kontrollhantering eller för pipettering eller behandling av amplifierad DNA eller andra källor för mål-dna. Efter-amplifieringstillbehör och -utrustning måste förbli i efter amplifieringsområdet. Prover och kontroller bör hanteras som infektiösa i enlighet med säkra laboratorieprocedurer, t.ex. på det sätt som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 och i CLSI-dokument M29-A 22. Rengör grundligt och desinficera alla arbetsytor med en nyligen tillredd lösning av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten OBS! Kommersiellt tillgängligt flytande blekmedel för hushållsbruk innehåller natriumhypoklorit vid en koncentration på 5,25 %. Ett blandningsförhållande på 1:10 för hushållsblekmedel kommer att producera en 0,5 % natriumhypokloritlösning. VAR FÖRSIKTIG: CAP ( ) C och HCV (+) C, v2.0 innehåller negativ humanplasma från humanblod. Källmaterialet har testats med testmetoder godkända av US FDA och har visat sig vara icke-reaktiva till närvaro av antikropp till HCV, antikropp till HIV-1/2, HIV p24-antigen och hepatit B-ytantigen (HBsAg). Dessutom testades poolade givarenheter; ingen HIV-1 RNA, HCV-RNA och HBV DNA detekterades av PCR och ingen HBV-kärnantikropp detekterades med hjälp av FDA-licensierad analys. Inga kända analysmetoder kan erbjuda fullständiga garantier för att produkter som härrör från humant blod inte överför smitta. Därför bör allt material från humankällor betraktas som potentiellt smittsamma. CAP ( ) C 10/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 och HCV (+) C, v2.0 bör hanteras som infektiösa i enlighet med säkra laboratorieprocedurer, t.ex. på ett sätt som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 och i CLSI-dokument M29-A 22. Rengör grundligt och desinficera alla arbetsytor med en nyligen tillredd lösning av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. Lösningar inom HCV CS1, v2.0 och HCV CS3, v2.0; och HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; CX PS1, v2.0; IC PS1 och PWR innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparrör i avlopp och bilda en högexplosiv metallazid. Samtidigt som lösningen innehållande natriumazid hälls ner i en laboratorievask, ska vatten spolas rikligt för att förhindra azidansamling. Använd ögonskydd, skyddsrock och handskar för engångsbruk vid hantering av PWR, HCV CS2, v2.0; HCV MMX, v2.0; DN4, CX4, v2.0; IC4; CN4, SB3, SB och arbetssubstrat (blandad SB3 och SB reagens). Se till att dessa material inte kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Vid kontakt, spola omedelbart med rikligt med vatten. Brännsår kan uppstå om området inte behandlas. Om dessa reagenser spills, skall du späda ut med vatten innan du torkar upp. Låt inte hud och slemhinnor komma i kontakt med SB eller arbetssubstrat. Vid hudkontakt, spolas rikligt med tvål och vatten. SB och arbetssubstrat innehåller dimetylformamid som har rapporterats vara toxiskt i höga orala doser och kan även leda till fosterskada. Hudkontakt, inandning av ångor och förtäring måste undvikas. Vid hudkontakt, tvätta grundligt med tvål och vatten och kontakta omedelbart läkare. Låt inte HCV CS2, v2.0, som innehåller guanidintiocyanat eller CX4, v2.0 och IC4 som innehåller natriumtiocyanat, komma i kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel). Dessa blandningar kan producera mycket giftig gas. När du kasserar COBAS AmpliPrep-provbehandlingsenheter (SPU-enheter) som innehåller guanidintiocyanat, skall du undvika kontakt med natriumhypokloritlösing (blekmedel). Dessa blandningar kan producera mycket giftig gas. Hanterings- och förvaringskrav Frys inte reagens och kontroller. Förvara HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0 och HCV CS3, v2.0 vid 2-8º C. I oanvänt skick är dessa reagenser stabila fram till angivet utgångsdatum. Efter användning förblir reagenser stabila under 30 dagar vid 2-8 C eller till utgångsdatum beroende på vilket som inträffar först. HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0 och HCV CS3, v2.0 kan användas för högst 6 instrumentcykler (16 timmar per cykel), antingen kontinuerligt på instrumentet eller under förvaring vid 2-8 C mellan cykler, upp till högst 96 timmar kumulativt på COBAS AmpliPrep instrument. Reagens måste lagras vid 2-8 C mellan instrumentcykler. Förvara CAP ( ) C och HCV (+) C, v2.0 vid 2-8º C. I oöppnat skick är dessa kontroller stabila tills angivet utgångsdatum. När de har öppnats måste den oanvända delen slängas. 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 11/48

Förvara HCV MMX, v2.0 och HCV Mn 2+, v2.0 vid 2-8º C. Dessa reagenser är stabila fram till angivet utgångsdatum. När de har öppnats måste den oanvända delen slängas. Arbetande huvudblandning (preparerat genom tillsats av HCV Mn 2+, v2.0 till HCV MMX, v2.0) måste förvaras vid 2-8º C och användas inom 4 timmar efter preparation. Förvara CX PS1, v2.0 och CX4, v2.0 vid 2-8 C. Dessa reagenser är stabila fram till angivet utgångsdatum. När CX PS1, v2.0 och CX4, v2.0 har blandats förblir arbetsreagensen stabil under 30 dagar vid 2-8 C. Arbetsreagens kan användas under högst 6 instrumentcykler (12 timmar per cykel) och måste lagras vid 2-8 C mellan instrumentcykler. Förvara IC PS1 och IC4 vid 2-8 C. Dessa reagenser är stabila fram till angivet utgångsdatum. När IC PS1 och IC4 har blandats förblir arbetsreagens stabilt 30 dagar vid 2-8 C. Arbetsreagens kan användas under högst. 6 instrumentcykler (12 timmar per cykel) och måste lagras vid 2-8 C mellan instrumentcykler. Förvara DN4 vid 2-25 C. DN4 är stabilt fram till angivet utgångsdatum. DN4 förblir stabilt under 30 dagar vid 2-8 C eller fram till utgångsdatum, beroende på vilket som inträffar först. DN4 kan användas under högst 6 instrumentcykler (12 timmar per cykel) och måste förvaras vid 2-8 C mellan instrumentcykler. Förvara CN4 vid 2-8 C. CN4 är stabilt fram till angivet utgångsdatum. Det förblir stabilt under 30 dagar vid 2-8 C eller till utgångsdatumet beroende på vilket som inträffar först. CN4 kan användas under högst. 6 instrumentcykler (12 timmar per cykel) och måste förvaras vid 2-8 C mellan instrumentcykler. Förvara SB3 och SB vid 2-8 C. I oöppnat skick är dessa reagenser stabila fram till angivet utgångsdatum. Arbetssubstrat måste prepareras varje dag genom att blanda SB3 med SB. Arbetssubstrat är stabilt på COBAS AMPLICOR analysator under 16 timmar. Exponera inte SB3, SB eller arbetssubstrat för metaller, oxidationsmedel eller direkt ljus. Förvara PWR vid 2-32 C. PWR är stabilt fram till angivet utgångsdatum. Efter det att det öppnats förblir denna reagens stabilt under 30 dagar vid 2-32 C eller till utgångsdatum beroende på vilket som inträffar först. Förvara WB vid 2-30 C. WB är stabilt fram till angivet utgångsdatum. Undersök WB för spädning och värm vid behov till 30-37 C för att återupplösa eventuell fällning. Arbetstvättbuffert (1X), preparerad genom spädning av WB 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten, måste förvaras vid 2-25 C i COBAS AMPLICOR-tvättbuffertreservoar och är stabil under 2 veckor från preparationsdatumet. Förvara delvis använd provpreparation och detektionsreagens vid 2-8 C mellan instrumentkörningar. Kontrollera utgångsdatum för använd, öppnad eller arbetande reagens innan du laddar på COBAS AmpliPrep instrument eller COBAS AMPLICOR-analysator. 12/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 Tillhandahållet material COBAS AmpliPrep/COBAS PCX P/N: 03576698 190 AMPLICOR HCV Test, v2.0 Tillredning av Prov- och kontrollreagenser HCV CS1, v2.0 (HCV kulreagenskassett, version 2.0) HCV CS2, v2.0 (HCV lyseringsreagenskassett, version 2.0) HCV CS3, v2.0 (HCV flerreagenskassett, version 2.0) HCV (+) C, v2.0 (HCV positiv kontroll, version 2.0) CAP ( ) C [COBAS AmpliPrep negativ kontroll (humanplasma)] Amplifierings- och detektionsreagenser HCV MMX, v2.0 (HCV master mix, version 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganlösning, version 2.0) CX PS1, v2.0 (HCV probsuspension 1, version 2.0) CX4, v2.0 (HCV probsuspension 2, version 2.0) IC PS1 (Intern kontrollprobsuspension 1) IC4 (Intern kontrollprobsuspension 2) DN4 (Denatureringslösning) CN4 (Avidin-hrp-peroxidaskonjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AmpliPrep System PWR P/N: 03309380 123 Wash Reagent COBAS AmpliPrep SystemTvättreagens COBAS AMPLICOR Wash Buffer WB P/N: 20759899 123 COBAS AMPLICOR Tvättbuffert ART: 07 5989 9 US: 83314 WB (10X-tvättkoncentrat) 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 13/48

Nödvändiga material som ej medföljer Föramplifiering Prov- och kontrollpreparationsområde COBAS AmpliPrep instrument AMPLILINK-programvara, v 2.3 eller senare Användarhandbok för AMPLILINK programvara, v 2.3 eller senare Metodhandbok för COBASAmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 Datastation för AMPLILINK programvara, med skrivare Användarhandbok för COBAS AmpliPrep instrument Provbehandlingsenheter (SPU-enheter) Provinmatningsrör (S-rör) med streckkodsklips (P/N: 03137040001) Kassett med utmatningsrör (P/N: 03137058001) Kassett med K-spetsar (P/N: 03287343001) pipetter med RNAs-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. (kapacitet 1000 μl)* Vortex-mixer Handskar för engångsbruk, pulverfria Föramplifiering Reagenspreparationsområde COBAS AMPLICOR A-ring försedd med 12 A-rör (P/N: 21045636001) COBAS AMPLICOR A-ringhållare Eppendorf Multipette -pipett med 1,25 ml Combitip -reservoar (steril, i egen förpackning) Pipetter med RNAs-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning (kapacitet 50 μl och 100 μl)* Återförslutningsbara plastpåsar Handskar för engångsbruk, pulverfria Efteramplifiering Amplifierings/detektionsområde COBAS AMPLICOR analyzer länkad till datastation för programvaran AMPLILINK och en skrivare** Användarhandbok för COBAS AMPLICOR analysator Metodhandbok för COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 Användarhandbok för AMPLILINK programvara, v2.3 eller senare Kassetter för D-koppar (P/N: 21045644001) Destillerat eller avjoniserat vatten 5 ml serologiska pipetter Vortex-mixer Handskar för engångsbruk, pulverfria * Pipetternas exakthet bör vara inom 3 % av märkvärdet. RNAs-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning måste användas när så specificeras för att undvika korskontamination mellan prov och amplicon. ** Om det inte finns någon datastation med programmet AMPLILINK kopplad till COBAS AMPLICOR analysator, måste det finnas en separat skrivare ansluten till COBAS AMPLICOR analysator. 14/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 Provtagning, transport och förvaring OBS! Provtagning Hantera alla prover och kontroller som om de kan överföra infektiösa material. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, är endast avsedd för användning med serum- och plasmaprov. Blod bör samlas in i serumprovtagningsrör eller i sterila rör med EDTA (lavendelfärgad topp) som antikoagulant. Prov som antikoagulerats med heparin är inte lämpliga för denna analys. Förvara helblod vid 2-25 C i högst 6 timmar. Separera serum eller plasma från helblod inom 6 timmar från provtagningen genom centrifugering vid 1500 x g i 20 minuter vid rumstemperatur. Överför serum eller plasma till sterilt polypropylenrör. Provtransport Provförvaring Vid transport av helblod, serum eller plasma måste alla gällande lagar och förordningar beaktas vad gäller transport av etiologiska agens 23. Helblod måste transporteras vid 2-25 C och behandlas inom 6 timmar från provtagningen. Serum och plasma måste transporteras vid 2-8 C eller transporteras fruset vid minst 70 C. Serum- och plasmaprov kan förvaras vid 2-8 C i upp till 72 timmar eller frysta i minst 70 C. Vi rekommenderar att prov förvaras i 750-800 μl alikvoter i sterila, 1,5 ml polypropylenrör med skruvlock (t.ex. Sarstedt 72.692.005). Serum- och plasmaprov kan frysas och tinas upp två gånger. Bruksanvisning OBS! OBS! OBS! OBS! Behandlingsstorlek För en detaljerad bruksanvisning hänvisas till Användarhandböckerna för COBAS AmpliPrep instrument och COBAS AMPLICOR-analysator. Alla amplifierings- och detektionsreagenser ska ha rumstemperatur före användning. Extraktionsreagenser ska tas fram från förvaring i 2-8 C och placeras i COBAS AmpliPrep-instrumentet minst 30 minuter innan det första provet ska bearbetas. Serum- och plasmaprover måste vara rumstempererade innan de används. Använd pipetter med aerosolbarriär eller spetsar med positiv undanträngning där detta specificeras. Stor försiktighet krävs för att undvika kontamination. Varje sats innehåller tillräckligt med reagens för åtta 12-testbehandlingar, vilka kan utföras samtidigt eller i upp till sex separata instrumentcykler. Minst ett replikat vardera för COBAS AmpliPrep negativ kontroll och HCV positiv kontroll, version 2.0, måste inkluderas i varje testbehandling av upp till 24 prover och kontroller (se avsnitt Kvalitetskontroll ). Amplifieringsreagens förpackas i 12-test flaskor för engångsbruk. Prover och kontroller bör behandlas i satser som är multipler av 12 för bästa möjliga effektivitet vad gäller reagensutnyttjande. 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 15/48

Arbetsflöde OBS! COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0, kan fullgöras inom en eller två dagar. Om analysen inte fullgörs inom en arbetsdag skall du följa anvisningarna i Prov- och kontrollpreparation och Omvänd transkription, amplifiering och detektion i ordningsföljd. Analysen kan fullgöras på 2 dagar; arbetsflödet för behandlade prover och kontrollhantering är då följande: Behandlade prover och kontroller kan förbli på COBAS AmpliPrep instrument över natten i upp till 20 timmar. De kan också avlägsnas från COBAS AmpliPrep instrument och förvaras vid 2-8 C i upp till 7 dagar i utmatningsrören. Prov- och kontrollpreparation Behandlade prover och kontroller som avlägsnats från COBAS AmpliPrep instrument dag 1 och förvaras vid 2-8 C i upp till 7 dagar: För att fullgöra prov- och kontrollbehandling dag 1 och omvänd transkription, amplifiering och detektion dag 2, skall du fullgöra COBAS AmpliPrep instrumentinställning (del A) och COBAS AmpliPrep instrumentladdning och -drift (del B); och utföra steg 1 och 2 i Hantering av behandlade prover och kontroller (del D) dag 1, och förvara de behandlade proverna och kontrollerna som anges i Prov- och kontrollpreparation (del D, steg 1). Börja dag 1 med Reagenspreparation (del C), värm upp de behandlade proverna och kontrollerna vid rumstemperatur och fortsätt med Hantering av behandlade prover och kontroller (del D, steg 3) genom Omvänd transkription, amplifiering och detektion. Behandlade prover och kontroller som hållits på COBAS AmpliPrep instrument över natten med borttagning dag 2: För att fullgöra prov- och kontrollbehandling dag 1 och omvänd transkription, amplifiering och detektion dag 2, skall du fullgöra COBAS AmpliPrep instrumentinställning (del A) och COBAS AmpliPrep instrumentladdning och -drift (del B). Dag 2 skall du börja med Reagenspreparation (del C), och fortsätta med Hantering av behandlade prover och kontroller (del D) t.o.m. Omvänd transkription, amplifiering och detektion. OBS! Del A: Du hänvisas till Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrument för en detaljerad beskrivning av instrumentets användning. COBAS AmpliPrep instrumentinställning Utförs inom: Området för föramplifiering, prov och kontrollpreparation A1. Slå på COBAS AmpliPrep instrument (ON). OBS! COBAS AmpliPrep instrument kommer att prima systemet automatiskt när det slås på. A2. Slå på datastationen för programvaran AMPLILINK (ON). Preparera datastationen på följande sätt: a. Logga in på Windows NT. b. Dubbelklicka på AMPLILINKs programvaruikon. c. Logga in på programvaran AMPLILINK genom att skriva in ditt användar-id och ditt lösenord. 16/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 A3. Kontrollera, med hjälp av skärmen Status, hur mycket systemtvättreagens (PWR) som finns tillgängligt och byt ut vid behov. A4. Utför allt underhåll som listas under fliken Due enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. A5. Om du använder frysta prover skall de tinas i rumstemperatur. A6. Bestäm antalet AmpliPrep-reagenskassetter, provbehandlingsenheter (SPUenheter), provrör (S-rör) och K-spetsar som behövs. En SPU, ett inmatnings- S-rör, en K-spets och ett utmatnings-s-rör behövs för varje prov eller kontroll. A7. Placera två HCV CS1, v2.0 på reagenskassetten. Placera två HCV CS2, v2.0 och en HCV CS3, v2.0 på separata reagenskassetten. A8. Ladda reagenskassetten med HCV CS1, v2.0, i kassettposition A på COBAS AmpliPrep instrument enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. A9. Ladda reagenskassetten med HCV CS2, v2.0 och HCV CS3, v2.0 i kassettposition B, C, D eller E på COBAS AmpliPrep instrument enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. A10. Placera SPU-enheterna i SPU-kassett och ladda kassetten (kassetterna) på COBAS AmpliPrep instrument enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. A11. Ladda lämpligt antal fulla kassetter med utmatningsrör på COBAS AmpliPrep instrument enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. A12. Ladda lämpligt antal (ett eller flera) fulla K-spetskassetter i kassettposition M, N, O eller P på COBAS AmpliPrep instrument enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. A13. Fäst ett streckkodsetikettsklips vid varje provkassettposition där ett prov eller en kontroll (S-rör) skall placeras. Placera ett inmatnings-s-rör i varje position som försetts med klämma för streckkodsetikett. A14. Ladda provkassetten(-erna) i stativposition F, G eller H på COBAS AmpliPrep instrument och skriv ut ett arbetsblad enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. Tilldela och notera positionerna som skall användas för kontroller och prover på arbetsbladet. A15. Avlägsna provkassett(erna) från COBAS AmpliPrep instrument och flytta kassetterna till ett område som utsetts till föramplifiering Prov- och kontrollpreparation för tillsats av prover och kontroller. 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 17/48

Del B: Laddning och drift av COBAS AmpliPrep instrument Utförs inom: Området för föramplifiering, prov och kontrollpreparation B1. Virvla varje prov och kontroll [CAP ( ) C och HCV (+) C, v2.0] i 3 till 5 sekunder. Sedan ska varje prov och kontroll centrifugeras en kort stund så att vätska ansamlas i rörets botten. Undvik att kontaminera handskarna när du handhar prover och kontroller. B2. Överför ca 700 μl, men inte mer än 1,1 ml, av varje prov och kontroll [CAP ( ) C och HCV (+) C, v2.0] till ett lämpligt S-rör, som försetts med streckkodsetikett, m.h.a. en mikropipett med RNAs-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Undvik överföring av partiklar och/eller fibrintromber från det ursprungliga provet till inmatnings-s-röret. Prover och kontroller bör överföras till rörpositioner som de blivit tilldelade och som noterats på arbetsbladet i steg A14. B3. Ladda provstativet(n) med prover och kontroller i stativposition F, G eller H på COBAS AmpliPrep instrument enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. B4. Använd datastationen för programvaran AMPLILINK för att skapa en provorder under fliken Sample och skriv in lotnummer och utgångsdatum för kontrollsatsen under fliken Quality Control enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. B5. Starta COBAS AmpliPrep instrument med hjälp av AMPLILINKprogramvaran enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. Prov- och kontrollbehandling utförs automatiskt av COBAS AmpliPrep instrument. B6. Innan du lämnar prov- och kontrollpreparationsområdet skall du vidta följande försiktighetsåtgärder för att undvika kontamination Rengör grundligt och desinficera alla arbetsytor som använts under prov- och kontrollöverföringen med en färsk 0,5-procentig natriumhypokloritlösning i avjoniserat eller destillerat vatten. Tvätta händerna. Byt handskar. Byt laboratorierock. Del C: Reagenspreparation Utförs inom: Föramplifiering Reagenspreparationsområde OBS! Reagenspreparation (del C) utförs på andra testdagen om det rör sig om en 2-dagarstest. C1. Bestäm det antal A-ringar som kommer att behövas för prov- och kontrolltestning. Sätt A-ringen(arna) i A-ringshållaren(arna). 18/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 C2. Förbered arbets-master mix (Working Master Mix) genom att lägga till 100 μl HCV Mn 2+, v2.0, i en ampullflaska HCV MMX, v2.0. Det är inte nödvändigt att mäta master mix-volymen. Lägg till 100 μl HCV Mn 2+, v2.0, till hela ampullflaskan HCV MMX, v2.0. Tillslut röret och blanda ordentligt genom att vända röret upp och ned 10-15 gånger. Virvla inte Arbets-master mixen. Ljusröd färg i HCV Mn 2+, v2.0 används för visuell bekräftelse att HCV Mn 2+, v2.0 har lagts till HCV MMX, v2.0. Släng resten av HCV Mn 2+, v2.0. Arbets-master mixen måste förvaras vid 2-8 C och användas inom 4 timmar efter preparationen. C3. Tillsätt 50 μl Arbets-master mix i varje A-rör med hjälp av en repeterpipett eller en pipett med aerosolbarriär eller spets med positiv förskjutning. A-röret(-rören) ska inte tillslutas nu. C4. Placera en eller flera A-ringar med arbets-master mix i en förseglingsbar plastpåse och tillslut påsen ordentligt. Flytta A-ringen(-ringarna) till området för föramplifiering prov- och kontrollpreparation. Förvara A-ringen(-ringarna) med arbets-master mix vid 2-8 C i området för föramplifiering prov- och kontrollpreparation tills prov- och kontrollpreparationen på COBAS AmpliPrep instrument är fullgjord. Arbets-master mixen är stabil i 4 timmar vid 2-8 C i A-rör som förseglats i plastpåse. Del D: Hantering av behandlade prover och kontroller Utförs inom: Område för föramplifiering, prov och kontrollpreparation OBS! Behandlade prover och kontroller får förbli på COBAS AmpliPrep instrument i upp till 20 timmar om det rör sig om en två dagarsanalys. D1. När prov- och kontrollpreparationsbehandlingen har fullgjorts på COBAS AmpliPrep instrumentet, ska provkassetten(-erna) avlägsnas med de behandlade proverna och kontrollerna. När de behandlade proverna och kontrollerna har avlägsnats från COBAS AmpliPrep instrument kan de förvaras i utmatningsrören vid 2-8 C i upp till 7 dagar. OBS! Håll utmatnings-s-rören och streckkodsetikettsklämmorna samman i provkassetten. Separera inget S-rör från klämman, utom vid transport av behandlat prov eller behandlad kontroll till ett A-rör. D2. När proven har avlägsnats från COBAS AmpliPrep instrument, utförs följande: a. Kontrollera om det finns flaggor eller felmeddelanden under fliken Sample enligt beskrivningen i Användarhandboken för COBAS AmpliPrep instrumentet. Prover med flaggor och kommentarer tolkas enligt följande: 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 19/48

Flagga Anmärkning Åtgärd Volymen som detekterades i S-röret var antingen för hög eller för låg. Provet behandlades inte och inmatnings-s-röret (som anges av ett inmatningsrör med genomskinligt lock) S SpecimenInputMissing returnerades till provkassetten. Amplifiera inte icke-behandlat prov. Åtgärda på nytt problemet med provbehandling om provet var på COBAS AmpliPrep instrument i mindre än 3 timmar. Om mer än 3 timmar har förflutit, behandla en annan alikvot av det ursprungliga provet. Otillräcklig reagensvolym detekterades. Amplifiera inte ett prov med en R -flagga. För behandlat prov (anges av ett ICIQSReagent Missing utmatningsrör med grått lock), behandla en annan alikvot av LysisReagentMissing det ursprungliga provet. För icke-behandlat prov (som anges av R ProbeReagentMissing ett inmatningsrör med genomskinligt lock), behandla på nytt SpecimenDiluentMissing om provet var på COBAS AmpliPrep instrument i mindre än 3 timmar. Om mer än 3 timmar, behandla en annan alikvot av det ursprungliga provet. InstrumentTempOutOfRange Instrument- eller inkubatortemperaturer utanför godkänd ReagentTempOutOfRange variationsvidd. Amplifiera inte ett prov med en I -flagga. I Incubation60OutOfRange Kontakta din lokala Roche-representant. Behandla en annan Incubations37OutOfRange alikvot från det ursprungliga provet med nya reagenser. IncubationTargetReleaseOutOfRange Testsatsen är utanför utgångsdatumsintervallet. Fortsätt inte E TestKitExpired run. med behandling. Byt ut satsen vars utgångsdatum överskridits före provbehandlingen. b. Jämför de behandlade provernas utmatningsrör med utmatningsrören för de behandlade kontrollerna: Behandlade prover och kontroller bör ha jämförbara utmatningsrörsvolymer. Behandlade prover och kontroller bör ha jämförbara kulkoncentrationer i utmatningsrören. Behandlade prover vars volym- och kulkoncentration är jämförbara med kontrollen kan fortsätta till amplifiering. Behandlade prover och kontroller med låg utmatningsvolym eller reducerad kulkoncentration måste behandlas på nytt på COBAS AmpliPrep instrument. Om utmatningsvolymen är låg eller kulkoncentrationen reducerad även efter det att ett prov har behandlats på nytt, skall du ta ett nytt prov från patienten och upprepa testet. OBS! Om de behandlade proverna och kontrollerna förvarades vid 2-8º C före amplifiering skall de värmas upp till rumstemperatur under minst 10 minuter innan man fortsätter till steg D3. D3. Virvla utmatnings-s-röret som innehåller det behandlade provet eller den behandlade kontrollen i ca 5 sekunder för att resuspendera de magnetiska partiklarna, som innehåller bundet RNA, innan materialet läggs till A-röret. 20/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0

HCV, v2.0 D4. Med hjälp av en pipett med aerosolbarriär eller spets med positiv förskjutning, lägger du till 50 μl av det grundligt blandade provet eller den behandlade kontrollen till lämpligt A-rör innehållande arbets-master mix på följande sätt: placera pipettspetsen som innehåller behandlat prov eller behandlad kontroll ungefär halvvägs in i arbets-master mixen i A-röret och stöt ut lösningen genom att trycka fram kolven till sitt första stoppläge med tillräcklig kraft så att lösningarna blandas. Aspirera tillbaka lösningen in i spetsen. Spruta ut lösningen genom att trycka kolven fram till sitt andra stoppläge. Sätt på locket på A-röret. D5. Upprepa steg D3 och D4 för varje behandlat prov och varje behandlad kontrollenhet tills alla har överförts till A-rör. Använd ny spets för varje behandlat prov eller behandlad kontroll. D6. Notera på A-ringsdiagrammet de behandlade provens och kontrollernas positioner i A-ringen(-ringarna). Amplifieringen måste startas inom 45 minuter efter det att de behandlade proverna och kontrollerna har lagts till A-rören som innehåller arbets-master mix. Flytta A-ringarna som innehåller Arbetshuvudblandning och de behandlade proverna och kontrollerna till amplifierings-/detektionsområdet. OBS! Återstående behandlade prover eller behandlade kontroller kan förvaras vid 2-8 C i upp till 7 dagar från preparationsdatumet. 10/2005, Revision 2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 21/48

Omvänd transkription, amplifiering och detektion OBS! Del E: För att amplifiera tidigare behandlade prover och kontroller, skall stegen i avsnittet Reagenspreparation (del C) utföras först. Värm upp tidigare kylda behandlade prover och kontroller till rumstemperatur under minst 10 minuter och fortsätt med Hantering av behandlade prover och kontroller, del D, steg 3. COBAS AMPLICOR-Analysatorinställning Utförs inom: Område för efteramplifiering, amplifiering och detektion. E1. Underhåll av instrument utförs dagligen enligt COBAS AMPLICOR analyzer Användarhandbok i vilket det det ingår att: Torka av initieringsstaven med en luddfri, fuktig duk och se till att den är torr. Torka av D-koppens hanteringsspets med en luddfri, fuktig duk och se till att den är torr. Kontrollera tvättbuffertreservoaren och fyll på vid behov. Preparera arbets-tvättbuffert (1X) enligt följande. Undersök WB och värm vid behov i 30-37 C för att åter lösa upp eventuell fällning. Lägg till 1 volym WB till 9 volymer destillerat eller avjoniserat vatten. Blanda väl. Håll alltid minst 3-4 liter arbetstvättbuffert (1X) i systemets tvättbuffertreservoar. Töm avfallsbehållaren. Prima systemet. Kontrollera sprutor och slangar under primningen. Kontrollera överföringsspetsen under primningen. E2. Före varje behandling: Byt handskar. Kontrollera avfallsbehållaren och töm vid behov. Kontrollera tvättbuffertsreservoaren och fyll på vid behov. Byt ut använda D-koppkassetter. Prima systemet. Del F: Laddning och drift av COBAS AMPLICOR analysator Utförs inom: Område för efteramplifiering, amplifiering och detektion. F1. Undersök reagenskvantiteten på COBAS AMPLICOR analysator. Preparera tillräckligt med reagenskassetter för att fullgöra arbetsbördan. F2. Blanda CX PS1, v2.0 ordentligt genom virvling. Lägg till 2,5 ml CX PS1, v2.0 till en CX4, v2.0 kassett. Placera kassetten på en testspecifik reagenskassett. Släng den använda CX PS1, v2.0 flaskan. Registrera datumet för reagenspreparationen på CX4, v2.0 kassetten. 22/48 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 10/2005, Revision 2.0