KORTSVARSFRÅGOR (brief answer)

KORTSVARSFRÅGOR (brief answer) 1. Vilka parametrar påverkar kristallisationsprocessen. Kortfattad diskussion. (2 p) (SVAR: PROTEINKONCENTRATION; TEMPERATUR; ph; SALTHALT; KONCENTRATION AV KRISTALLISATIONSMEDEL (t ex ammoniumsulfat)) 2. Du har överuttryckt en proteindomän som ingår i ett protein med flera domäner, men tyvärr är den enskilda domänen inte vattenlöslig. Man vet att en del av domänen ingår i ett β-flak som i det intakta proteinet binder till en annan domän, och man vet att fenylalaninen i sekvensen nedan, som ingår i β-flaket, är i direkt kontakt med denna andra domän: Ala Phe Val Ile Gly Val Ala Leu Vilken/vilka mutation(er) skulle man kunna introducera i denna sekvens för att förbättra domänens löslighet? Motivera ditt svar. (2 p) (SVAR:MUTERA VARANNAN AMINOSYRA (INKLUDERANDE PHE) TILL EN POLÄR I ETT β-flak ÄR VARANNAN AMINOSYRA UTÅT (OCH DE ANDRA INÅT ) SÅ OM VI BYTER HYDROFOBA MOT HYDROFILA PÅ DET SOM NU ÄR UTSIDAN BÖR LÖSLIGHETEN BLI BÄTTRE) 1

3. När kan man använda homologimodellering, och hur går det till i huvuddrag? (4 p) (SVAR: HAR SEKVENS OCH VILL HA 3D-STRUKTUR; HITTA HOMOLOGT PROTEIN MED KÄND STRUKTUR; SEKVENSALIGMENT; ÖVERFÖR KOORDINATER TILL MIN SEKVENS FRÅN KÄNDA STRUKTUREN DÄR DET PASSAR; BYGG LOOPAR SOM SAKNAS, T EX FRÅN DATABAS ÖVER LOOPAR; BYGG SIDOKEDJOR SOM SAKNAS; FÖRFINA MODELLEN; UTVÄRDERA MODELLEN) 4. Vi känner bara till ett litet antal 3D strukturer för membranbundna proteiner. Varför är det så? Vilka metoder kan man använda för strukturbestämning av membranproteiner. (2 p) (SVAR: MEMBRANPROTEINER ÄR HYDROFOBA OCH ALLTSÅ INTE VATTENLÖSLIGA, NMR OCH RÖNTGENKRISTALLOGRAFI ÄR DÄRFÖR SVÅRA. PROTEINERNA KAN IBLAND GÖRAS VATTENLÖSLIGA MHA DETERGENTER; DET HAR HITTILSS VARIT SVÅRT ATT ÖVERUTTRYCKA MEMBRANPROTEINER; EM ÄR BRA FÖR MEMBRANPROTEINER SOM KAN BILDA 2D-KRISTALLER, VILKA KAN ANVÄNDAS I EM) 2

5. Nedanstående figur är en schematisk bild av en del av ett komplex mellan det genreglerande proteinet Zif268 och DNA. Vilken funktion har den avbildade aspartaten? Motivera kortfattat. (3 p) (SVAR: SEVENSSPECIFIK IGENKÄNNING; ASP SIDOKEDJAN VÄTEBINDER TILL EN BAS) H Zif268 Zif268 C H N C O N O P P 3

6. Definiera följande begrepp (4 p) a. Konstitutionell kromosomavvikelse b. Förvärvad kromosomavvikelse c. Numerisk kromosomavvikelse d. Strukturell kromosomavvikelse Svar: a. Finns vid befruktningen, finns i kroppens alla celler b. Uppkommer senare i livet finns endast i en del av kroppens celler t ex cancer c. Förändringar i ploidi graden ex haploidi =n, triploidi =3n, aneuploidi ex trisomi 2n+1 d. Ombyggnad av kromosomer. Ex deletioner, Inversioner, Robertsonska translokationer, reciproka translokationer 7. Vad är ett mikrodeletionssyndrom? Nämn ett exempel. Hur diagnostiseras dessa lättast? (3 p) Svar: a) En förlust av genetiskt material som är så liten att den är svår eller omöjlig att se cytogenetiskt (ur molekylärgenetisk synvinkel är de dock oftast stora och involverar vanligen flera gener). b) CATCH22/ DiGeorge, Williams, Prader-Willi, Angelman, mfl c) FISH 4

8. Hur vet man om en s.k. vanlig sjukdom har en genetisk komponent? (nämn minst 2 faktorer) (2 p) Svar: Ansamling av sjuka i familjer Ökad relativ risk i familjer; RR= upprepningsrisken i familjen/risken i population Heritabilitet (dataanalys som kan räkna ut om gener spelar en roll i sjukdomsuppkomst) Tvillingstudier (där man jämför hur ofta monozygota tvillingar har samma sjukdom och hur ofta bara en av dem är sjuk. I det första fallet är genetiska faktorer viktiga och i det senare fallet är miljöfaktorer viktigare eftersom genuppsättningen hos monozygota tvillingar är identisk) 9. En kvinna vars två yngre bröder haft Duchennes muskeldystrofi väntar sitt första barn. Den ena av bröderna avled i 20-årsålder, men den yngre är ännu i livet. A) Hur stor är risken att det väntade barnet får sjukdomen? B) Vilka är möjligheterna till genetisk diagnostik? (2 p) Svar: A) 1/2 (risken att probanden bär anlaget) x 1/2 (risken att avkomman ärver den sjuka X-kromosomen) x 1/2 (risk att barnet är en pojke) = 1/8 (2p) B) Genetisk diagnostik med PCR kan påvisa deletioner i dystrofingenen i ca 70% av alla sjuka pojkar med DMD. Om en sådan mutation kan påvisas hos den sjuke pojken kan anlagsbärartest med FISH erbjudas kvinnan. Om hon är anlagsbärare kan också fosterdiagnostik utföras om hon blir gravid och fostret visats vara en pojke. (2p) 5

10. Lenas bror avled i späd ålder i en autosomalt recessiv sjukdom. I Lasses släkt har ingen haft denna sjukdom. Lasse och Lena är inte släkt. Sjukdomens incidens i befolkningen är 1/40 000. Varken prenatal diagnostik eller bärar diagnostik är möjlig. a) Hur stor är risken att Lasse respektive Lena är anlagsbärare? b) Hur stor är risken att parets första barn får sjukdomen? ( 3 p) Svar: Lena risk 2/3, Lars risk 1/100 (hur man kommit fram till detta måste redovisas), barnets risk: 2/3 x 1/100 x 1/4 = 1/600 11. Du gör en BLAST-sökning med protein X mot GenPept databasen. Du får upp två träffar: protein Y och Z. Protein Y har en expect (E) value på 0 när den jämförs med protein X. Protein Z har en expect value på 1 när den jämförs med protein X. Vilket av följande påståenden är korrekt? (1 p) A. Både Y och Z är signifikanta träffar (dvs homologer till X). B. Varken Y eller Z är signifikanta träffar. C. Endast Y är signifikant. D. Endast Z är signifikant. (correct answer is C) 12. Hur uppstår paraloga gener? (1 p) (answer: genom DNA duplikationer) 13. Why can we be certain that yeast Sacharomyces cerevisiae has no homologues of the vertebrate nuclear receptor family? ( 1 p) Because the entire yeast genome sequence is known and homology search revealed the lack of any nuclear receptor-like protein coding sequences. 6

18. What "features" make C. elegans a good model system for molecular biology. (2 p) Small size, transparent, whole developent can be followed life under the microscope complete cell lineage, cell division pattern known all cells, neurons known complete nervous system wiring known fast reproductive cycle (3 days) large brood size (200-300 progeny) easy to maintain on agar plates with e. coli stocks can be frozen short life span (this is mainly useful for aging studies, otherwise perhaps not so useful) hermaphrodite and male sexes, hermaphrodite self-fertilizing, thus easy to maintain, easy to obtain isogenic strains. But still easy to do genetic crosses, since males available. complete sequence known (not so special anymore) 19. Which two major technologies exist to study the function of a gene (not its expression!) in C. elegans, when initially only the sequence is known. (1 p) RNAi, RNA interference Gene knock-outs generated by mutagenesis, identified by PCR. This can be either straight mutagenesis and identification by PCR. Or by using strains with transposons hopping around, identify the transposon insertion by PCR (or get transposon strains from the genome center) and then identify deletions when the transposon jumps out. 20. Describe at least two features that discriminate apoptosis from necrosis. Describe at least two biological processes where apoptosis is relevant for normal development to occur. (2 p) cell swelling due to injury, unscheduled (necrosis) versus cell shrinkage as part of a scheduled removal of the cell undergoing apoptosis (apoptosis) cell lysis due to cytoplasma membrane integrity loss (necrosis) versus break-up of cell into apoptotic bodies that keep the cytoplasma membrane intact (apoptosis) 7

organelles become dysfunctional early in the process (necrosis) versus late in the process (apoptosis) random DNA/chromosome/chromatin degradation (necrosis) versus ordered disintegration of DNA/chromosome/chromatin into nucleosomal fragments (apoptosis) 21. List at least three types of histon modifications and the enzymes carrying out these modifications. (3 p) phosphorylation, acetylation, methylation, ribosylation, ubiqutination 22. Name at least two discoveries that have been crucial for the development of molecular (DNA) cloning techniques. (1 p) tex: restriction enzymes, DNA ligase, reverse transcriptase, PCR 24. Explain why the human transcription factor X can function at the same target gene as an activator in one cell type but as an repressor in another cell type! (2 p) Cell-type specific composition of coactivators and corepressors 25. What is the general purpose of developing synthetic drugs for nuclear receptors. Give one example of specific medical relevance. (2 p) To modulate receptor activity (agonists to enhance, antagonists to inhibit) and thereby to prevent or treat disease conditions. Examples: Inhibition of estrogen receptors in breast cancer cells by using anti-estrogens (tamoxifen, raloxifen) Activation of glucocorticoid receptor in anti-inflammatory processes by using synthetic glucocorticoids 8

26. Describe some general features of transcriptional co-regulators and give one specific example for coactivators with chromatin-modifying activities. (3 p) enhance of inhibit the transcriptional activity of DNA-bound transcription factors do not directly bind to DNA directly interact with DNA-bound transcription factors function often in multi-protein complexes often larger, multidomain proteins Example: HAT (histone acetyltransferases) e.g. SRC1, p300/cbp, PCAF, GCN5 27. Nämn två fördelar med att använda tetracyklinreglerad genexpression i en cell i jämförelse med transient transfektion. Vilken bild beskriver vilket system TET-OFF respektive TET-ON? (2 p) all cells are transfected and thus express protein protein expression levels can be regulated by tetracyclin-dose cell-toxic effects of protein expression can be avoided 28. Describe (rita gärna) the three different type of plasmids which are components of a mammalian two-hybrid system. Explain what type of protein is expressed and for what reason - from each of these plasmids! (3 p) DNA-binding domain (e.g. GAL4, lexa) - protein X hybrid (bait) Activation domain (e.g. GAL4, VP16) protein Y hybrid (prey) Reporter plasmid (e.g. GAL4-responsive luciferase reporter) 29. När kan man tänka sig att peptiden SSNHQSSRLIELLSR binder till en nukleär receptor och varför? (1 p) När receptorn befinner sig i en aktiv konformation och har bundit en agonist (estrogen), då bildas en yta för LXXLL motiv som ofta finns i coaktivatorer. 9

30. Fluorescence cell imaging: Describe how FRAP works. (1 p) You bleach an area where the fluorescent protein is localized and then take time laps images to study the recovery of fluorescence. 31. Beskriv hur en vektor som används till att framställa knockout möss kan se ut. (1.5 p) SV. Den ska innehålla en positiv selektionsmarkör (vanligen neo) som flankeras av isogent DNA (c:a 5 kb på var sida) där homolog rekombination kan ske. Vektorn ska vara konstruerad så att en mutation som förstör en specifik gen skapas, t. ex en viktig exon tas bort eller ett stopp kodon i den kodande regionen bildas. Dessutom bör vektorn innehålla en negativ selektionsmarkör i ena ändan av konstruktionen för att hindra slumpvis integrering av konstruktet i genomet. 32. Name at least three different methods to study protein-protein interactions. (1.5 p) GST-pull-down two-hybrid assay co-immunoprecipitation SPR (surface plasmon resonance) / BIAcore FRET (fluorescense energy transfer) 10

BERÄTTARFRÅGOR (essay-type longer answer) 33. Western blot analysis and immunohistochemistry of many tissues and cell lines shows that protein X is exclusively expressed in the cytoplasm of the human breast cancer cell line MCF-7. Explain all experimental steps which are necessary to clone the cdna encoding protein X. (Note: The protein/cdna is novel and not available from other researchers or commercial suppliers, so you have to clone it yourself!) (6 p) Common steps: Isolate mrna from the MCF-7 cell line make cdna using reverse transcription Alternative A: generate a cdna expression library immunoscreen using antibody against protein X (expression cloning) isolate positive clones sequence the cdna inserts Alternative B: We assume the amino acid sequence of protein X is known (since we can predict all human proteins / open reading frames): BLAST search to obtain the corresponding cdna sequence encoding protein X Design of 5 and 3 PCR primers to amplify the full coding region (5 ATG-3 Stop codon) PCR using MCF-7 cdna and TAQ polymerase Cloning of the PCR-products into T-vectors (to propagate stable clones in a plasmid) Direct sequencing to confirm DNA sequence identity (absence of PCR-based mutations) 11

34. Beskriv kortfattat principerna för FRET (Förster Radiationless Energy Transfer / Fluorescence Resonance Energy Transfer) och ge minst två exempel på molekylär- eller cellbiologisk tillämpningar. (6 p) (SVAR: TVÅ KROMOFORER DÄR DEN ENAS (DONOR) EMISSION MATCHAR DEN ANDRAS (ACCEPTOR) ABSORPTION; EXCITATION AV DONOR I NÄRVARO AV ACCEPTOR GER FLUORESCENS FRÅN ACCEPTORN; BEROR PÅ AVSTÅNDET; SAMLOKALISERING ELLER KONFORMATIONSOMVANDLING) 12

5. (5 p) Du har transfekterat celler med tre olika plasmider som kodar för tre olika mutanter av en transkriptionsfaktor. Nu vill du ta reda på vilken mutant som har bäst transaktiveringsförmåga. För att detektera detta använder du luciferas som reportergen vars uttryck aktiveras av dina muterade transkriptionsfaktorer. Efter skörd av dina celler har du följande tre prover: Prov 1 = transfekterad med mutant 1 Prov 2 = transfekterad med mutant 2 Prov 3 = transfekterad med mutant 3 Med hjälp av Bradford metoden vill du bestämma proteinhalten i dina prover. (A) Rita med hjälp nedanstående data en standardkurva ur vilken du bestämmer total proteinmängd i dina prov. Din totala provvolym är 100 du har mätt absorbansen på 1 l resp. 10 l av varje prov. l och Proteinbestämning Abs 595 nm 13

Namn Personnummer Absorbans 595nM 0 g BSA 0 2 g BSA 200 4 g BSA 400 6 g BSA 600 8 g BSA 800 10 g BSA 1000 12 g BSA 1100 14 g BSA 1200 16 g BSA 1100 18 g BSA 1200 20 g BSA 1100 Absorbans 595nM Prov 1 1 l 500 Prov 2 1 l 200 Prov 3 1 l 800 Prov 1 10 l 1000 Prov 2 10 l 1100 Prov 3 10 l 1200 14

Namn Personnummer (B) Efter att du mätt luciferasaktiviteten på 10 data : l av ditt prov får du följande luciferasaktivitet Prov 1 2000 Prov 2 1000 Prov 3 400 Viken mutant har bäst transaktiveringsförmåga? SVAR: Rita en standardkurva. Använd data från 1 l provvolym som hamnar inom det linjära området för att beräkna proteinmängden i resp. prov. (2p) Proteinbestämning Abs 595nM 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 mg protein Abs 595 nm Prov 2 = 2µg/µl Prov 1 = 5µg/µl Prov 3 = 8µg/µl 1) SVAR: Total proteinmängd (1p) Prov 1 = 5 g/ l x 100 l = 500 g Prov 2 = 200 g Prov 3 = 800 g 2) SVAR: Mutant nr:2 har högst transaktiveringsförmåga 50 luciferasenheter/ g protein Luciferasvärderna skall normaliseras mot proteinhalten. 15

Namn Personnummer Proteinhalt i 10 l provvolym: (1p) Prov 1: 5 g/ l x10 l=50 g Prov 2: 20 g Prov 3: 80 g Luciferasaktivitet/ g protein skall beräknas (1p) Luciferasaktivitet/10 l prov Prov 1: 2000 Prov 1: 2000/50 g prot = 40 luc.akt/ g prot Prov 2: 1000 Prov 2: 1000/20 g prot = 50 luc.akt/ g prot Prov 3: 400 Prov 3: 400/80 g prot = 5 luc.akt/ g prot 16

Namn Personnummer 36. Choose to answer only ONE of the two following questions: 36 A.The transcription factor A2 is a ligand-dependent DNA binding protein the regulates gene expression by binding to A2 response elements in the 5`regulatory region of its target genes, such as TG1. Describe how you would design a ChIP (chromatin immunoprecipitation) assay to verify the recruitment of transcription factor A2 to the TG1 gene using immortalized human cells, and summarize the expected results. (6 p) The students should mention that they need an antibody to A2, and they must design PCR primers to amplify the TG1 gene promoter containing the A2 response element. They should also mention that the cells would be treated with ligand, cross-linked, sonicated, immunoprecipitated with anti A2 antibody. The sequences should be amplified by PCR and separated by agarose gels. An amplified band should be visible in the treatment lane but not in the time 0 or untreated lane. Bands should be visible all total samples. OR 36 B. Describe in detail how in vitro transcription assays works and the important components of the assay. (6 p) Answer: A DNA or chromatin template with binding sites for an activator and a promoter is incubated with an activator and appropriate cofactors (optional) to allow for factor binding. RNA polymerase II, GTFs (general transcription factors) and cofactors, either as recombinant purified factors or in HeLa nuclear extract, are added to allow for preinitiation complex formation and after further incubation rntps are added to allow for transcription initiation. RNA analysis can de done by using a G- less cassette or with primer extension assay. 17