UMEÅ UNIVERSITET 2011-01-11 Institutionen för molekylärbiologi RUT10 - Biomedicinsk vetenskap I MIKROBIOLOGISK LABORATIONSTEKNIK Målsättning Att introducera mikrobiologisk metodik för handhavande av renkulturer. Laborationen skall demonstrera sterilteknik för att: a) skydda en renkultur från kontaminering utifrån samt b) skydda omgivningen för mikroorganismer. Olika steriliseringsmetoder såsom termisk behandling, kemisk behandling, sterilfiltrering och UV-bestrålning kommer att jämföras och utvärderas. Vidare skall spädningsförfaranden och överföring av mikroorganismer från vätskekulturer till fast substrat, liksom bildning av encellskolonier demonstreras och tränas. Skillnader i temperaturkänslighet mellan vegetativa celler och sporer skall påvisas. Bakgrund Sterilitet definieras inom mikrobiologin som fullständig avsaknad av reproducerbart liv. Val av olika steriliseringsmetoder styrs av vad som behandlas och vad det behandlade ska användas till. Termisk behandling i värmeskåp eller autoklav ger sterilitet genom att proteiner, t.ex. enzymer, denatureras, vilket medför att bakteriecellen dör. Metoden är lämplig för glasvaror etc och för värmetåliga lösningar. Kemisk behandling medför oftast inte sterilitet, utan snarare desinfektion, dvs. minskat antal patogena mikroorganismer. Olika kemikalier påverkar viktiga komponenter i bakteriecellen som membraner (sprit, aceton etc.) och proteiner (jod, klor m.fl.). Om kemikalien tillförs t.ex. en lösning som ska desinficeras kommer lösningen att efter behandlingen fortfarande innehåller kemikalien. Metoden är alltså oftast inte lämplig för födoämnen eller mediciner, men desto mer användbar för sår- och annan ytbehandling. Sterilfiltrering är en metod att mekaniskt skilja bakterier och virus från en lösning med hjälp av filter med noggrant bestämda porstorlekar. Detta är en lämplig metod för värmekänsliga lösningar. Bestrålning, t.ex. med UV-ljus, som påverkar cellens DNA och ger vid viss dos tillräckligt stora skador för att leda till celldöd. Används för desinfektion av operationssalar och andra lokaler med stora krav på bakteriefri miljö.
Bakterier Escherichia coli, Bacillus subtilis, Serratia marcescens Materiel Övernattskultur av E. coli i 5 ml LB TYS-plattor 24 st 0,15 M steril NaCl 100 ml Sterila rör (15 ml) 1 ml pipetter, sterila 10 ml pipetter, sterila Petriskål 1 st Sterilfilter 1 st Rör med desinfektionsmedel 3-5 st Termometer 20-110 C Sterila eppendorfrör Plastplatinöser 1 förp. Spruta, 5 ml 1 st A. DEMONSTRATION AV NÅGRA STERILISERINGSMETODER 1) Enkel termisk behandling Försöket avser att visa hur bakteriers överlevnadsförmåga påverkas av inkubation vid höga temperaturer. En övernattskultur av E. coli utdelas. Ett utstryk av denna kultur (-tid 0) görs m.h.a en plastplatinös på en TYS-platta, vars undersida markerats med 7 streck (Fig 1). Ett eppendorfrör placeras i ett värmeblock, termostaterat vid 80 C, och förvärmes i 10 minuter. 0.5 ml av kulturen överföres till det förvärmda röret. Efter 30, 60, 90, 120, 180 och 240 sekunder i 80 C görs ett utstryk med plastplatinös på TYS-plattan. Försöket upprepas med den variationen att cellerna inkuberas i värmeblock vid 100 C. Kom ihåg att markera plattorna med gruppnummer, laborationsnummer och datum. Plattorna inkuberas upp- och nervända vid 37 C över natt. Notera på resultatbladet hur den termiska behandlingen påverkat tillväxten. 2
2) Kemisk behandling I detta experiment skall olika desinfektionsmedels inverkan på E. coli undersökas. En övernattskultur av E. coli utdelas. Koncentration (%) Grupp Desinfektionsmedel Rör A Rör B Rör C 1-12 Desivon 100 50 10 13-23 Handdisk 100 50 10 24-34 Etanol 100 50 10 Rör K: 0,1 ml av övernattskulturen späds med 0,9 ml steril 0,15 M NaCl (=kontrollen). Rör A-C: till tre sterila rör med 0,9 ml desinfektionsmedel av ovan nämnda koncentrationer sätts 0,1 ml av övernattskulturen. Efter 1, 3, 5, 10 och 15 minuters inkubation i rumstemperatur görs utstryk med en plastplatinös av respektive cellsuspensioner på TYS-plattor markerade A-C enligt exempel i Figur 2. Märk plattorna! Observera att ett utstryk från rör K (tid = 0) görs på samtliga plattor. Plattorna inkuberas upp- och nervända vid 37 C över natt. Notera i resultatbladet hur desinfektionsmedlet påverkat cellerna. 3) Sterilfiltrering 0,1 ml av övernattskulturen av E. coli spädes med 10 ml steril 0,15 M NaCl. 5 ml av den spädda kulturen filtreras genom ett sterilfilter. Filtratet samlas upp i sterilt rör. Med en plastplatinös görs ett utstryk av dels den ofiltrerade, dels den filtrerade cell-suspensionen på vardera halvan av en TYS-platta. Markera på plattan. Inkubera plattan vid 37 C över natt. Notera effekten av filtreringen på resultatbladet. 3
4) UV-bestrålning 0,1 ml av övernattskulturen av E. coli spädes med 10 ml steril 0,15 M NaCl och hälls i en steril petriskål. Locket tas av och skålen placeras på ett plattställ 18 cm från UV-lampan i ett UV-skåp (förvärmt 10 min). Efter 0, 30, 60, 90, 180 och 240 sekunders UV-bestrålning görs ett utstryk med en plastplatinös på en TYS-platta. Skydda ögonen mot UV-bestrålning! Inkubera plattan vid 37 C över natt. Notera effekten av bestrålningen på resultatbladet. B. SPORERS TEMPERATURRESISTENS Bakgrund Bakterier tillhörande familjen Bacillaceae har ett försvarssystem som utnyttjas när bakteriecellens miljö blir för näringsfattig eller på annat sätt ogästvänlig. Från en bakteriecell bildas då en spor, som när miljön förbättras kan gro till en vegetativ cell igen. Sporbildning hos bakterier är alltså inte någon förökningsmekanism som hos svamparna. En aktivt växande bakteriekultur innehåller till största delen vegetativt växande celler och endast ett litet antal sporer. Andelen sporer i population ökar kraftigt då kulturer övergår till stationär fas. Bakteriesporer har en mycket låg vattenhalt och ett till stor del ändrat innehåll av småmolekyler och makromolekyler jämfört med den vegetativa cellen. Denna ändrade sammansättning ger sporen andra egenskaper än cellen, den är t ex motståndskraftig mot strålning, uttorkning och värme. I detta experiment jämförs stationärfas-kulturer av dels en sporbildande bakterie, Bacilius subtilis, och dels en icke-sporbildare, Escherichia coli, för förmåga att överleva inkubation vid höga temperaturer. Utförande Från två utlämnade kulturer, som har vuxit 1 respektive minst 5 dygn i LB, av vardera B. subtilis och E. coli (totalt fyra kulturer om vardera 1 ml) görs en bestämning av antalet levande bakterier/ml (s. k. viable count VC). Gör en spädningsserie av varje kultur och sprid 0.1 ml från de två sista spädningarna, 105 och 106 gångers spädning, på en TYS-platta per spädning. Resterande 0,9 ml av de fyra utlämnade kulturerna inkuberas i 100 C under 20 min, dvs. rören sätts i värmeblocket vid 100 C. Sedan rören svalnat tas 0,1 ml ut från rören och sprids på 1 st TYS-platta per rör. Efter inkubering vid 37 C över natt avräknas plattorna och titern levande bakterier beräknas. Ange i resultatbladet om några bakterier överlevde kokningen och i så fall hur stor fraktion överlevande som erhölls. 4
C. KONTAMINERINGSUNDERSÖKNINGAR Platta nr 1 (1-2 plattor per kurs!) Lämna plattan med locket avtaget på bänken under 60 min. Följande försök ska utföras av varje laboratoriegrupp. Platta nr 2 Dela in plattan i två segment! Tag ett hårstrå från vardera laborant och lägg dem försiktigt på agarytan, ett i vardera segment och tryck fast dem mot agarytan med en steril tandpetare. Platta 3 Dela in plattan i två segment, ett segment per laborant! Fukta tummen med steril NaCl och tryck lätt mot agarytan före och efter handtvätt. Tag en steril tandpetare, peta under en nagel, i örat eller i näsan, tryck sedan tandpetaren lätt mot agarytan och tillsätt en droppe steril NaCl, så att materialet löses upp och sprides på agarytan. Inkubera plattorna över natt vid 37 C, sedan i 30 C eller i rumstemperatur för att få växt av bl a svampar. Kommentera och rita av resultatet på resultatbladet. D. ISOLERING AV BAKTERIEKLON Bakgrund När ett bakterieprov tas från t.ex. förorenat vatten, en patient på en vårdcentral eller potatissalladen på en restaurang innehåller det nästan alltid flera olika sorters bakterier. Kanske vill man se om badvattnet innehåller E. coli-bakterier eller kanske vill man se om den sjuke patienten har samma Salmonella-bakterier som man fann i potatissalladen? Ofta vill man separera de olika sorterna från varandra och få renkulturer för att se vilka olika bakterier provet innehåller. I det närmaste allt arbete med mikroorganismer utförs med renkulturer. I en renkultur förekommer endast en typ av bakterieceller. En renkultur fås genom att isolera en bakterieklon, dvs en population där samtliga celler härstammar från en enda bakterie. Bakteriekloner kan isoleras från en blandning av bakterieceller genom att späda bakteriesuspensionen och därefter göra ett utstryk på fast substrat. Varje celltyp ges då möjlighet att utvecklas till separata kolonier. Ofta görs ytterligare ett utstryk på en ny agarplatta för att kontrollera att den isolerade bakterieklonen är ren. Att isolera klonala stammar är även nödvändigt i genetiskt och molekylärbiologiskt arbete. Det är viktigt att välja ett medium som man vet att de bakterier man söker efter verkligen växer på. Man måste exv. använda olika typer av odlingsmedium om man tar provet från blodet på en patient respektive bottensediment från Bottenhavet. I detta experiment kommer du att separera två sorters bakterier, E. coli (vita kolonier) och S. marcenses (röda kolonier) från en blandkultur genom att göra ett encellsutstryk. Följande försök skall utföras av varje laborant. Materiel En blandkultur av två olika övernattskulturer med bakteriearterna: A: Escherichia coli och B: Serratia marcescens. Odlingsplattor: Rikt medium, t. ex. LAL eller blodagar, 1 per person. 5
Utförande Dag 1. Det är mycket viktigt att inga andra bakterier hamnar på plattan. Kom ihåg att fingrar, labbänk etc. är smutsiga. Se till att du har gjort i ordning allt och vet hur du ska göra innan du börjar. Plattan som skall strykas lägges på bordet upp och ner (locket nedåt och agarytan uppåt). Röret med celler hålls i vänster hand. Steril plastögla tas sterilt ur förpackningen. Fig. 1 För in öglan i röret och doppa ner den i suspensionen och ta upp lite bakteriesuspension med öglan (Fig. 1). Sätt på skruvlocket och ställ tillbaka röret i provrörsstället Tag skålen av den upp- och nervända plattan på sidorna med andra handens fingrar, lyft av och vänd så att agarytan pekar uppåt. Stryk med öglan fram och tillbaka i ena kanten av agarytan (Fig. 2). För varje stryk hamnar bakterierna glesare och glesare på plattan. Fig. 2 Släng plastöglan i en speciell burk, ta en NY ögla Från det första utstryket (1, fig 3), görs ett nytt utstryk (2) vinkelrätt mot det tidigare. Plastöglan slängs, NY ögla tas. Ett tredje utstryk görs från 2 (Fig. 3). Det sista utstryket kan väntas ge kolonier uppkomna ur enstaka celler. Skålen vänds neråt och sätts tillbaka på locket. Plastöglan slängs. Fig. 3 Inkubera plattan över natt vid 30 C. Plattan ställs upp- och nedvänd för att förhindra att eventuellt kondensvatten droppar ner på agarytan och där ger upphov till s.k. sekundärkolonier. 6
Dag 2. Plattan med encellsutstryket inspekteras och uppvisas för kursassistenten för godkännande. Två kolonityper ska kunna särskiljas. Ev. görs omstryk av de två kolonityperna efter anvisning av kursassistenten. OBS! Glöm inte namn, gruppnummer, försökets nummer samt datum på botten av alla petriskålar. 7
UMEÅ UNIVERSITET Kurs Institutionen för molekylärbiologi Termin/År Grupp nr Namn RESULTAT FRÅN ÖVNINGAR I STERILTEKNIK Steriliseringsmetoder Ange resultat som: kraftig växt (= kontroll) ++ svag växt + nästan ingen växt (+) ingen växt - Behandling Tillväxt Termisk 0" 30" 60" 90" 120" 180" 240" 80 C 100 C Kemisk Des.inf.medel konc K 1' 3' 5' 10' 15' Sterilfiltrering ej filtrerat filtrerat UV-bestrålning 0" 30" 60" 90" 180" 240" E. coli 1 dygn E.coli 5 dygn B. subtilis 1 dygn B. subtilis 5 dygn Sporers temperaturresistens VC (bakt/ml) Sporer/ml Sporuleringsfrekvens Kommentarer: 8