Beställningsinformation AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: Specimen Preparation Kit, ART: version 2.

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 HCV FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. Beställningsinformation AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131 AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Tests P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 US: 83127 COBAS AMPLICOR HCV DK 100 Tests P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Följande kit kan användas för detektion av den amplifierade HCV-internkontrollen med hjälp av AMPLICOR HCV amplifieringskit, version 2.0. Detektion av HCVinternkontroll är ett rekommenderat användaralternativ. COBAS AMPLICOR IC 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Controll Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 1/42 P/N: 03788261 190

Avsedd användning Testet COBAS AMPLICOR Hepatit C-virus (HCV), version 2.0 (v2.0), är ett kvalitativt in vitro-test för detektion av hepatit C-virus RNA i kliniska prover på COBAS AMPLICOR Analyzer. Förekomst av HCV RNA är ett tecken på pågående HCV-infektion hos patienter som visar kliniska och/eller biokemiska tecken på leversjukdom. I testet används reverse transcription av target RNA för att generera komplimentärt DNA (cdna), amplifiering av target cdna genom PCRteknik (Polymerase Chain Reaction), och nukleinsyrehybridisering för detektion av HCV RNA i humant serum eller plasma. Testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, ska inte användas vid screening av blod eller blodprodukter för förekomst av hepatit C-virus. Sammanfattning och förklaring av testet Hepatit C-virus betraktas som det huvudsakliga etiologiska agenset. Det ansvarar för 90 95% av fallen av post-transfusion icke-a- och icke-b-hepatit 1,2. HCV är ett enkelsträngat, positivt RNA-virus med en genom på cirka 10 000 nukleotider som kodar för 3000 aminosyror 1. Som blodburet virus kan HCV överföras via blod och blodprodukter. Förekomsten av HCV-infektion är hög hos patienter som får organtransplantat, blodtransfusioner eller koagulationsfaktorer, hos patienter med perkutan exponering via intravenöst drogmissbruk, samt hos patienter som genomgår njurdialys. Förekomsten av HCV-infektion, fastställd med immunserologi, ligger i intervallet mellan 0,6% i Kanada och 1,8% i USA 3. Förekomsten av anti-hcv-antikroppar hos patienter infekterade med HCV har lett till utarbetandet av immunserologiska test som är specifika för dessa antikroppar 4,5. Införandet av dessa test har redan minskat förekomsten av post-transfusionshepatit över hela världen. Ytterligare tester har utförts med RIBA (rekombinant immunoblot-analys) för en vidare utvärdering av prover som upprepade gånger är reaktiva i antikropps-screeninganalysen. Senare utvärderingar har visat att tolkningen av detta komplimentärt test beror på patientens riskstatus. Exempelvis bekräftas i en lågrisk-blodgivarpopulation bara 50% av RIBA-reaktiva prover med ett HCV RNA-test 6,7,8. Således är ett positivt RIBA-resultat inte en sann indikator på aktiv HCV-infektion eftersom tillfrisknade patienter kan förbli anti-hcv-positiva i flera år 5. Dessutom har indeterminanta komplimentärt testresultat iakttagits både hos personer som nyligen smittats och som befinner sig i serokonversionsfasen, liksom hos personer som är kroniskt HCV-smittade 9,10. Immunserologisk testning är ett mått på pågående och/eller tidigare HCV-infektion, men gör ingen åtskillnad mellan dem. Personer med akut HCV-infektion kanske inte heller klarar av att producera antikroppar mot HCV 11, vilket gör diagnos av pågående HCV-infektion omöjlig med immunserologiska metoder. Alternativt kan detektion av HCV RNA med nukleinsyretest ge bevis för pågående infektion. Med nukleinsyretest är det möjligt att detektera HCV-viremi före immunologisk serokonversion 12,13. Eftersom nukleinsyretest kan upptäcka HCV RNA direkt, d.v.s. oberoende av patientens immunologiska status, är ett nukleinsyrebaserat test värdefullt för detektion av HCV RNA hos patienter med nedsatt immunförsvar 8. 2/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Testprincip Testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, baseras på fem grundläggande processer: provextraktion, reverse transcription av target RNA för genererande av komplimentärt DNA (cdna) 14, PCR-amplifiering 14 av target cdna med hjälp av HCV-specifika komplimentärt primers, hybridisering av de amplifierade produkterna till oligonukleotidprober som är målspecifika, samt detektion av probbundna amplifierade produkter genom kolorimetrisk bestämning. Testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, möjliggör samtidig reverse transcription och PCR-amplifiering av HCV target och HCV-internkontroll target RNA. Master Mix-reagenset innehåller ett primerpar som är specifikt både för HCV och HCVinternkontroll RNA. Detektion av amplifierat DNA utförs med hjälp av målspecifika oligonukleotidprober som möjliggör oberoende identifiering av HCV-amplicon och HCV-internkontroll-amplicon. Internkontroll Extraktion Reverse transcription och PCR-amplifiering I enzymbaserade amplifieringsprocesser, t.ex. PCR, kan effektiviteten minskas av hämmare som kan förekomma i det kliniska provet. HCV-internkontrollen har lagts till i testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, så att bearbetade prover som innehåller ämnen som kan påverka PCR-amplifieringen kan påvisas. HCVinternkontrollen är ett RNA-transkript med likadana primerbindningsregioner som HCV-målsekvensen, en randomiserad intern sekvens med samma längd- och baskomposition som HCV-målsekvensen, och en unik probbindningsregion som särskiljer HCV-internkontroll från target-amplicon. Egenskaperna valdes ut för att garantera samma amplifiering av HCV-internkontrollen som av HCV target RNA. HCV RNA isoleras från serum eller plasma genom lysering av viruspartiklar med en kaotropisk agens följt av utfällning av RNA med alkohol. Sedan resuspenderas RNA i Specimen Diluent. HCV-internkontroll RNA tillsätts i varje prov med lyseringsreagens och fungerar som extraktions-, amplifieringsoch detektionskontroll för varje bearbetat prov. Val av target Urvalet av target RNA-sekvensen för HCV beror på identifieringen av regioner inom HCV-genomen som visar maximal konsekvens bland de olika HCVgenotyperna 15,16,17. Dessutom är ett riktigt urval av primers och prob mycket viktigt för att testet ska kunna detektera alla genotyper (se avsnittet Icke-klinisk egenskapsutvärdering, HCV-genotyp inklusivitetsstudie ). UTR (5'-untranslated region) av HCV-genomen har visat sig ha maximal RNA-sekvenskonservering bland kända HCV-genotyper 18,19. I testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, används primers KY78 och KY80 för att definiera en sekvens med 244 nukleotider inom den maximalt konserverade 5'-UTR för HCV-genomen 13. Infångningsprobsekvensen och primersekvenserna finns i de mest konserverade områdena inom 5'-UTR 18. Reverse transcription Reverse transcription- och amplifieringsreaktionerna utförs med det värmebeständiga rekombinanta enzymet Thermus thermophilus DNA-polymeras (rtth pol). Vid förekomst av mangan (Mn 2+ ) och vid lämpliga buffertförhållanden har rtth pol både reverse transkriptas- och DNA-polymerasaktivitet 14. Detta gör att såväl reverse transcription som PCR-amplifiering kan ske i samma reaktionsblandning. Bearbetade prover tillsätts till amplifieringsblandningen i amplifieringsrör (A-rör) i vilka såväl reverse transcription som PCR-amplifiering sker. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 3/42

Nedströms- eller antisensprimern (KY78) biotinyleras vid 5'-ändarna. Uppströmseller sensprimern (KY80) biotinyleras inte. Reaktionsblandningen värms så att nedströmsprimern kan binda specifikt till HCV target RNA och till HCVinternkontroll target RNA. Vid förekomst av Mn 2+ och överskott av deoxinukleosidtrifosfater (dntps), inklusive deoxiadenosin-, deoxiguanosin-, deoxicytidin- och deoxiuridin- (i stället för tymidin) trifosfater, förlänger rtth pol den bundna primern och bildar en DNA-sträng (cdna) som är komplementär till RNA target. Amplifiering av target Efter reverse transcription av HCV target och HCV-internkontroll RNA värms reaktionsblandningen så att RNA:cDNA-hybriden denatureras och primermålsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder uppströmsprimern (KY80) specifikt till cdna-strängen, rtth pol förlänger primern och en andra DNA-sträng syntetiseras. Detta slutför den första PCR-cykeln och ger en dubbelsträngad DNA-kopia av målregionen för HCV och HCV-internkontroll RNA. Reaktionsblandningen värms igen så att den bildade dubbelsträngade DNAkedjan separeras och primer-målsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder primers KY78 och KY80 till target DNA. rtth pol förlänger i närvaro av Mn 2+ och överskotts-dntp bundna primers längs målmallarna och producerar en 244-baspars, dubbelsträngad DNA-molekyl som kallas ett amplicon. COBAS AMPLICOR Analyzer upprepar automatiskt detta förfarande ett angivet antal cykler, varvid varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Det erforderliga antalet cykler förprogrammeras i COBAS AMPLICOR Analyzer. Amplifiering förekommer endast i regionen för HCV-genomen mellan primers. Hela genomen amplifieras inte. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från det kliniska provet kan göras med testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, genom användning av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzym identifierar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin 20, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA, men finns alltid i amplicon på grund av användningen av deoxiuridintrifosfat i stället för tymidintrifosfater som en av deoxinukleosidtrifosfaterna i Master Mix-reagenset. Följaktligen innehåller endast amplicon deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpEraseenzym före amplifiering av target DNA. AmpErase-enzym, som ingår i Master Mixreagenset, katalyserar klyvning av deoxiuridin-innehållande DNA vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocykelsteget vid alkaliskt ph för Master Mix, så bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzymet är inaktivt vid temperaturer över 55 C, d.v.s. genom alla termocykelsteg, och därför förstörs inte target amplicon. Efter amplifiering denatureras eventuellt återstående enzym genom tillsats av denatureringslösning, vilket förhindrar nedbrytning av target amplicon. AmpErase-enzym i testet COBAS AMPLICOR HCV, v2.0, har visat sig inaktivera minst 10 3 kopior av HCV-amplicon innehållande deoxiuridin per PCR. 4/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifiering tillsätter COBAS AMPLICOR Analyzer automatiskt denatureringslösning till A-rören för kemisk denaturering av HCV amplicon och HCV-internkontroll amplicon så att enkelsträngat DNA bildas. Portioner av denaturerat amplicon överförs sedan till detektionskoppar (D-koppar). En suspension av magnetpartiklar täckta med en oligonukleotidprob som är specifik för HCV (KY150) eller HCV-internkontroll (SK535) tillsätts till var och en av D-kopparna. Biotinmärkt HCV och HCV-internkontroll amplicon hybridiseras till de målspecifika oligonukleotidproberna som är bundna till magnetpartiklarna. Hybridiseringen av amplicon till den målspecifika proben ökar testets allmänna specificitet. Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen tvättar COBAS AMPLICOR Analyzer magnetpartiklarna i D-koppen så att obundet material avlägsnas och tillsätter sedan Avidin-Horseradish Peroxidase Conjugate. Avidin-Horseradish Peroxidase Conjugate binder till biotinmärkt amplicon som hybridiseras till de målspecifika (HCV eller internkontroll) oligonukleotidprober som är bundna till magnetpartiklarna. COBAS AMPLICOR Analyzer avlägsnar obundet konjugat genom att tvätta magnetpartiklarna och tillsätter sedan en substratlösning som innehåller väteperoxid och 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) till varje D-koppar. I närvaro av väteperoxid katalyserar partikelbundet Horseradish Peroxidase oxidation av TMB så att ett färgat komplex bildas, vars absorbans mäts av COBAS AMPLICOR Analyzer vid en våglängd på 660 nm. Reagenser AMPLICOR HCV HCV PREP 96 test P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV extraktionskit, version 2.0 HCV LYS, v2.0 (HCV lyseringsreagens, version 2.0) 8 x 6,9 ml Xn Tris-HCl-buffert 68% guanidintiocyanat 3% ditiotreitol < 1% glykogen + 68% (viktprocent) guanidintiocyanat Hälsoskadlig HCV DIL, v2.0 (HCV spädningsmedel, version 2.0) 8 x 4,8 ml Tris-HC1-buffert < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 5/42

HCV IC, v2.0 (HCV internkontroll, version 2.0) 8 x 0,1 ml < 0,001% icke smittbärande in vitro transkriberad RNA (mikrobiell) innehållande HCV-primerbindningsekvenser och en unik probbindningsregion < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid AMPLICOR HCV HCV CTL 8 set P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV kontrollkit, version 2.0 US: 83131 NHP [Negativ plasma (human)] 8 x 0,6 ml Human plasma, icke-reaktiv enligt FDA-licensierade test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24-antigen och HbsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA och HBV DNA som PCR-metoder inte kan detektera 0,1% ProClin 300 konserveringsmedel HCV ( ) C, v2.0 [HCV ( )-kontroll, version 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid HCV (+) C, v2.0 [HCV (+)-kontroll, version 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,001% icke smittbärande in vitro transkriberad RNA (mikrobiell) innehållande HCV-sekvenser < 0,005% poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid AMPLICOR HCV HCV AMP 96 test P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV amplifieringskit, version 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (HCV huvudblandning, version 2.0) 8 x 0,7 ml Bicine-buffert 16% DMSO Glycerol < 0,01% rtth DNA-polymeras (rtth pol, mikrobiell) Kaliumacetat < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% KY78 och KY80 primers (en är biotinylerad) < 0,01% AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiell) 0,05% natriumazid 6/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganlösning, version 2.0) 8 x 0,1 ml < 2% mangan Ättiksyra Amarant-färgämne 0,05% natriumazid COBAS AMPLICOR HCV DK 100 test P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR HCV detektionskit, version 2.0 CX PS1, v2.0 1 x 100 test (HCV probsuspension 1, version 2.0) MES-buffert < 0,4% suspension av Dynabeads (paramagnetiska partiklar) täckta med HCV-specifik oligonukleotid infångningsprob (KY150) 0,09% natriumazid CX4, v2.0 (HCV probsuspension 2, version 2.0) Natriumfosfatbuffert < 0,2% solubiliserande ämne 42,2% natriumtiocyanat Xn 42,2% (viktprocent) natriumhydroxid + 1 x 100 test Hälsoskadlig COBAS AMPLICOR DK 100 test P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR reagenskit för detektion US: 83276 DN4 (Denatureringslösning) Xi 1,6% natriumhydroxid EDTA Tymolblått + 1,6% (viktprocent) natriumhydroxid 1 x 100 test Irriterande CN4 (Avidin-HRP konjugat) 1 x 100 test Tris-HCl-buffert < 0,001% avidin-hrp konjugat Bovint serumalbumin (mammalie) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 konserveringsmedel 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/42

SB3 (Substrat A) Citratlösning 0,01% väteperoxid 0,1% ProClin 150 konserveringsmedel SB (Substrat B) 5 x 75 test 5 x 5 ml 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) 40% dimetylformamid (DMF) T 40% (viktprocent) dimetylformamid (DMF) Giftig R: 61-20/21-36 Kan ge fosterskador. Farligt vid inandning och hudkontakt. Irriterar ögonen. S: 53-45 Undvik exponering - Begär specialinstruktioner före användning. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. COBAS AMPLICOR CN4 200 test P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR konjugatdetektionsreagens US: 83305 CN4 (Avidin-HRP) 2 x 100 test Tris-HCl-buffert < 0,001% avidin-pepparrotsperoxidaskonjugat Bovint serumalbumin (mammalie) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 konserveringsmedel COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR tvättbuffert US: 83314 WB (10X tvättkoncentrat) 2 x 250 test < 2% fosfatbuffert < 9% natriumklorid EDTA < 2% detergent 0,5% ProClin 300 konserveringsmedel 8/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Varningar och säkerhetsåtgärder För in vitro-diagnostisk användning. Detta test är endast avsett att användas med humant serum eller plasma som samlats i EDTA- eller ACD-antikoagulantia. Heparin har visat sig hämma PCR och får inte användas med detta förfarande. Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagenser. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagenser. Undvik mikrobiell och ribonukleassmitta av reagenserna när portioner tas från reagensflaskor. Användning av sterila engångspipetter och RNase-fria pipettspetsar rekommenderas. Sammanför inte reagenser från olika lot eller från olika flaskor i samma lot. Kassera oanvända reagenser och avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Använd inte kit efter utgångsdatum. Kontakta närmaste Roche-kontor om du vill erhålla informationsblad om materialsäkerhet (MSDS). Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot post-amplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Pre-amplifieringsarbetena ska börja med reagensberedning och fortsätta till extraktion. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensberedning får inte användas för extraktion eller för pipettering eller bearbetning av amplifierat DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i post-amplifieringsområdet. Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 och i CLSI-dokument M29-A3 22. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5% natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. Obs! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25% natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5% natriumhypoklorit. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 9/42

VARNING: Detta kit innehåller en komponent (NHP) som härstammar från humant blod. Källmaterialet har testats med FDA-godkända tester och befunnits icke-reaktivt för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24 antigen och hepatit B ytantigen (HBsAg). Testning av negativ human plasma med PCRmetoder visade inte något detekterbart HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Det finns inga testmetoder som ger fullständig säkerhet för att produkter från humant blod inte kan överföra smitta. Allt material av humant ursprung ska därför anses som potentiellt smittsamt. NHP ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 och i CLSI-dokument M29-A3 22. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5% natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; HCV ( ) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 och CX PS1, v2.0 innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. Bär ögonskydd, laboratorierock och engångshandskar när du hanterar HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0; DN4, CN4, SB3, SB och Working Substrate (blandad SB3- och SB-reagens). Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagenser, späd med vatten innan spillet torkas upp. Undvik att SB eller Working Substrate kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Vid hudkontakt, tvätta genast med stora mängder vatten. SB och Working Substrate innehåller dimetylformamid som har rapporterats vara giftigt i höga orala doser och kan ge fosterskador. Undvik hudkontakt, inandning av rök och förtäring. Vid kontakt med huden, tvätta noga med tvål och vatten och kontakta omedelbart läkare. Se till att inte HCV LYS, v2.0, som innehåller guanidintiocyanat, eller CX4, v2.0, som innehåller natriumtiocyanat, kommer i kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel). Denna blandning kan bilda en mycket giftig gas. Rör med skruvkork ska användas vid prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prover. Rör med snäpplock får inte användas. 10/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Förvaring och hantering Frys inte reagenser. Förvara HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 och HCV IC, v2.0 i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser hållbara till det angivna utgångsdatumet. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. En fällning bildas i HCV LYS, v2.0, vid förvaring i 2 8 C. Värm i 25 37 C och blanda noga så att det utfällda materialet löses upp före användning. Värm HCV LYS, v2.0 i högst 30 minuter och blanda sedan noga tills kristallerna har lösts upp. Före användning ska varje flaska HCV LYS, v2.0, undersökas mot en vit bakgrund. Titta efter förekomst av en gul färg eller tecken på läckage. Använd inte en flaska om innehållet verkar gult eller det finns tecken på läckage. Kontakta din Roche-representant för utbyte. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Working Lysis Reagent (beredd genom tillsats av HCV IC, v2.0 till HCV LYS, v2.0) ska förvaras i rumstemperatur och användas inom 8 timmar efter beredning. Förvara HCV MMX, v2.0 och HCV Mn 2+, v2.0 i 2 8 C. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Working Master Mix (beredd genom tillsats av HCV Mn 2+, v2.0 till HCV MMX, v2.0) måste förvaras i 2 8 C och användas inom 4 timmar efter beredning. Förvara NHP, HCV ( ) C, v2.0 och HCV (+) C, v2.0 i 2 8 C. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. Förvara CX PS1, v2.0, och CX4, v2.0, i 2 8 C. Dessa reagenser är hållbara till det angivna utgångsdatumet. När CX PS1, v2.0, och CX4, v2.0, har blandats är Working Reagent hållbar i 30 dagar i 2 8 C. Working Reagent kan användas för högst sex instrumentcykler (12 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara DN4 i 2 25 C. DN4 är hållbart till det angivna utgångsdatumet. Efter att förpackningen öppnats är DN4 hållbart i 30 dagar vid förvaring i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. DN4 kan användas för högst sex instrumentcykler (12 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara CN4 i 2 8 C. CN4 är hållbart till det angivna utgångsdatumet. Efter att förpackningen öppnats är CN4 hållbart i 30 dagar vid förvaring i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. CN4 kan användas för högst sex instrumentcykler (12 timmar per cykel) och ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. Förvara SB3 och SB i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser hållbara till de angivna utgångsdatumen. Working Substrate ska beredas varje dag genom blandning av SB3 med SB. Working Substrate är hållbart i 16 timmar i COBAS AMPLICOR Analyzer. Utsätt inte SB3, SB eller Working Substrate för metaller, oxideringsmedel eller direkt ljus. Förvara WB i 2 30 C. WB är hållbart till det angivna utgångsdatumet. Undersök WB före spädning och värm vid behov i 30 37 C så att eventuell fällning löses upp. Working Wash Buffer (1X) som beretts genom spädning 1:10 av WB med destillerat eller avjoniserat vatten ska förvaras i 2 25 C i COBAS AMPLICOR tvättbuffertbehållare och är hållbar i 2 veckor från beredningdatum. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 11/42

Material som medföljer Förvara delvis använda detektionsreagenser i 2 8 C mellan instrumentkörningarna. Kontrollera utgångsdatum för Working Reagents innan de laddas i analysinstrumentet COBAS AMPLICOR. AMPLICOR HCV Specimen HCV PREP P/N: 21111086 123 Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 AMPLICOR HCV extraktionskit, version 2.0 US: 83126 HCV LYS, v2.0 (HCV lyseringsreagens, version 2.0) HCV DIL, v2.0 (HCV spädningsmedel, version 2.0) HCV IC, v2.0 (HCV internkontroll, version 2.0) AMPLICOR HCV HCV CTL P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV kontrollkit, version 2.0 US: 83131 NHP [Negativ plasma (human)] HCV ( ) C, v2.0 [HCV ( )-kontroll, version 2.0] HCV (+) C, v2.0 [HCV (+)-kontroll, version 2.0] AMPLICOR HCV HCV AMP P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV amplifieringskit, version 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (HCV huvudblandning, version 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganlösning, version 2.0) COBAS AMPLICOR HCV DK P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 COBAS AMPLICOR HCV detektionskit, version 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (HCV probsuspension 1, version 2.0) CX4, v2.0 (HCV probsuspension 2, version 2.0) 12/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus COBAS AMPLICOR DK P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR reagenskit för detektion US: 83276 DN4 (Denatureringslösning) CN4 (Avidin-HRP) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR konjugatdetektionsreagens US: 83305 CN4 (Avidin-HRP) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR tvättbuffert US: 83314 WB (10X-tvättkoncentrat) Material som behövs men som inte medföljer Pre-amplifiering reagensberedningsområde - COBAS AMPLICOR A-ring utrustad med 12 A-tubes - COBAS AMPLICOR A-ringhållare - Återförslutningsbar plastpåse - Eppendorf Multipette pipett med 1,25 ml Combitip behållare (steril, styckförpackad) - Pipetter (kapacitet 50 µl och 100 µl)* med RNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning - Engångshandskar, puderfria Pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområdet - 1,5 ml polypropylenrör med skruvkork, sterila, ej silikonbehandlade, koniska (Sarstedt 72.692.005 eller motsvarande)** - Rörrack (Sarstedt 93.1428 eller motsvarande) - 95-procentig etanol, reagenskvalitet för molekylärbiologi eller histologi (används nyspädd till 70% med destillerat eller avjoniserat vatten) - Isopropylalkohol, reagenskvalitet - Sterila transferpipetter med fin spets, RNase-fria - Sterila serologiska engångspipetter av polystyren (5 ml, 10 ml och 25 ml) - Pipetter (kapacitet 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl och 1 000 µl)* med RNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 13/42

- Mikrocentrifug (max. RCF 16000 x g, min. RCF 12500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller motsvarande - Vortexblandare - 60 C ± 2 C torkvärmeblock - Engångshandskar, puderfria Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde - COBAS AMPLICOR Analyzer och skrivare - Användarhandbok för COBAS AMPLICOR Analyzer Tillval: Programmet AMPLILINK Tillval: Datastation för programmet AMPLILINK, med skrivare Tillval: Användarhandbok till programmet AMPLILINK version 2.4- serien för användning med analysinstrumentet COBAS AMPLICOR (för användning med programmet AMPLILINK, v2.41) eller applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR (för användning med programmet AMPLILINK v3.2-serien) - COBAS AMPLICOR Hepatit C-virustest, v2.0, Metodmanual - Rack för D-koppar - Destillerat eller avjoniserat vatten - 5 ml serologiska pipetter - Engångshandskar, puderfria * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3% av angiven volym. RNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas då så anges för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon. ** Rör med skruvkork ska användas för prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prov och kontroller. Rör med snäpplock får inte användas. Provtagning, transport och förvaring av prover Obs! Provtagning Transport av prover Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. Testet COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus, v2.0, är endast avsett för serumeller plasmaprover. Blod ska tas i serumseparationsrören SST eller i sterila rör med EDTA (lila propp) eller ACD (gul propp) som antikoagulant. Prover som antikoagulerats med heparin är inte lämpliga för detta test. Förvara helblod i 2 25 C i högst 6 timmar. Separera serum eller plasma från helblod inom 6 timmar efter provtagning genom centrifugering vid 1500 x g i 20 minuter i rumstemperatur. Överför serum eller plasma till ett sterilt polypropylenrör. Vid transport av helblod, serum eller plasma ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas 23. Helblod ska transporteras i 2 25 C och bearbetas inom 6 timmar efter provtagning. Serum eller plasma kan transporteras i 2 8 C eller frysas i 70 C eller kallare, och måste bearbetas inom gränserna som anges nedan. 14/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Förvaring av prover Serum- eller plasmaprover kan förvaras i 2 8 C i upp till 72 timmar eller frysas i 70 C eller kallare. Vi rekommenderar att prover lagras i portioner om 250 300 µl i sterila 1,5 ml-polypropylenrör med skruvkork (t.ex. Sarstedt 72.692.105). Serumeller plasmaprover kan frysas och tinas högst två gånger. Bruksanvisning Obs! Obs! Obs! Obs! Obs! Omgångsstorlek Detaljerad information om användning, utskrift av resultat och tolkning av flaggor och kommentarer finns i (1) användarhandboken till analysinstrumentet COBAS AMPLICOR och (2) vid användning av programmet AMPLILINK, v2.41, i användarhandboken till programmet AMPLILINK version 2.4-serien för användning med analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller, vid användning av programmet AMPLILINK v3.2-serien, i applikationshandboken till programmet AMPLILINK version 3.2-serien för användning med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR. Samtliga reagenser ska ha rumstemperatur före användning. Inspektera alla reagenser visuellt innan testet påbörjas så att reagensvolymen är tillräcklig. Serum- och plasmaprover ska ha rumstemperatur före användning. Använd pipetter med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning om så anges. Var ytterst noga med att säkerställa selektiv amplifiering. Rör med skruvkork ska användas vid prov- och kontrollextraktion för att hindra stänk och möjlig överföring av smitta mellan prover och kontroller. Rör med snäpplock får inte användas. Ett kit innehåller reagens för åtta omgångar med 12 test, vilka kan utföras separat eller samtidigt. Minst ett replikat vardera av AMPLICOR HCV ( )-kontroll och AMPLICOR HCV (+)-kontroll måste ingå i varje testomgång (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Extraktions- och amplifieringsreagenserna är förpackade i engångsflaskor för 12 tester. HCV ( )- och HCV (+)-kontrollerna är förpackade i engångsflaskor. Reagenserna utnyttjas bäst om prover och kontroller bearbetas i grupper som är multiplar av 12. Arbetsflöde Testet COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus, v2.0, kan slutföras på en dag eller delas upp på två dagar. Följ anvisningarna i avsnitten Reagensberedning, Provoch kontrollextraktion samt Reverse transcription, Amplifiering och detektion i tur och ordning, om testet ska slutföras på en arbetsdag. Testet kan göras under 2 dagar genom att starta prov- och kontrollextraktion dag 1, följt av reagensberedning och reverse transcription, amplifiering och detektion dag 2 eller genom att starta prov- och kontrollextraktion samt reverse transcription och amplifiering dag 1 och detektion dag 2. Om prov- och kontrollextraktion ska utföras dag 1 och reverse transcription, amplifiering och detektion dag 2, ska först prov- och kontrollextraktion utföras (steg 1 till 15) och de bearbetade proverna och kontrollerna förvaras enligt anvisningarna i steg 15. Börja med reagensberedning dag 2 och tina sedan de bearbetade proverna och kontrollerna i rumstemperatur. Fortsätt med prov- och kontrollextraktion, steg 16, reverse transcription, amplifiering och detektion. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 15/42

Om prov- och kontrollextraktion samt reverse transcription och amplifiering ska utföras dag 1, fortsätter du med alla steg i reagensberedning samt provoch kontrollextraktion. Programmera analysinstrumentet COBAS AMPLICOR i parallelläge och slutför amplifieringsstegen. Förvara denaturerad amplicon över natten i 2 8 C och fortsätt med detektion dag 2. Reagensberedning Utförd i: Pre-amplifiering reagensberedningsområde 1. Fastställ det antal A-ringar som behövs för testning av patientprov och kontroller. Placera A-ringarna på A-ringhållarna. 2. Bered Working Master Mix genom att tillsätta 100 µl HCV Mn 2+, v2.0, till en flaska HCV MMX, v2.0. Det är inte nödvändigt att mäta volymen Master Mix. Tillsätt 100 µl HCV Mn 2+, v2.0, till hela flaskan HCV MMX, v2.0. Sätt tillbaka korken på röret och blanda väl genom att vända röret 10 15 gånger. Vortexa inte Working Master Mix. Det rosa färgämnet i HCV Mn 2+, v2.0 används för visuell bekräftelse att HCV Mn 2+, v2.0 har lagts till i HCV MMX, v2.0. Kassera återstående HCV Mn 2+, v2.0. Working Master Mix ska förvaras i 2 8 C och användas inom 4 timmar efter beredning. 3. Tillsätt 50 µl Working Master Mix till varje A-rör med hjälp av en repetitionspipett eller en pipett med spets som har aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Stäng inte skydden på A-rören ännu. 4. Placera A-ringarna med Working Master Mix i en återförslutbar plastpåse och förslut påsen ordentligt. Flytta A-ringarna till pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområdet. Förvara A-ringarna med Working Master Mix i 2 8 C i pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområdet tills provoch kontrollextraktionen är klar. Working Master Mix är hållbar i 4 timmar i 2 8 C i A-rör inneslutna i plastpåse. Prov och kontroll Extraktion Obs! Obs! Obs! Utförd i: Pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområdet Om tidigare extraherade prover och kontroller ska amplifieras, ska du först utföra stegen i avsnittet Reagensberedning. Tina bearbetade prover och kontroller i rumstemperatur och fortsätt med Prov- och kontrollextraktion, steg 16. Före användning ska varje flaska HCV LYS, v2.0, undersökas mot en vit bakgrund. Titta efter förekomst av en gul färg eller tecken på läckage. Använd inte en flaska om innehållet verkar gult eller det finns tecken på läckage. Kontakta din Roche-representant för utbyte. Det bildas en fällning i HCV LYS, v2.0, vid förvaring i 2 8 C. Värm i 25 37 C i högst 30 minuter och blanda noga så det utfällda materialet löses upp före användning. 1. Bered 70-procentig etanol. Till 12 tester blandas 11,0 ml 95-procentig etanol och 4,0 ml avjoniserat eller destillerat vatten. 2. Märk ett 1,5 ml rör med skruvkork till varje patientprov och märk ytterligare två rör med HCV( )C och HCV(+)C. 3. Bered Working Lysis Reagent. Vortexa HCV IC, v2.0 i 5 10 sekunder före användning. Till varje grupp om 12 prover och kontroller tillsätts 100 µl HCV IC, v2.0, till en flaska HCV LYS, v2.0. Blanda väl. Det är inte nödvändigt att mäta volymen HCV LYS, v2.0. 16/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Obs! Obs! HCV IC, v2.0, måste tillsättas till HCV LYS, v2.0, även om HCVinternkontrollen inte detekteras. Kassera återstående HCV IC, v2.0. Working Lysis Reagent är hållbart i 8 timmar i rumstemperatur. Om frusna prover används, tinas proverna i rumstemperatur och vortexas i 3 5 sekunder. Snurra provröret något så att provet samlas i botten av röret. Var noga med att inte förorena handskarna vid hantering av prover. 4. Tillsätt 400 µl Working Lysis Reagent till vart och ett av de märkta rören och sätt på kork. 5. Bered kontroller på följande sätt: - Vortexa NHP, HCV ( ) C, v2.0, och HCV (+) C, v2.0 i minst 5 10 sekunder. - Tillsätt 200 µl NHP i vart och ett av de två kontrollrören. Sätt kork på rören och vortexa i minst 3 5 sekunder. - Tillsätt 20 µl HCV ( ) C, v2.0 i det rör som är märkt HCV ( ) C och som innehåller Working Lysis Reagent och NHP. Sätt kork på röret och vortexa i minst 3-5 sekunder. - Tillsätt 20 µl HCV (+) C, v2.0 till det rör som är märkt HCV (+) C och som innehåller Working Lysis Reagent och NHP. Sätt kork på röret och vortexa i minst 3 5 sekunder. 6. Tillsätt 200 µl av varje patientprov till det märkta rör som innehåller Working Lysis Reagent. Sätt kork på rören och vortexa i minst 3 5 sekunder. 7. Inkubera provet och kontrollrören i ett värmeblock i 10 minuter i 60 C ± 2 C. Vortexa i minst 10 sekunder. 8. Ta bort korkarna från rören och tillsätt 600 µl hundraprocentig isopropylalkohol (rumstempererad) i varje rör. Sätt kork på rören och vortexa i minst 3 5 sekunder. Inkubera alla rör i 2 minuter i rumstemperatur. 9. Gör ett riktningsmärke på varje rör och placera rören i mikrocentrifugen med riktningsmärkena vända utåt så att pelleten kommer att stämma överens med riktningsmärkena. Centrifugera prover och kontroller på högsta hastighet (12 500 16 000 x g) i 15 minuter i rumstemperatur. 10. Använd en ny engångstransferpipett med fin spets för varje rör och avlägsna försiktigt supernatanten från varje rör och kassera den. Var noga med att inte rubba pelleten (som eventuellt inte syns). Ta bort så mycket vätska som möjligt utan att röra pelleten. Sug upp supernatanten långsamt och låt vätskan rinna av helt från rörets sidor. Använd inte vakuumaspiration. 11. Tillsätt 1,0 ml 70-procentig etanol (rumstempererad) i varje rör, återförslut och vortexa i 3 5 sekunder. 12. Placera rören i en mikrocentrifug med riktningsmärkena vända utåt och centrifugera rören i 5 minuter på högsta hastighet (12 500 16 000 x g) i rumstemperatur. 13. Använd en ny engångstransferpipett med fin spets för varje rör och ta försiktigt bort supernatanten utan att röra pelleten. Pelleten ska vara klart synlig i detta steg. Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 17/42

14. Sätt tillbaka korkarna på rören och centrifugera på högsta hastighet i minst 3 5 sekunder. Ta försiktigt bort supernatanten utan att röra pelleten med hjälp av pipett (200 µl kapacitet) utrustad med en ny spets för varje rör. Pelleten ska vara klart synlig i detta steg. Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. Etanolrester kan hämma amplifieringen. 15. Tillsätt 200 µl HCV DIL, v2.0 i varje rör. Bryt isär så mycket av pelleten som möjligt med en pipett (200 µl) utrustad med en spets med aerosolbarriär. Sätt tillbaka korken på rören. Vortexa kraftigt i 10 sekunder. Visst olösligt material kan finnas kvar. Amplifiera de bearbetade proverna och kontrollerna inom tre timmar efter beredning eller förvara fryst i 70 C eller kallare i upp till en månad med högst två frysningar/tiningar. Fler än två frysnings-/tiningscykler kan göra att HCV eller HCV-interkontrollen går förlorad. Obs! Om bearbetade prover och kontroller har förvarats frusna före amplifiering ska de tinas i rumstemperatur och vortexas i 5 sekunder. Fortsätt därefter med steg 16. 16. Tillsätt 50 µl av varje bearbetat prov och varje bearbetad kontroll till respektive A-rör med Working Master Mix med hjälp av en mikropipett med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Använd en ny spets för varje prov och kontroll. Var noga med att inte överföra eventuellt utfällt material som inte återgått till lösning. Sätt lock på A-rören. 17. Anteckna positionerna för kontroller och prover i A-ringarna. Amplifieringen ska startas inom 45 minuter efter att de behandlade proverna och kontrollerna tillsatts till A-rören med Working Master Mix. Flytta de behandlade proverna och kontrollerna i A-ringarna till amplifierings-/detektionsområdet. Återstoden av de behandlade proverna kan frysas i 70 C eller kallare i upp till en månad. Bearbetade prover kan frysas och tinas högst två gånger. Mer än två tiningar kan göra att HCV RNA går förlorad. Reverse transcription, Amplifiering och detektion Utförd i: Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde Utför dagligt underhåll av instrumentet, inklusive: - Torka av initieringsposten med en fuktad luddfri duk och torka torrt - Torka av D-koppaens hanteringsspets med en fuktad luddfri duk och torka torrt - Kontrollera tvättbuffertbehållaren och fyll på om det behövs - Bered Working Wash Buffer (1X) så här. Undersök WB och värm vid behov i 30 37 C så att eventuell fällning löses upp. Tillsätt 1 volym WB till 9 volymer destillerat eller avjoniserat vatten. Blanda väl. Se till att det alltid finns 3 4 liter tvättbuffert (1X) i systemets tvättbuffertbehållare. - Töm avfallsbehållaren - Utför prime på systemet - Kontrollera sprutor och slangar under priming - Kontrollera överföringsspetsen under priming 18/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Före varje körning - Kontrollera avfallsbehållaren och töm den om det behövs - Kontrollera tvättbuffertbehållaren och fyll på om det behövs - Byt ut använda D-koppsrack - Utför prime på systemet Laddning och systemdrift av analysinstrumentet COBAS AMPLICOR 1. Undersök reagensmängderna i analysinstrumentet COBAS AMPLICOR. Förbered tillräckligt många reagenskassetter för arbetsbelastningen. 2. Blanda CX PS1, v2.0 väl genom att vortexa. Tillsätt 2,5 ml CX PS1, v2.0, ien CX4, v2.0,-kassett. Placera kassetten på det testspecifika reagensracket. Kassera den använda flaskan CX PS1, v2.0. Notera datum för reagensberedning på CX4, v2.0-kassetten. 3. Om HCV-internkontrollen detekteras, blanda IC PS1 väl genom att vortexa. Tillsätt 2,5 ml IC PS1 i en IC4-kassett. Placera kassetten på det testspecifika reagensracket. Kassera den använda IC PS1-flaskan. Notera beredningsdatum på IC4-kassetten. 4. Bered Working Substrate genom att pipettera 5 ml SB i en SB3-kassett. Blanda genom att pipettera upp och ned. Kassera den använda SB-flaskan. Notera beredningsdatum på SB3-kassetten. 5. Placera Working Substrate i racken för generiskt reagens. 6. Placera DN4- och CN4-kassetter i racket för generiskt reagens. Notera datum på kassetten när varje kassett öppnades. 7. Identifiera reagensrack som generiska eller testspecifika med hjälp av tangentbordet, streckkodsläsaren eller genom att använda programmet AMPLILINK. 8. Konfigurera reagensracken genom att mata in reagenspositioner och lotnummer i COBAS AMPLICOR Analyzer med hjälp av tangentbordet, streckkodsläsaren eller genom att använda programmet AMPLILINK. 9. Ladda reagensracken i COBAS AMPLICOR Analyzer med hjälp av tangentbordet, streckkodsläsaren eller genom att använda programmet AMPLILINK. Kontrollera att alla reagenskassetter befinner sig i tilldelad position och sitter ordentligt i racken. 10. Placera racket för D-koppar på D-koppsplattformen. Det behövs en D-koppar för varje detektionsreaktion och två D-koppar för varje kassett med Working Substrate för att COBAS AMPLICOR Analyzer ska kunna köra blankprov. 11. Placera A-ringarna i termocykelsegmenten på COBAS AMPLICOR Analyzer. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 19/42

12. Ladda A-ringarna i COBAS AMPLICOR Analyzer med hjälp av tangentbordet, streckkodsläsaren eller genom att använda programmet AMPLILINK. 13. Skapa en A-ringsarbetslista. 14. Stäng locket ordentligt till termocykelsegmenten. 15. Starta COBAS AMPLICOR Analyzer. 16. Vänta tills COBAS AMPLICOR Analyzer visar att laddningskontrollen har godkänts. Obs! Med COBAS AMPLICOR Analyzer kan 6 separata detektioner utföras på innehållet i varje A-rör. COBAS AMPLICOR Analyzer beräknar den mängd som behövs av varje detektionsreagens och utför en laddningskontroll vid varje start av en körning för att fastställa om det finns tillräcklig mängd reagens för de beställda testerna. 17. Reverse transcription, amplifiering och detektion utförs automatiskt av COBAS AMPLICOR Analyzer. Resultaten uttrycks som absorbansvärde vid 660 nm och som Positiva, negativa eller tvetydiga. 20/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0

Hepatitis C Virus Resultat Tolkning av resultat Med detektion av internkontroll 1. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att körningen är giltig. Om körningen är ogiltig måste du upprepa hela körningen (extraktion, amplifiering och detektion). 2. Om körningen är giltig tolkas provresultaten på följande sätt: HCV A 660 Resultat HCV IC A 660 Resultat A 660 COBAS -flagga A 660 COBAS -flagga Betydelse < 0,15 NEGATIVE 0,15 POSITIVE HCV RNA inte detekterat. Ett negativt resultat utesluter inte förekomst av HCVinfektion eftersom resultaten är beroende av tillräcklig provtagning, frånvaro av hämmare, och tillräckligt med RNA för att kunna detekteras. < 0,15 NEGATIVE < 0,15 NEGATIVE Hämmare. HCV RNA, om förekommande, är inte detekterbart. Bearbeta en ny portion av det ursprungliga provet och upprepa testet. Hämmare är ofta labila, och prover som initialt är hämmade är kanske inte hämmat när de upprepas. Om det ursprungliga provet inte finns tillgängligt måste ett nytt prov tas. 1,0 POSITIVE NÅGOT NÅGOT HCV RNA detekterat. Provet är positivt för förekomst av HCV. 0,15, < 1,0 GZ 0.15 0.99 NÅGOT NÅGOT Tvetydigt. Resultaten är osäkra med avseende HCV RNA. Upprepa hela testproceduren två gånger. Använd en ny portion av patientsprovet. Prover där ett eller båda resultaten vid de två omtesterna är 0,15 A 660 ska betraktas som positiva för HCV RNA. Prover där båda resultaten vid de två omtesterna är < 0,15 A 660 antas vara negativa för HCV RNA, förutsatt att internkontrollresultaten för båda replikaten är 0,15 A 660. 7/2008, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 21/42

Utan detektion av internkontroll 1. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att körningen är giltig. Om körningen är ogiltig måste du upprepa hela körningen (extraktion, amplifiering och detektion). 2. Om körningen är giltig tolkas provresultaten på följande sätt: HCV-resultat A 660 COBAS -flagga Betydelse < 0,15 NEGATIVE HCV RNA inte detekterat. Ett negativt resultat utesluter inte förekomst av HCV-infektion eftersom resultaten är beroende av tillräcklig provtagning, frånvaro av hämmare, och att det finns tillräckligt med RNA om infektionen ska kunna detekteras. 1,0 POSITIVE HCV RNA detekterat. Provet är positivt för förekomst av HCV. 0,15, < 1,0 GZ 0.15 0.99 Tvetydigt. Resultaten är osäkra med avseende HCV RNA. Upprepa hela testproceduren två gånger. Använd en ny portion av patientprovet. Prover där ett eller båda resultaten vid de två omtesterna 0,15 A 660 ska betraktas som positiva för HCV RNA. Prover där båda resultaten vid de två omtesterna är < 0,15 A 660 antas vara negativa för HCV RNA. Kvalitetskontroll Minst ett replikat vardera av AMPLICOR HCV ( )-kontroll och AMPLICOR HCV (+)-kontroll måste ingå i varje testomgång. Liksom för alla nya laboratorieförfaranden bör nya användare överväga att använda ytterligare kontroller varje gång testet utförs tills man har fått tillräcklig erfarenhet av testet. Dessutom måste internkontrollen tillsättas i varje prov under extraktion. Slutlig detektion på COBAS AMPLICOR Analyzer är ett användaralternativ. Kontrollerna kan placeras i valfri position i A-ringarna. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att körningen är giltig. Ytterligare kontroller kan testas enligt anvisningarna eller kraven i lokala, regionala och/eller nationella föreskrifter eller enligt ackrediteringsorganisationernas riktlinjer. Negativ kontroll Positiv kontroll Analysresultatet för AMPLICOR HCV ( )-kontroll ska vara mindre än 0,1 vid A 660 enheter. Om absorbansen för AMPLICOR HCV ( )-kontroll är större än eller lika med 0,1 A 660, är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (provoch kontrollextraktion, reverse transcription, amplifiering och detektion). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om absorbansvärdet för AMPLICOR HCV ( )-kontroll konsekvent är större än 0,1 A 660. Analysresultatet för AMPLICOR HCV (+)-kontroll ska vara större än eller lika med 1,0 vid A 660. Om absorbansen för AMPLICOR HCV (+)-kontroll är mindre än 1,0 A 660, är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, reverse transcription, amplifiering och detektion). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om absorbansen för AMPLICOR HCV (+)-kontroll konsekvent är mindre än 1,0. 22/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/2008, Revision 8.0